مقالة منهجية

التصوير الفيديو وخرائط الزمانية المكانية لتحليل الجهاز الهضمي على الحركة في الفئران

14.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53828

⸱

فبراير 3, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, The University of Melbourne, 2Melbourne School of Engineering, The University of Melbourne, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة تقنية تصوير الفيديو ورسم الخرائط الزمانية المكانية عالية الدقة لتحديد التغيرات في التنظيم العصبي لحركة القولون في الفئران البالغة. يمكن اكتشاف التأثيرات الدقيقة على وظيفة الجهاز الهضمي (GI) باستخدام هذا النهج في مستحضرات الأنسجة المعزولة لتعزيز فهمنا لمرض الجهاز الهضمي.

الملخص

الجهاز العصبي المعوي (ENS) يلعب دورا هاما في تنظيم الجهاز الهضمي (GI) الحركة ويمكن أن تعمل بشكل مستقل عن الجهاز العصبي المركزي. تغييرات في وظائف ENS هي سبب رئيسي من الأعراض المعدية المعوية والأمراض، ويمكن أن تسهم في الأعراض المعدية المعوية التي أعلن عنها في الاضطرابات العصبية والنفسية بما في ذلك مرض التوحد. ومن الثابت أن قطاعات القولون معزولة تولد عفوية، الانقباضات الإيقاعية المعروفة باسم القولون ترحيل موتور مجمعات (CMMCs). إجراء لتحليل التنظيم العصبي المعوي من CMMCs في خارج الحي الاستعدادات القولون الماوس يوصف. يتم تشريح القولون من الحيوان ومسح لإزالة محتوى البراز قبل أن يتم مقنى في حمام الجهاز. يتم الحصول على البيانات عن طريق كاميرا فيديو وضعه فوق حمام الجهاز وتحويلها إلى عالية الدقة خرائط الزمانية المكانية عن طريق مجموعة من البرامج في المنزل. باستخدام هذه التقنية، وأنماط مقلص الأساسية والتأثيرات الدوائية على وظيفة ENS في القولون الصورةegments يمكن مقارنة مدى 3-4 ساعة. وبالإضافة إلى ذلك، طول انتشار وسرعة CMMCs يمكن تسجيلها وكذلك التغيرات في قطر الأمعاء وتيرة الانكماش. هذه التقنية مفيدة لتمييز أنماط حركية الجهاز الهضمي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا (وفي الأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية). وبهذه الطريقة، يتم تسجيل التغيرات التي يسببها دواء في CMMCs في الفئران نوع البرية وفي R451C نموذج الفأر Neuroligin 3 من التوحد. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على مناطق أخرى من الجهاز الهضمي بما في ذلك العفج، الصائم واللفائفي وفي سن تنموية مختلفة في الفئران.

المقدمة

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هي شبكة الخلايا العصبية الذاتية في الجهاز الهضمي وينظم وظائف مختلفة مثل هضم محتوى الأمعاء، وامتصاص المواد الغذائية وإفراز واستيعاب السائل. تقع الخلايا العصبية في ENS في عضلي معوي وتحت المخاطية الضفائر. الضفيرة العضلية المعوية تلعب دورا رئيسيا في تنظيم حركية الجهاز الهضمي 1 في حين الضفيرة تحت المخاطية هي المعنية في المقام الأول في السيطرة على إفراز 2،3. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين طبقات العضلات الطولية والدائرية للجدار المعدة والأمعاء. النشاط مقلص من طبقات العضلات الملساء في جدار الأمعاء ويسهل المهام الرئيسية في الجهاز الهضمي عن طريق خلط ودفع محتويات الأمعاء على طول الأمعاء 3. على الرغم من أن أعصاب خارجي إلى الجهاز الهضمي من الجهاز العصبي المركزي يساهم في وظيفة الجهاز الهضمي في الجسم الحيوENS قادر على تنظيم وظيفة الجهاز الهضمي بشكل مستقل. هذه الخاصية الفريدة تتيح التحقيق وظيفية للدوائر العصبية المعوية ومساهمتها في حركية الجهاز الهضمي خارج الحي.

القولون المجمعات السيارات المهاجرة (CMMCs) هي عفوية، والأحداث العصبية التي هي نمط المحرك السائد لوحظت في القولون الماوس معزولة في غياب الكريات البرازية 4-9. وتعرف CMMCs كما الانقباضات الإيقاعية التي تنتشر على طول المسافة الأفقية التي هي على الأقل نصف ويبلغ طول القولون (أي من الأعور إلى المستقيم) 10. وبعد أن يثبت وجود علاقة بين CMMCs وأنماط مقلص التي تدفع الكريات البراز بشكل واضح، وقد تم الإبلاغ عن ولكن بعض الاختلافات الدوائية 11. ومع ذلك، فإن قدرة ENS على العمل بشكل مستقل عن الجهاز العصبي المركزي ووجود أنماط محرك بوساطة العصبية في غيريوفر القولون olated نظام الفحص المثالي لدراسة اضطرابات في الحركة الناتجة عن خلل وظيفي ENS الأساسي. العفوية من أنماط محرك الجهاز الهضمي تسمح تغييرات وظيفية في الاستجابة للمؤثرات الدوائية التي يتم تقييمها.

وتم تطوير استخدام التصوير الفيديو والخرائط الزمانية المكانية الأولى التي تفحص كميا التمعج الأمعاء الصغيرة في خنازير غينيا (12). هنا، يتم وصف أسلوب خارج الحي الذي يتيح دراسة الماوس أنماط حركية القولون باستخدام التصوير الفيديو وتحليل هذه التسجيلات لبناء عالية الدقة (~ 100 ميكرون، 33 ميللي ثانية) خرائط قطر القولون بوصفها وظيفة من موقف على طول القولون ومن الزمن (خرائط الزمانية المكانية). استخدام البرمجيات في المنزل الكشف عن الحافة (Analyse2، حسب الطلب)، تتم معالجة البيانات من كامل طول شرائح القولون التعاقد في الوقت الحقيقي لتوليد خرائط الزمانية المكانية لكل تجربة. في هذه الخطوة، وملفات الفيديو (AVI) هي الخلاصهrized بين وتحويلها إلى خرائط الزمانية المكانية باستخدام Analyse2. خرائط الزمانية المكانية (الشكل 2) تصور انقباض مع مرور الوقت وتمكن من قياس المعلمات متعددة بما في ذلك سرعة انتشار وحجمها وطولها ومدتها. وسجلت قطر الأمعاء أيضا طوال مدة التجربة كمقياس للانقباض العام للقطاع النسيج. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لتحديد الاختلافات في وجهة الشروع في المجمعات مقلص التي يمكن أن تشير إلى تغير الاتصال العصبي المعوي.

وتم الإبلاغ عن بروتوكول التصوير الفيديو مماثلة تهدف إلى تقييم بيليه الدفع في خنازير غينيا 13 ولكن نحن هنا الخطوط العريضة لتطبيق نهج التصوير الفيديو لتقدير حجم الحركة القولون عفوية (أي في غياب الكريات). ونحن نقدم أيضا معلومات مفصلة للمساعدة في تشريح وإعداد أنسجة الجهاز الهضمي للنهج التصوير الفيديو. هذاوينص البروتوكول الباحثين بأداة الوصول إليها وتكرارها بسهولة لتحليل التحكم العصبي المعوي وظيفة الجهاز الهضمي في النماذج الحيوانية من الأمراض بما في ذلك نماذج الماوس الوراثية.

تقنية التصوير الفيديو تتيح تحليل حركية القولون في استجابة لمختلف وكلاء الدوائية. العقاقير يمكن أن تدار عن طريق تجويف الأمعاء أو الحمام هيئة خارجية لإعداد القولون. مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي الماوس المعرض أنماط حركية محددة مثل تجزئة وCMMCs الأمعاء الصغيرة في القولون.

وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد الاختلافات السلالة في وظيفة الأمعاء الصغيرة؛ وقد لوحظت حساسية التفاضلية ل5-HT 3 و 5-HT 4 الخصوم في الصائم من BALB / ج و C57 / BL6 الفئران نظرا لطبيعة متعددة الأشكال من الجين tph2 أعرب في اثنين من سلالات 6. تأثير تثبيط 5-HT على الحركة لا يزال يخدعموضع خلاف، كما تم الإبلاغ عن بيانات متضاربة حول أهمية الذاتية 5-HT على التمعج القولون وCMMCs 14،15. ويمكن أيضا إجراء تعديلات في مرحلة ما قبل الحركة وبعد الولادة خلال تطوير 7، وآثار الطفرات الجينية على حركية الجهاز الهضمي في النماذج الحيوانية للمرض 10 أن تدرس من خلال الاستفادة من التصوير الفيديو. نحن هنا توضيح استخدام طريقة لدراسة حركية القولون في نموذج الفأر NL3 R451C من مرض التوحد، الذي يعبر عن طفرة مغلطة في الجين Nlgn3 ترميز البروتين التصاق متشابك Neuroligin-3 16. وقد حددت هذه الطفرة الأولى في المرضى الذين شخصت مع اضطراب التوحد الطيف (ASD) 17، والذي يرتبط بقوة مع ضعف الجهاز الهضمي 18-22. ونحن التحقيق ما إذا كانت الطفرة متشابك NL3 R451C تؤثر مخرجات العصبية في ENS باستخدام تقنية التصوير الفيديو. نقدم البيانات التي تميز CMMCs في الأساس وردا على 5H هرمون السيروتونينتي 3/4 مستقبلات تروبيسترون في نموذج الفأر NL3 R451C من مرض التوحد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

التعامل مع الحيوانات وخلع عنق الرحم للحيوانات قبل كل التجارب أجريت بدقة وفقا لبروتوكولات وافقت عليها اللجنة تجارب على الحيوانات لجامعة ملبورن (ID الأخلاق: 1212494.7)

1. نسيج جمع وتشريح

  1. الموت ببطء الفئران الكبار خلع عنق الرحم. إذا كان ذلك ممكنا تجنب التخدير لمنع التأثيرات على وظيفة الأمعاء عن طريق المستقبلات الموجودة على السكان العصبية من الفائدة.
  2. تسجيل اجمالي وزن جسم الحيوان، دبوس الجسم (عبر الكفوف الأربعة، يتعرض الجانب البطني إلى مجرب) بحزم إلى لوحة تشريح باستخدام إبر الحقن (الحجم: 20 G).
  3. عن طريق تشريح ملقط ومقص. إجراء شق طريق البشرة تتراكب طبقات أقل عضلات البطن. الاستمرار في استخدام ملقط ومقص لفتح تجويف البطن على طول خط الوسط من البطن إلى القص.
  4. لمنع التجفيف الأنسجة، صب physiالمالحة ological (حل كريبس: 118 كلوريد الصوديوم، 4.6 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgSO 4، 1 ناه ​​2 ص 4، 25 NaHCO 3، 11 مد الجلوكوز في ملي - فقاعات في RT بالغاز كربوجين، 95٪ O 2 و 5 ٪ CO 2 مدة لا تقل عن 20 دقيقة) على محتويات البطن على فترات منتظمة (أي كل 30-60 ثانية) أثناء عملية التشريح.
  5. لعزل القولون في حين تعلق على الأعور والمستقيم، وعقد الأعور (يقع بالقرب من نهاية القريبة من القولون) بلطف باستخدام ملقط تشريح ما يقرب من 4-5 سم فوق جسم الحيوان في حين خفضت مساريق باستخدام مقص تشريح غرامة.
  6. والحرص على عدم التعامل معها، تمدد أو قطع الأنسجة في الجهاز الهضمي أثناء إزالة مساريق المجاورة.
  7. إزالة الأنسجة الزائدة (أي والمثانة البولية والخصيتين). باستخدام مقص تشريح الخشنة، وجعل اثنين من الشقوق العمودية (أي حوالي 0.5 سم من خط الوسط) لقطع عظم الحوض على عصامالجانب CH رأي القولون.
  8. استخدام مقص غرامة للفصل بين المستقيم من المجاورة أنسجة الحوض وتقليم العضلات المحيطة من القولون.
  9. وضع القولون كامل طول (من الأعور إلى المستقيم) في دورق يحتوي على محلول فسيولوجي (المؤكسج سابقا مع كربوجين) والاستمرار في الأوكسجين في RT. إزالة الأعور والمستقيم باستخدام مقص تشريح غرامة واستبدال في الكأس.
  10. الكريات البرازية فارغة / محتوى الأمعاء من الاستعدادات القولون عن طريق تطبيق الضغط الايجابي لطيف في نهاية الفم باستخدام حقنة 5 مل تعلق على ماصة 200 ميكرولتر مليئة المالحة الفسيولوجية. من أجل توجيه الأنسجة في المستقبل، استخدام دبوس الحشرات بمناسبة انتهاء معظم القريبة من القولون، حيث التصدعات في الغشاء المخاطي مرئية.
    1. تعديل ماصة بلاستيكية لتتناسب مع حقنة 5 مل عن طريق إزالة حوالي 1 سم من أوسع نهاية / القريبة باستخدام شفرة حلاقة. لزيادة معدل التدفق، وتوسيع القاصي نهاية / أصغر عن طريق قطع على آنججنيها مصريا (حوالي 45 درجة مئوية) باستخدام شفرة حلاقة.
  11. قبضة أنسجة القولون بلطف في نهاية القريبة مع ملقط تشريح، إدراج غيض ماصة في تجويف القولون والمالحة الفسيولوجية تدفق من خلال التجويف.

2. إعداد القولون الأنسجة والتجريبية التي أنشئت من أجل التصوير الفيديو

  1. المالحة الفسيولوجية تدفق من خلال جميع أنابيب موصولة إلى حمام اثنين تشامبيريد الجهاز انشاء (الشكل 1) والشكل (3)، وذلك باستخدام حقنة تعلق على 200 ميكرولتر ماصة. هذه الخطوة يزيل أي حطام داخل الأنابيب التي يمكن منع تدفق الحل. لأنابيب المواصفات تشير إلى جدول المواد.
  2. تأكد من أن غرف الحمام الجهاز وsuperfused مستمر مع محلول فسيولوجي فقاعات مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2، بمعدل 5 مل دقيقة -1 التدفق). باستخدام مسبار درجة الحرارة على فترات منتظمة، وضمان أن temperatيتم الاحتفاظ لدى عودتهم من الحمام ما بين 33 درجة مئوية -37 درجة مئوية.
  3. ملء خزان تدفق متصلة عبر 3-الطريقة محبس إلى أنبوب مدخل مع ما يقرب من 20-30 المالحة الفسيولوجية مل باستخدام حقنة 50 مل.
  4. خلال التجربة، والحفاظ على الضغط في خزان تدفق باستخدام arubber سدادة مع أنبوب زجاجي (5 ملم داخل القطر) عبارة عن طريق وسطها. تأكد من أن افتتاح العلوي من الخزان تدفق غير مختومة بشكل آمن (مع أنبوب زجاجي الداخلية المتبقية تفض).
  5. وضع القولون (طول 5-7 سم) في غرفة حمام الجهاز، والتأكد من أنها غارقة تماما في المياه المالحة الفسيولوجية.
  6. يقني؛ يدخل القنية نهاية كل جزء القولون لهما المغمورة أنابيب مدخل / مخرج (مدخل / أنابيب مخرج القطر المختلفة يمكن أن تتغير وفقا لحجم التجويف الأنسجة على سبيل المثال. الأنسجة بعد الولادة، الفئران الكبار وخنزير غينيا) في الحمام باستخدام معيار القطن خيوط الخياطة. نعلق نهاية القريبة من القولون في أنبوب مدخل والنهاية البعيدة من القولون إلى أنبوب مخرج (متصلة عبر 3-الطريقة محبس إلى أنبوب تدفق العمودي، 6 سم في الطول). تأكد من أن الأنسجة ليست فوق طاقتها أو خففت جدا بعد القسطرة لتفادي أي تشويش مع القياسات والتحليل في المستقبل.
  7. تسجيل طول القولون عن طريق قياس المسافة بين الداني والقاصي cannulations باستخدام مسطرة 15 سم. وهذا أمر مهم لتفسير التغيرات في طول الانكماش، سرعة انتشار ونقاط انكماش بدء.
  8. ضمان ثبات ضغط اللمعية الأساسي (سم H 2 O) التي أنشئت قبل البدء في التجربة. حساب الضغط اللمعية عن طريق قياس المسافة العمودية من الأنسجة إلى الغضروف المفصلي من المياه المالحة الفسيولوجية داخل أنبوب زجاجي من خزان تدفق (عن طريق الفم) وأنبوب تدفق العمودي (الشرج).
  9. الحفاظ على الاستعدادات الأنسجة في الضغط داخل اللمعة ثابت (على سبيل المثال، 1-2 سم H 2 O) عن طريق ضمان أن لض تدفق سدادة ختمإعادة يتم الاحتفاظ ثابت وأنه لا يوجد انسداد موجودة في مجموعة لأعلى.
  10. ترك القولون لكي تتوازن في المياه المالحة الفسيولوجية لمدة 30 دقيقة قبل ان يسجل حركات الأمعاء. تحقق من وجود أي انسداد الناشئة في في- أو تدفق الأنابيب وإزالتها عن طريق الضغط من خلال الخزان تدفق أو من خلال إعادة cannulating في غايات عن طريق الفم والشرج من القولون.

3. التقاط صورة والبروتوكول التجريبي

  1. الحركات المعوية قياسية من ملفات الفيديو باستخدام كاميرا الفيديو (30 لقطة / ثانية، 640 × 840 بكسل) المتمركزة 10-15 سم فوق حمام الجهاز على معوجة مختبر القياسية تقف (الشكل 1).
  2. فتح لقب الظاهري (فيديو القبض على البرمجيات) من أيقونة على سطح المكتب. من علامة التبويب "ملف" واختر "التقاط افي" لعرض صورة الكاميرا. على 'الصوت' علامة التبويب إلغاء تحديد "تمكين التقاط الصوت" لتعطيل الصوت.
    1. في علامة التبويب الفيديو اختر 'ضغط' و 'DivX6.9.2. الترميز & #39؛ لضغط ملفات الفيديو إلى تقليل استخدام مساحة التخزين. وسوف تصبح هذه الوظيفة متاحة عند تثبيت البرنامج ضغط "الافلام".
  3. يدويا ضبط موقع الكاميرا بحيث أن الجزء القولون مقنى بأكمله مرئيا (مع المناطق المجاورة مقنى فورا إلى الحواف العمودية من الإطار الفيديو) عبر نافذة التقاط برامج الفيديو (انظر الشكل 1). من أجل تحسين جودة الصورة وتقليل الانعكاسات، ونعلق درعا ورقة / الورق المقوى لدعم الكاميرا لمنع ضوء دخيلة على حمام الجهاز. تحسين جودة الفيديو عن طريق ضبط إعدادات السطوع والتباين والتعرض باستخدام واجهة برنامج الكاميرا.
    1. قبل التسجيل، وتعيين اسم ملف معين. في علامة التبويب "ملف" وحدد "تعيين ملف الالتقاط" وتحديد اسم فريد للفيديو.
    2. بدء التقاط الفيديو عن طريق الضغط على "ملف لقطة 'من' لقطة 'شريط الأدوات. لوقف recordinز اختيار "وقف القبض على 'زر أو مفتاح' خروج 'على لوحة المفاتيح.
  4. استبدال محلول فسيولوجي الواردة في الخزان تدفق مع المياه المالحة الفسيولوجية جديدة كل 30 دقيقة.
    1. ضغط سجل اللمعية (انظر 2.9) واستخدام التحقيق في درجة الحرارة، وتأخذ علما درجة حرارة الحمام الجهاز. كرر هذه الخطوات في كافة مراحل التجربة (أي كل 30 دقيقة) للتأكد من أن هذه المتغيرات ثابتة.
  5. النشاط القولون قياسيا في المجموع لمدة 3 ساعة (بما في ذلك تطبيق المخدرات وتبييض مدة). لأغراض تخزين البيانات، وتسجيل البيانات في شرائح الفيديو 15 دقيقة. وعادة ما تتكون تجربة كاملة من تسجيلات الفيديو 12 × 15 دقيقة.
    1. سجل النشاط لمدة 1 ساعة تحت ظروف التحكم (المالحة الفسيولوجية).
    2. تطبيق المخدرات (إما superfused في الحمام أو تدار في التجويف عن طريق خزان تدفق) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
      ملاحظة: طرق مختلفة للإدارة يمكن أن ذدرع تأثيرات مختلفة 23.
    3. تطبيق محلول فسيولوجي جديدة للحمام أو التجويف خلال فترة تبييض 1 ساعة.

تجهيز 4. البيانات وتوليد خرائط الزمانية المكانية

  1. العملية كل تسجيل الفيديو حاليا باستخدام البرمجيات في المنزل مكتوب في MATLAB (R2012a، الإصدار 7.4، حسب الطلب) من أجل توليد خرائط الزمانية المكانية توضح حركية القولون.
    1. برامج التحليل فتح من أيقونة على سطح المكتب.
    2. في إطار الأوامر، أدخل "Analyse2" من أجل فتح لوحة التحكم التحليل.
  2. الاستفادة من وظيفة الكشف عن الحافة لتوليد خرائط الزمانية المكانية بالنقر على "الكشف عن الحافة لملفات .avi" في إطار لوحة التحكم. وهذه وظيفة تمكين برامج التحليل لقراءة ملفات الفيديو مشفر في شكل صوت فيديو معشق (AVI).
  3. تنفيذ الخطوات التالية بالتتابع لتوليد خرائط الزمانية المكانية باستخدام آداptive حافة خوارزمية الكشف.
    1. فتح ملفات الفيديو المسجلة عن طريق اختيار "إضافة ملفات" التبويب، حدد "فتح مقطع الفيديو" وحدد موقع ملفات الفيديو.
    2. من ملفات الفيديو المدرجة ضمن برامج التحليل، حدد الملف من الفائدة.
    3. حدد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام في إطار الفيديو، على سبيل المثال، على طول القولون، من النقطة التي مقنى القولون عن طريق الفم لإقناء؛ إدخال القنية الشرج. تأكد من أن نقاط إقناء؛ إدخال القنية القريبة والبعيدة والمتاخمة للحدود عمودية من منطقة الفائدة. سوف خطوط الكشف عن الحافة (الأحمر والأخضر) تلقائيا يظهر فرضه على الصورة في الوقت الحقيقي.
    4. تأكد من أن خطوط عتبة الكشف عن الحافة هي المجاورة على الفور إلى القولون على كل من الحدود العليا والدنيا للأنسجة القولون (وهذا يمكن أن يكون الأمثل لكل الفيديو عن طريق تغيير القيم عتبة الكشف على لوحة التحكم). تأكد من أن حافة كشف لإيناس مستمرة على طول الصورة القولون عن طريق ضبط التباين والسطوع باستخدام لوحة التحكم.
    5. أدخل كامل طول القولون (مم) في مربع الحوار العرض (كما هو مسجل في الخطوة 2.7). ثم حدد "إنشاء خريطة الحرارة".
    6. في النافذة المنبثقة، حدد موقعا لملف ليتم حفظها وتحديد اسم ملف لخريطة الزمانية المكانية.
    7. حدد تنسيق ".su2 'وحدد" إضافة إلى قائمة الانتظار ".
      ملاحظة: تنسيق .su2 يضغط البيانات يمكن إضافة حجم ملف أصغر وملفات الفيديو متعددة إلى قائمة الانتظار.
    8. اختر "ابدأ الكشف على توليد خرائط الزمانية المكانية.

5. تحليل خرائط الزمانية المكانية

  1. استخدام خرائط الزمانية المكانية لتقدير المعلمات مثل التردد، وسرعة انتشار وطول ومدة CMMCs، قطر القناة الهضمية ونقطة البدء واتجاه الانكماش.
    1. لبدء تحليل الزمانية المكانيةخرائط، نوع 'analyse2 "في إطار الأوامر كما هو موضح في المقطع السابق. بدلا من "الكشف عن الحافة"، حدد زر "هيت تحليل الخريطة".
    2. فتح خريطة الملفات الزمانية المكانية (ملفات .su2) عن طريق اختيار علامة التبويب "إضافة ملفات" وتحديد موقع الملفات التي تم الحصول عليها سابقا .su2.
    3. وبمجرد أن خريطة الزمانية المكانية مرئيا على الشاشة، وتحديد نطاق اللون في لوحة التحكم، وضمان أن يتم تعيين الحد الأدنى إلى 1.
      لاحظ أن الحد الأقصى يمكن أن تتراوح 5-10 وفقا لانقباض الأنسجة.
    4. اختر 'قفل نطاق اللون "لضمان أن جميع الخرائط من تجربة واحدة ويتم تحليل في ظل نفس الظروف.
    5. تأكد من أن الإعدادات زمنية ثابتة لجميع الخرائط الزمانية المكانية من تجربة معينة.
  2. من أجل تحديد تردد CMMC يدويا عد تقلصات أن تجتاز أكثر من 50٪ من طول القولون. ويمكن لهذه الانقباضات يكون visualized كما الشرائط الأحمر / البرتقالي (معيار مؤشر اللون HSV) على خريطة الزمانية المكانية (انظر الشكل 2 للحصول على مثال). ويمكن أيضا تقلصات الأخرى التي هي أقصر أو لا نشر تحديدها وكميا.
  3. إذا رغبت في ذلك، وإجراء مزيد من التحليل بدقة أعلى من هذه الخرائط. على سبيل المثال، خصائص مفصلة بما في ذلك سرعة ومدة كل انقباض يمكن فحص.
    1. من أجل قياس سرعة ومدة، حدد زر "علق موجات انكماش" على خريطة الحرارة لوحة التحكم التحليل.
    2. التالي، في التكبير على كل CMMC بالضغط على زر "تكبير" واختيار مجال الاهتمام. ثم حدد زر "تعليم يدويا" لتعليم كل انقباض باستخدام الماوس لرسم خط من الموقف الأكثر الأولي في نهاية كل انقباض. هذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس واضحة في سرعة انتشار ومدة التوسعات التي تظهر لنشر (لمثل رؤيةآل نهاية الخرائط في الشكل 2A، 2B).
      ملاحظة: البيانات للسرعة ومدة تظهر تحت إطار النتائج. ويمكن نقل هذه القيم إلى جدول بيانات من الفائدة عن طريق اختيار علامة التبويب "تصدير البيانات". الشروح غير المرغوب فيها يمكن إزالتها عن طريق النقر على زر "إزالة الشروح مختارة".
  4. إذا رغبت في ذلك، الاستفادة من إحداثيات س وص من الخرائط الزمانية المكانية (الوقت والموقف على طول القولون، على التوالي) لتحديد موقف من بدء تقلصات صغيرة أو CMMCs.
  5. وبالمثل، من أجل تحديد الفترات الفاصلة بين الانقباضات، استخدم وظيفة "علق" لقياس الفترة الزمنية بين الانقباضات. كما سبق، فإن هذه النتائج يمكن تصديرها إلى جدول بيانات عن طريق اختيار علامة التبويب "تصدير البيانات".
  6. من أجل قياس يستريح عرض القناة الهضمية، حدد زر "خذ المقطع العرضي" على خريطة الحرارة لوحة تحليل.
    1. اختر "اضافة9؛ على لوحة المقاطع العرضية الزمنية. انقر مرتين على أي موقع داخل الخريطة لتوليد خط أفقي فرضه على خريطة الحرارة. والآن يتم عرض البيانات قطر الأمعاء في نافذة جديدة.
    2. لقياس قطرها الأمعاء، ضع المؤشر على الذروة والحضيض المجاور للحصول على متوسط ​​عرض القناة الهضمية لحالة تجريبية محددة. التغييرات في قطر الأمعاء ويمكن مقارنة بين ظروف تجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ما يصل الى 90٪ من المرضى الذين يعانون من التوحد واجهت مجموعة من اضطرابات الجهاز الهضمي، بما في ذلك الإسهال والإمساك 18،24،25. ومع ذلك، فإن الأسباب الكامنة وراء هذه القضايا في الجهاز الهضمي غير معروفة. ترتبط العديد من الطفرات التي تم تحديدها في المرضى الذين يعانون من التوحد مع البروتينات متشابك تساهم في التغيرات والاضطرابات في انتقال متشابك أو وظيفة. واحدة من هذه الطفرات في الجين الترميز للخلية التصاق جزيء neuroligin-3 (NL3 R451C)، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باستخدام هذه التقنية التصوير الفيديو، وقد تم قياس CMMC تردد كمؤشر على حركية القولون في نوع البرية والفئران NL3 R451C، نموذج الفأر من اضطراب طيف التوحد (17). نتائجنا تشير إلى انخفاض في عدد CMMCs في الفئران NL3 R451C متحولة مقارنة مع الفئران نوع البرية في وجود 5HT 3/4 مستقبلات تروبيسترون مما يشير إلى أن الفئران NL3 R451C المعرض زيادة الحساسية للتروبيسترون. وفقا لذلك، نقترح أن R451C تحور neuroligin 3 يغير مسار السيروتونين، يحتمل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

ودعمت JCB وELH-Y وزارة الخارجية الأمريكية من برنامج أبحاث التوحد CDMRP الدفاع (AR11034). NHMRC (1047674) لELH-Y.The مايو ستيوارت المنح الدراسية-جامعة ملبورن الثقة بتمويل منحة دراسية لمرض التصلب العصبي المتعدد. نشكر علي طاهر، فاطمة Ramalhosa وجراسيا سيغر لمساهمات فنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > الكواشف < / قوي >
كلوريد الصوديوم (ميجاوات: 58.44)سيجما ألدريتشS7653-250G
KCl (ميغاواط: 74.55)سيجما ألدريتشP9333-500G
NaH 2< / sub>PO 4< / sub>.2H 2< / sub>O (ميغاواط: 156.01)كيميائي471-500G
MgSO4< / sub> .7H20 (ميغاواط: 246.48)إمداد كيميائيMA048
CaCl2.2H2O (ميغاواط: 147.02)إمداد كيميائيCA033
D-Glucose اللامائي (ميغاواط: 180.16)إمداد كيميائيGA018-500G
NaHCO3 < / sub> (MW: 84.01)Chem SupplyGA018-500G
Name<قوي>الشركة رقم الكتالوجComments
Materials
Artisan Chambers
Dimentions: 14 سم × 8 سم × 3 سم		المخصصمباشرة 
  732 متعدد الأغراض مانع التسرب واضحداو كورنينج أستراليا بي تي واي المحدودة1890573
SYLGARD 184 مجموعة المطاط الصناعي السيليكون داو كورنينج أستراليا بي تي واي المحدودة1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L / LOCK STerumo Medical Corporation0912-2006
محاقن مع أطراف قفل لور 50 مل ، 20 مل ، 10 ملTerumo Medical CorporationN / A
1.57 مم (ID) × 3.16 مم (OD) - الأنابيب السيليةMasterflex508-008
1.02 مم (ID) × 2.16 مم (OD) - Silastic TubingMasterflex508-005
1.50 مم (ID) × 2.50 مم (OD) - الأنابيب السيليةMasterflex508-007
1.60 مم (ID) - أنابيب السيليكون المعالجة بالبلاتين   ؛Masterflex96410 - 14
4.40 مم (ID) - أنابيب سيليكون معالجة من البلاتين ماسترفلكس96410 - 15 
3.10 مم (ID) - أنابيب سيليكون معالجة بالبلاتين   ؛ماسترفلكس96410 -16
زجاجة زجاجية مختبرية متدرجة - 500 مل   ؛        ثيرموفيشر العلمية 100-400
سدادة مطاطية كيميائية 57 × 65 مم &NBSP ؛
سدادة مطاطية كيميائية 29 مم × 32 مم
سخان مياه&NBSP; (منظم حراري)   ؛Ratek TH7000 
كاميرا ويب لوجيتكلوجيتك
<قوي>الاسمقوي<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Software
Virtual Dub - 1.9 11virtualdub.org
MATLAB R2012a الرسم البياني
برنامج كاميرا الويب LogitechLogitech
إمداد مختبر الاتصال لوحة

المراجع

  1. Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
  2. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
  3. Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
  4. Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
  5. Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
  6. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
  7. Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
  8. Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
  9. Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
  10. Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
  11. Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
  12. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  13. Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
  14. Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233(2015).
  15. Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
  16. Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
  17. Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
  18. Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
  19. Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
  20. Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224(2012).
  21. McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
  22. Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
  23. Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
  24. Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
  25. Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
  26. Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
  27. Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
  28. Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
  29. Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205(2013).
  30. Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
  31. Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
  32. Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
  33. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597(2011).
  34. Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
  35. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
  36. Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326(2014).
  37. Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neuroligin 3 R451C

مقالات ذات صلة