يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

15.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53833

⸱

مايو 4, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

في هذه المقالة

ملخص

يقيس مقايسة المذنب القلوي فواصل خيوط الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة. عن طريق إضافة Endonuclease III أو خطوة هضم 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase البشرية ، يمكن للمقايسة اكتشاف تلف الحمض النووي المؤكسد بكفاءة. نصف طرق استخدام هذه المقايسات للكشف عن تلف الحمض النووي في كبد الفئران.

الملخص

يمكن أن يؤدي تلف الحمض النووي الذي لم يتم إصلاحه إلى عدم الاستقرار الجيني ، والذي بدوره قد يعزز تطور السرطان. لذلك ، فإن تحديد العوامل المحتملة للضرر للحمض النووي أمر مهم لحماية الصحة العامة. يعد اختبار المذنب القلوي في الجسم الحي ، الذي يكتشف تلف الحمض النووي عند كسر الخيط ، مناسبا بشكل خاص لتقييم المخاطر السامة للجينات للزيدات الحيوية ، حيث تعكس استجاباتها الامتصاص في الجسم الحي ، وتوزيع الأنسجة ، والتمثيل الغذائي والإفراز (ADME) للمواد الكيميائية ، بالإضافة إلى عملية إصلاح الحمض النووي. بالمقارنة مع فحوصات تلف الحمض النووي الأخرى في الجسم الحي ، فإن الاختبار سريع وحساس وبصري وغير مكلف ، ومن خلال تحويل تلف الحمض النووي المؤكسد إلى فواصل الخيوط باستخدام إنزيمات إصلاح محددة ، يمكن للمقايسة قياس تلف الحمض النووي المؤكسد بطريقة فعالة وخالية نسبيا من القطع الأثرية. يمكن إجراء قياس تلف الحمض النووي باستخدام مقايسة المذنب باستخدام تصميمات دراسة السموم الحادة وشبه المزمنة ، ومن خلال دمج مقايسة المذنب مع التقييمات السمية الأخرى ، يعالج الاختبار متطلبات رعاية من خلال الاستفادة القصوى من الموارد الحيوانية. ميزة رئيسية أخرى للمقايسات هي أنها لا تتطلب سوى كمية صغيرة من الخلايا ، ولا يجب اشتقاق الخلايا من تكاثر مجموعات الخلايا. يمكن إجراء المقايسات أيضا مع مجموعة متنوعة من العينات البشرية التي تم الحصول عليها من الأفراد المعرضين سريريا أو مهنيا.

المقدمة

يقيس فحص القلوية المذنب فواصل حبلا الحمض النووي على مستوى خلية واحدة. هي جزء لا يتجزأ تعليق من الخلايا وحيدة في الاغاروز على شريحة المجهر والخلايا هي lysed لتشكيل nucleoids، والتي تحتوي على حلقات supercoiled من الحمض النووي. الكهربائي في الرقم الهيدروجيني> 13 النتائج في فقدان supercoiling في الحلقات الحمض النووي التي تحتوي على فواصل حبلا، مع فروع سراح من الحمض النووي الهجرة نحو القطب الموجب، وخلق هياكل تشبه المذنب التي يمكن ملاحظتها بواسطة المجهر مضان. الحمض النووي مجزأة يهاجر من "الرأس" من المذنب في "ذيل" على أساس حجم جزء، ومضان النسبي للذيل المذنب بالمقارنة مع كثافة الإجمالية (الرأس والذيل) يمكن استخدامها لتحديد الحمض النووي الكسر 1 ، 2. فحص بسيط، حساسة، وتنوعا، سريع، وغير مكلفة نسبيا 1. ويستخدم للكشف عن الحمض النووي مجزأة الناجمة عن عوامل ضارة الحمض النووي للفحص لتحديد كمية الحمض النووي من التلف في الخلايا أو عزل نواة من indiviالأنسجة المزدوج من الحيوانات تعامل مع المواد السامة للجينات يحتمل أن تكون (الصورة). نظرا لمزاياها، وأوصى في الجسم الحي المذنب مقايسة كما في الجسم الحي السمية الوراثية الفحص الثاني (يقترن في الجسم الحي للفئران الاختبار) لإجراء تقييم سلامة المنتجات في المؤتمر الدولي الحالي على مواءمة (ICH) (3) وهيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA ) 4 المبادئ التوجيهية التنظيمية. في المختبر، ونحن قد استخدمت فحص لتقييم في الحمض النووي من التلف الجسم الحي الناجم عن المكونات الغذائية والأدوية والمواد النانوية 5-10. وسيتم استخدام كبد الفئران كمثال في هذا البروتوكول، ولكن مقايسة المذنب لا يمكن أن يؤديها مع الأنسجة الأخرى / أجهزة حيوانات التجارب، طالما الخلايا واحدة سليمة يمكن عزلها عن الأنسجة.

أنواع معينة من الحمض النووي من التلف صعبة للكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي من دون تعديل فحص القلوية المذنب الأساسي. في حالة الحمض النووي من التلف التأكسدي، حبلا بيمكن إنشاء reaks في الآفات التأكسدي في الحمض النووي عن طريق هضم مع الانزيمات إصلاح مثل الإنسان 8 oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1، مما يخلق فواصل في 8 oxoguanine (8 oxoGua) وميثيل fapy-جوانين 11. أيضا، نوكلياز داخلية الثالث (إندو الثالث) يخلق فواصل أساسا في البريميدينات أكسدة 1. وهكذا، إضافة خطوة انزيم الهضم يجعل فحص طريقة محددة وحساسة لقياس الحمض النووي من التلف التأكسدي في الجسم الحي (12). وباستخدام هذه المقايسات، لقد أثبتنا التي يسببها التسمم الحمض النووي من التلف التأكسدي في كبد الجرذان والفئران 6-8 وفي قلب الفئران 10.

فحص القلوية المذنب العديد من التطبيقات في علم السموم وراثية والرصد الحيوي الإنسان: 1)، ومتابعة في فحص الجسم الحي لgenotoxins التي حددها حساسة في المختبر اختبارات 3،13، 2) لتقييم آليات الحمض النووي من التلف الناجم عن أجنبي بيولوجيا في أنسجة متعددة 14، 3) للتحقيق في ما إذا كانمادة مسرطنة تعمل باستخدام السمية الوراثية أو وضع غير السمية العمل (وزارة الزراعة) 7، 4) لتقييم إصلاح الحمض النووي الضرر 15، 5) للتحقيق في الأمراض التي تصيب الإنسان والتعرض المهني 16، و 6)، ومحتمل الإنتاجية العالية فحص الكشف عن جهاز معين السمية الوراثية 17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على إجراءات تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في / مركز الولايات المتحدة FDA الوطني للبحوث السمية: الأخلاقيات بيان.

ملاحظة: تصميم الدراسة وصفه هنا على أساس بروتوكول الذي وضعه المركز الياباني للالتحقق من الطرق البديلة (JaCVAM) لصلاحيتها للمقايسة في الجسم الحي القوارض القلوية المذنب 18، ومواصلة تعديله بناء على توصيات في منظمة التعاون والتنمية التوجيهي TG489 19 .

1. إعداد

  1. إعداد الشرائح
    1. حل الاغاروز ذوبان العادية بنسبة 1٪ (ث / ت) في العازلة الفوسفات (كا 2+، والمغنيسيوم 2+ مجانا والفينول الأحمر الحرة) عن طريق التسخين في فرن الميكروويف.
    2. وضع حل المنصهر 1٪ معيار الاغاروز في 55 ° C حمام الماء وتوازن درجة الحرارة مع الحمام. تراجع الزجاج المجهر الشرائح في حل الاغاروز، تصريف أي excesق الاغاروز ويمسح الجزء الخلفي من الشرائح نظيفة. ضع الشرائح في وضع مستقيم على سطح مستو، والسماح للشرائح حتى يجف في RT. تخزين الشرائح في مكان جاف.
  2. تحضير محاليل فحص المذنب
    1. تحضير 0.5٪ منخفضة ذوبان الحل الاغاروز. حل منخفضة ذوبان الاغاروز في العازلة الفوسفات (كا 2+، والمغنيسيوم 2+، والفينول مجانا الأحمر) عن طريق التسخين في فرن الميكروويف. إبقاء الحل في 37-45 درجة مئوية خلال إعداد الشرائح المذنب. تجاهل أي حل الاغاروز المتبقية بعد ذلك.
    2. إعداد تحلل العازلة. جعل حل 100 ملم من الصوديوم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (ثنائي الصوديوم EDTA، السيد 372.24 غ / مول)، و 2.5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، والسيد 58.44 جم / مول)، و 10 ملي تريس hydroxymethyl aminomethane (تريس قاعدة، السيد 121.14 غ / مول) في الماء النقي، وضبط درجة الحموضة إلى 10 مع 10 N محلول هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم، السيد 40 جم / مول). في يوم من الاستخدام، إضافة تريتون X100 وسلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس، السيد 78.13 غرام / مول) إلى حل لتحقيق ويركز النهائيالأيونات من 1٪ و 10٪ على التوالي، ويقلب في 4-10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    3. جعل عازلة إنزيم جديد في يوم من الاستخدام. تحضير محلول يحتوي على 40 ملي 2- [4- (2-هيدروكسي) piperazin-1-YL] ethanesulfonic حمض (HEPES، السيد 238.3 غرام / مول)، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم (بوكل، السيد 74.55 جم / مول)، و 0.5 ملم EDTA ثنائي الصوديوم، و 0.2٪ زلال المصل البقري (BSA، السيد 66463 جم / مول) في الماء النقي. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع 10 حل N هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH، 56.1 غرام / مول). إثارة في RT وتحقق حل كامل قبل استخدامها.
    4. يعد حل العازلة القلوية التي تحتوي على 300 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1 ملي EDTA ثنائي الصوديوم في الماء النقي. إثارة في 4-10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قياس درجة الحموضة من الحل قبل استخدامها والتأكد من درجة الحموضة> 13.
    5. إعداد محلول 0.4 M قاعدة تريس في الماء النقي، وضبط لدرجة الحموضة 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك، والسيد 36.46). تخزين الحل في 4-10 درجة مئوية. هذا هو تحييد العازلة.
    6. جعل وresh تنميق عازلة في يوم من الاستخدام. تحضير محلول يحتوي على 20 ملي ثنائي الصوديوم EDTA و 10٪ DMSO في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS، كاليفورنيا 2+، والمغنيسيوم 2+، والفينول الأحمر الحرة). تخزين على الجليد حتى الاستخدام.
    7. لإعداد حل تلطيخ، وتمييع النووي حمض فلوري حل الأسهم وصمة عار مع تريس، بورات-EDTA (عازلة TBE) في 1: 10000 (ت / ت). حماية حل من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. متجر في 2-8 درجة مئوية، وتستخدم مع 24 ساعة.

2. إعداد تعليق خلية واحدة من كبد الفئران

  1. الموت ببطء الفئران مع CO الطرق التالية غاز 2 الموصى به في المبادئ التوجيهية الطبية البيطرية الأمريكية للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة 20.
    1. ضبط معدل تدفق CO 2 في 2.75. وضع فأر في غرفة القتل الرحيم (على سبيل المثال، جرة مجفف، قفص الفئران مع غطاء تنفيس) وتشغيل CO 2 عن طريق فتح صمام خزان. انتظر 1،5-2،5 دقيقة حتىالفئران يصبح فاقدا للوعي. زيادة تدفق CO 2 إلى وضع الحد الأقصى لها. بعد التوقف عن التنفس، وترك الفئران في الغرفة لحوالي 1 دقيقة لضمان القتل الرحيم. تحقق من القتل الرحيم والتلمس للتأكد من أن الفئران لا يوجد لديه ضربات القلب، ومعسر أصابع القدم لتحديد أن الفئران لا تنسحب أطرافهم لها.
  2. تطهير الجلد الشعر مع 70٪ من الإيثانول. فتح تجويف البطن وإزالة الكبد سليمة مع مقص جراحي. بعد إزالة الكبد، وإزالة الفص الجانبي الأيسر من الكبد المتبقية مع مقص جراحي. وضع الفص الجانبي الأيسر على لوح التقطيع، وقطع قطعتي 3-4 ملم المقاطع العرضية سميكة باستخدام المتاح واحدة للفوز شفرة حلاقة.
  3. وضع المقطع العرضي واحدة على ورق الترشيح (لمنع الشباك من القسم)، ووضع القسم في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (NBF). تأكد من أن نسبة 10٪ بنك الفجيرة الوطني النسيج هو 10: 1 أو أكثر. بعد وقت التثبيت من لا يقل عن 72 ساعة، بروكوفاق سطيف الكبد عن التشريح المرضي (انظر القسم 7 أدناه).
  4. وضع قسم الكبد عرضية الثاني إلى 5 مل الجليد الباردة تنميق عازلة (القسم 1.2.6) في طبق بيتري 6 سم وشطف 3 مرات لإزالة بقايا الدم.
  5. نقل قسم الكبد لأنبوب الطرد المركزي 2 مل جديدة تحتوي على 1 مل العازلة تنميق الجليد الباردة. تخطر على قسم الكبد تشطف جيدا مع زوج من مقص غرامة للافراج عن الخلايا. توتر تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة أي كتل الأنسجة.
  6. ضع تعليق خلية واحدة على الجليد واستخدامه لإجراء الشرائح داخل 1 ساعة. تحقق من تركيز الخلايا عن طريق عد (على سبيل المثال، مع عدادة الكريات أو مكافحة الخلايا الالكترونية) لضمان أن تركيزه حوالي 2 X10 6 خلية / مل.

3. إعداد المذنب الشرائح

  1. مزيج حجم واحد من تعليق خلية واحدة مع 10 مجلدات من المنصهر، 37 درجة مئوية، و 0.5٪ منخفضة ذوبان الحل الاغاروز (القسم 1.2.1).على الفور ماصة 100 ميكرولتر على شريحة المغلفة مع منتظم الاغاروز نقطة انصهار (القسم 1.1). المكان على الفور زلة غطاء فوق مزيج خلايا الأغاروس. جعل لا يقل عن 8 شرائح لكل عينة.
    ملاحظة: يجب تحديد كافة الشرائح برقم أو رمز مشابهة وسجلت هويتهم، بحيث الشرائح يمكن وسجل بطريقة أعمى (انظر 6.2.2 أدناه).
  2. وضع الشرائح شقة وباردة إلى 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد أن عزز الجل، وإزالة بلطف زلات غطاء وتزج الشرائح في تحلل العازلة قبل المبردة (القسم 1.2.2). حماية الشرائح من الضوء والحفاظ على الشرائح في تحلل العازلة عند 4 درجات مئوية من 1 ساعة (الحد الأدنى) إلى O / N (كحد أقصى).

4. العلاج الإنزيم من المذنب الشرائح

  1. إزالة 6 من 8 الشرائح المحضرة من كل عينة من نسيج العازلة تحلل وشطف لهم 3X لمدة 5 دقائق كل العازلة مع انزيم (القسم 1.2.3) في RT. استخدام الشرائح المتبقيتين لفحص القلوية المذنب ثithout انزيم العلاج (انظر 5.1 أدناه). بعد الشطف، وإزالة السائل الزائد عن طريق تجفيف والنشاف الشرائح مع الأنسجة.
  2. تمييع hOGG1 وإندو الثالث الأسهم الانزيم مع العازلة انزيم في 1: 1000 (ت / ت). ضع على الجليد حتى الاستخدام.
  3. تطبيق 200 ميكرولتر من الحلول التالية على الشرائح المحضرة من كل مجموعة العلاج: 200 ميكرولتر من العازلة انزيم وحدها (2 الشرائح تستخدم الشرائح المرجعية)، 200 حل ميكرولتر hOGG1 (2 شرائح) أو 200 ميكرولتر إندو الثالث حل (2 الشرائح).
  4. وضع الشرائح في لوحات بيتري اصطف مع المناشف الورقية مبلل، تغطية الشرائح مع بارافيلم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لاندو الثالث المعاملة والشرائح إشارة و 30 دقيقة للشرائح المعالجة hOGG1.
  5. بعد الحضانة، وشطف الشرائح مع الماء المقطر ومتابعة المعالجة كما هو موضح في 5.2 أدناه.

5. الفك والكهربائي

  1. لالشرائح لا تعامل مع الإنزيمات، وإزالة الشرائح من تحلل العازلة، واستنزاف الشرائح وشطف مرة واحدة مع العازلة تحييد الباردة (القسم 1.2.5) لمدة 5 دقائق لإزالة المنظفات المتبقية والأملاح.
  2. مكان الشرائح من خطوات 4.5 و 5.1 عشوائيا في أفقي خزان الكهربائي للهلام، وتجنب أي مسافات. ملء الخزان مع تقدم طازجة الرقم الهيدروجيني> 13 العازلة الكهربائي (القسم 1.2.4) حتى يغطي مستوى السائل فقط الشرائح (تجنب فقاعات على الاغاروز وتأكد من أن خزان مستوى). تسجيل درجة الحموضة العازلة ودرجة الحرارة في بداية تفكيك الحمض النووي.
  3. دعونا لا تزال الشرائح في المخزن المؤقت القلوية لمدة 20 دقيقة للسماح للاسترخاء من الحمض النووي والتعبير عن الضرر القلويات مسؤولا.
  4. أثناء الفك، برنامج امدادات الطاقة لإنتاج 0.7 V / سم في الخزان الكهربائي (V / سم = فولت مقسوما على المسافة بالسنتيمتر بين الأقطاب الموجبة والسالبة).
  5. بعد الفك، اضغط على زر التشغيل على امدادات الطاقة. إذا لزم الأمر، وضبط الحالي إلى 300 مللي أمبير من خلال رفع أو خفض مستوى العازلة. تبقي عشرمستوى عازلة البريد فقط فوق سطح الشرائح. أداء الكهربائي في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تسجيل وضع الشرائح، ودرجة حرارة المخزن المؤقت والحالية (الامبير) في بداية ونهاية الكهربائي.
    ملاحظة: الكثير من العازلة يؤدي إلى انخفاض الفولتية التي يمكن أن تتداخل مع الحمض النووي للهجرة.
  6. بعد الكهربائي، وتحييد القلوية الزائدة عن طريق رفع بلطف الشرائح من دبابات وتخبط في المخزن تحييد (القسم 1.2.5) لمدة 5 دقائق. استنزاف الشرائح وكرر مرتين أخريين.
  7. إصلاح الشرائح عن طريق غمر في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. السماح للشرائح في الهواء الجاف ومكان في منطقة جافة للتخزين.

6. الحمض النووي تلطيخ، المذنب التصور والتحليل

  1. تلطيخ DNA
    1. ضع الشرائح على صينية من الورق المقوى أو المعدن وإضافة 200 ميكرولتر من الحل وصمة عار العمل النووي حمض الفلورسنت (القسم 1.2.7) على كل شريحة، وتغطي مع انزلاق الغطاء الزجاجي. حماية الشرائح منضوء تسمح الشرائح للبقاء على اتصال مع حل تلطيخ لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التهديف. وصمة عار على الشرائح في دفعات من 20 في وقت واحد.
    2. قبل قراءة كل شريحة، وصمة عار بلطف بعيدا حل تلطيخ الزائد، والحرص على عدم تعكير صفو غطاء زجاجي.
  2. التصور المذنب وتسجيل النقاط
    1. استخدام كاميرا فيديو مثبتة في مضان المجهر لمشاهدة الصور الحية من الشريحة المذنب على شاشة الكمبيوتر.
    2. عشوائيا اختيار مجال المجهر تحتوي على خلايا. باستخدام الماوس، حدد خلية. انقر على مركز "رأس المذنب" مع ضغطة والأيسر للفأرة.
      ملاحظة: برامج الكمبيوتر بحساب جميع المعلمات قياس للخلية ويضيف البيانات إلى ملف البيانات.
    3. يسجل كل الخلايا في الحقل الحالي (راجع الخطوة 6.2.4)، ومن ثم استخدام عناصر التحكم مرحلة المجهر والفيديو التي تظهر على الشاشة للعثور على مجموعة أخرى من الخلايا. يسجل هذه الخلايا كما هو موضح في 6.2.2.
    4. يسجل و الشرائحمدمج اليمين إلى اليسار وأسفل إلى أعلى. اختيار حوالي 10 حقول عشوائيا. وخلال هذه العملية، أي خلية المذنب المناسبة التي تظهر في مجال الرأي يجب أن يكون سجل دون تحيز.
      ملاحظة: لا يسجل المذنب إذا كان أي من التالية صحيحا: 1) يقع على أي من حواف الشريحة. 2) اثنين أو أكثر من المذنبات تتداخل. 3) هناك الحطام في الذيل. 4) والبرنامج لا يمكن التفريق بين الرأس والذيل. أو 5) تلطيخ للنواة و / أو ذيل يختلف كثيرا عن المذنبات الأخرى على الشريحة.
      ملاحظة: المذنبات مع ما يقرب من جميع مضان الحمض النووي في ذيل غالبا ما يشار إليها باسم المذنبات "القنفذ". لا ينبغي أن يكون سجل المذنبات القنفذ، ولكن يجب أن يتم تسجيل عدد من القنافذ الكشف خلال تسجيل الشرائح وذكرت كنسبة مئوية من إجمالي المذنبات.
    5. تحليل لا يقل عن 75 المذنبات لكل شريحة، قراءة شريحتين في الجهاز / الأنسجة للحصول على ما لا يقل عن 150 خلايا المذنب / عينة في المجموع. بعد العدد المطلوب من الخلايا من شريحة لها أن تكونسجل داخلي ويتم حفظ النتيجة كملف جدول بيانات لتحليل البيانات في وقت لاحق.

7. تحليل التشريح المرضي

  1. بعد ما لا يقل عن تثبيت 72 ساعة في 10٪ بنك الفجيرة الوطني، تليها الأنسجة التشذيب 21، معالجة بشكل روتيني وتضمين اليسار الفص الجانبي الكبد من العينات في البارافين الشمع المتوسطة القائمة 22. قسم العينات في حوالي 5 ميكرون، وجمع على الشرائح الزجاجية.
  2. وصمة عار على أقسام مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E):
    1. تسخين الشرائح مع أقسام الأنسجة البارافين في C الفرن 60 درجة لمدة 2 ساعة قبل إجراء تلطيخ.
    2. استخدام زيلين إلى deparaffinize الجانبين. ترطيب الشرائح مع الإيثانول متدرج (ETOH) لتشغيل شطف ماء الصنبور.
    3. ضع الشرائح في 450 مل من الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة و 40 ثانية. الشرائح شطف مع حمض (حمض الخليك الجليدية 2 مل إلى 450 مل من الماء غير المتأينة) لمدة 4 ثانية التالية 5 دقائق تشغيل شطف ماء الصنبور.
    4. وضع انزلقوفاق في 450 مل 70٪ ETOH تحتوي على 1 مل هيدروكسيد الأمونيوم لمدة 2 دقيقة، تليها تشغيل الحنفية شطف المياه لمدة 2 دقيقة و 30 ثانية، و 70٪ شطف ETOH لمدة 1 دقيقة.
    5. احتضان الشرائح مع 450 مل يوزين Y محلول يحتوي على حامض الخليك الجليدي 4 مل لمدة 3 دقائق.
    6. يذوى الشرائح مع ETOH متدرج. مسح الشرائح مع زيلين (ثلاث مرات 1 دقيقة لكل منهما)، وعقد الشرائح في الزيلين حتى يتم وضعها زلات غطاء على الشرائح.
  3. فحص الشرائح بواسطة المجهر الضوئي، نتائج قياسية، والصف آفات غير الورمية لشدة ك 1 (الحد الأدنى)، 2 (معتدل)، 3 (معتدل)، أو 4 (علامة).
    ملاحظة: درجة الخطورة بطلب للحصول على آفة معينة يستند إلى الحصة النسبية من الكبد مع الآفة (الحد الأدنى = <1-15٪، معتدل = 16-35٪، متوسطة = 36-60٪، وتميز = 61- 100٪).

تحليل 8. البيانات

  1. ويعتبر هذا الحيوان وحدة تجريبية لتقييم الإحصائية. وأعرب عن الحمض النووي من التلف كنسبة مئوية DN(أ) في الذيل.
  2. يتم احتساب الحمض النووي من التلف التأكسدي على النحو التالي: الشرائح المرجعية (أي علاج انزيم) تقدم تقديرا للفواصل الحمض النووي خلفية حبلا (SB).
    ملاحظة: الشرائح المعالجة انزيم توفر قدرا من فواصل حبلا وقواعد المؤكسد (SB + OX). وإذا افترضنا أن الاستجابة للجرعة خطية ل٪ الحمض النووي في ذيل بوصفها وظيفة من الحمض النووي من التلف والطرح من SB من SB + OX يعطي تقديرا للفواصل حبلا الحمض النووي من البريميدينات / البيورينات تغيير المؤكسد 23.
  3. تحليل الحمض النووي٪ في ذيل بوصفها وظيفة من الجرعة عن طريق ذات اتجاه واحد أنوفا، تليها اختبار Dunnett للمقارنة، بحث الردود في الحيوانات المعالجة إلى السيطرة على السيارة.
    ملاحظة: يتم الذيل واحد جميع الاختبارات ويتم تعيين القيمة ع أقل من 0.05 كمعيار لدلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد أجريت في الجسم الحي فحص القلوية المذنب بالتزامن مع مقايسة المذنب المعدلة انزيم لقياس كل الأضرار المباشرة والتأكسدي الحمض النووي في كبد الفئران التي عرضت لخلات سيبروتيرون (CPA) 5. اتفاق السلام الشامل هو الدواء الهرمونية الاصطناعية التي يدفع أورام كبد الفئران بطريقة مصنفة حسب الجنس، مع خمسة أضعاف الجرعات العالية اللازمة لإحداث أورام الكبد في الفئران الذكور بالمقارنة مع الإناث 24. وجدنا أن الحمض النووي من التلف المبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول قياس المتزامنة لكل من الحمض النووي من التلف التأكسدي المباشر وفي كبد الفئران على مستوى خلية واحدة. بروتوكول عام ينطبق على أي نوع من الأنسجة التي الخلايا وحيدة النواة أو يمكن أن تكون معزولة مع الحد الأدنى من الحمض النووي من التلف الناجم عن تصنيع (أي الحمض النووي من التلف الناجم ليس عن طريق وكيل الاختبار، ولكن عن طريق التعامل ومعالجة الأنسجة الحيوانية). في بحثنا، أجرينا فحوصات المذنب قلوية على الخلايا من نخاع العظام 7،9، المعدة (6)، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى أي من المؤلفين مصالح متضاربة أو مصالح متضاربة. المعلومات الواردة في هذه المواد ليست نشرا رسميا للمعلومات من قبل إدارة الغذاء والدواء ولا تمثل موقف الوكالة أو سياستها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. نحن نقر بالنشر الأصلي لدراسة CPA بواسطة Elsevier B.V.: Ding W و Bishop ME و Peace MG و Davis KJ و White GA و Lyn-Cook LE و Manjanatha MG. تحليل استجابة الجرعة الخاصة بالجنس للسمية الجينية في الفئران F344 المعالجة بأسيتات السيبروتيرون. أبحاث الطفرات 774: 1-7 ، 2014 (PMID: 25440904)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغطية (رقم 1 ، 24 × 50 مم)  فيشر12-544-14
شرائح مجهرفيشر12-550-123
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)   ؛فيشر67-68-5
EDTA ، ثنائي الصوديومفيشرBP120-1
ملحي مخزن بالفوسفاتفيشرICN1860454
1x محلول ملح متوازن هانكس (HBSS) (Ca2 + < / sup> ، Mg2 + < / sup> مجانا)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
نقطة انصهار منخفضة Agarose ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA) الهيدروجيني FisherBP1356-100
(درجة الحموضة 7.5-14)FisherM95873
Potassium ClorideFisher7447-40-7
ملصقات هيدروكسيد البوتاسيومفيشر1310-58-3
(0.94 × 0.5 بوصة)فيشرNC9822036
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)   ؛فيشر7647-14-5
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) فيشر1310-73-2
SYBR & TRADE; الذهب InvitrogenS11494
Triton X-100  فيشر9002-93-1
قاعدة تريزما  فيشر77-86-1
2.0 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر05-402-6
مصفاة خلوية (40 & micro; م)فيشر22363547
إندونوكلياز III (Nth) نيو إنجلاند بيولابسM0268Sالتخفيف 1: 1,000
hOGG1 نيو إنجلاند بيولابيسM0241Sالتخفيف 1: 1,000
محلول شرائط ورق اختبار الأس

المراجع

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نسيج كبد الجرذمعلق الخلايا المفردةالرحلان الكهربائي للهلامالمجهر الفلوريإنزيمات hOGG1 وEndo IIIتلف الحمض النووي المستحث بـ CPA
في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.