Method Article

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

DOI:

10.3791/53837

⸱

April 8th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيمياء المناعية هي تقنية معملية قوية لتقييم توطين البروتين والتعبير عنه داخل الأنسجة. تقدم الأساليب شبه الآلية الحالية للقياس الكمي الذاتية وغالبا ما تخلق نتائج غير قابلة للتكرار. هنا ، نصف طرق الكيمياء المناعية متعددة الإرسال والكمية الموضوعية للتعبير عن البروتين والتوطين المشترك باستخدام التصوير متعدد الأطياف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيمياء المناعية هي تقنية كشف معملية سريرية وبحثية شائعة الاستخدام للتحقيق في تعبير البروتين وتوطينه داخل الأنسجة. تم تطوير العديد من الأنظمة شبه الكمية لتسجيل التعبير باستخدام الكيمياء المناعية ، لكن الذاتية المتأصلة تحد من قابلية التكاثر ودقة النتائج. علاوة على ذلك ، فإن التحقيق في المؤشرات الحيوية المتداخلة مكانيا مثل عوامل النسخ النووي أمر صعب مع تقنيات الكيمياء المناعية الحالية. لقد قمنا بتطوير وتحسين نظام للتحقيق المتزامن للبروتينات المتعددة باستخدام طرق عالية الإنتاجية للكيمياء المناعية متعددة الإرسال والتصوير متعدد الأطياف. يتم إجراء الكيمياء المناعية متعددة الإرسال عن طريق التطبيق المتسلسل للأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوي. تستخدم الكروموجينات المختلفة للكشف عن كل بروتين ذي أهمية. يتم تحميل الشرائح الملطخة في ماسح ضوئي آلي للشرائح ويتم إنشاء بروتوكول للحصول على الصور الآلي. يتم إنشاء مكتبة طيفية عن طريق تلطيخ مجموعة من الشرائح باستخدام كروموجين واحد على كل منها. يتم استيراد مجموعة فرعية من الصور الملطخة التمثيلية إلى برنامج التصوير متعدد الأطياف ويتم إنشاء خوارزمية للتمييز بين نوع الأنسجة عن طريق تحديد مقصورات الأنسجة على الصور. يتم تقسيم المقصورات تحت الخلوية باستخدام مضاد الهيماتوكسيلين وضبط الخوارزمية الجوهرية. يتم تطبيق العتبة لتحديد الإيجابية وتوطين البروتين المشترك. ثم يتم تطبيق الخوارزمية النهائية على مجموعة الأنسجة بأكملها. تسمح البيانات الناتجة للمستخدم بتقييم تعبير البروتين بناء على نوع الأنسجة (على سبيل المثال الظهارة مقابل السدى) والحيز تحت الخلوي (النواة مقابل السيتوبلازم مقابل غشاء البلازما). يسمح تحليل التوطين المشترك بالتحقيق في أنواع الخلايا الإيجابية المزدوجة والسلبية المزدوجة والموجبة الفردية. يعد الجمع بين التصوير متعدد الأطياف والكيمياء المناعية متعددة الإرسال والحصول الآلي على الصور طريقة موضوعية عالية الإنتاجية للتحقيق في المؤشرات الحيوية داخل الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المناعية (IHC) هي تقنية المختبرات القياسية للكشف عن البروتين داخل الأنسجة، وانها لا تزال تستخدم على نطاق واسع IHC في كل من البحث والتشخيص المرضي. تقييم IHC تلطيخ غالبا ما يكون نصف الكمية، وإدخال التحيز المحتمل في تفسير النتائج. وقد وضعت العديد من المناهج شبه الكمية التي تتضمن كلا من شدة تلطيخ ومدى تلطيخ إلى التشخيص النهائي 1-4. وتشمل الأنظمة الأخرى كثافة يحرز والمكان التحت خلوية من أجل توطين التعبير 5 أفضل. وغالبا ما تستخدم إدماج متوسط ​​درجات من المشاهدين متعددة من أجل تقليل آثار المشاهد واحد التحيز 6. وعلى الرغم من هذه الجهود، الذاتية في التحليل لا يزال، وخاصة عند تقييم مدى تلطيخ 7.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: بروتوكول يصف هنا تلطيخ وتحليل ميكروأري الأنسجة (TMA)، التي سبق وصفها 12،17،18. تم الحصول على قسم TMA سميكة 4 ميكرون من كتلة البارافين باستخدام مشراح القياسية.

ملاحظة: مكتبة الطيفية لل4 المكوره ومباين ينبغي إنشاء لالكميات الصورة. من أجل القيام بذلك، يجب تشغيل بروتوكول الأمثل لكل الأجسام المضادة الأفراد مع الأجسام المضادة واحدة لكل شريحة، ناقص مباين النهائي. يجب أن تكون ملطخة شريحة الخامسة مع الهيماتوكسيلين لتوليد 5 الصور اللازمة لإنشاء مكتبة الطيفية.

1. المتعددة المناعية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الشكل 1، يتم تنفيذ التدريب على أنسجة البروستاتا إلى صور شريحة في الظهارية وانسجة أجزاء، جنبا إلى جنب مع مقصورة غير الأنسجة. باستخدام الظهارية غشاء علامة E-كادهيرين، تم إجراء تقسيم الخلية إلى فصل النواة، السيتوبلازم، وأجزاء الغشاء، كما هو موضح في الشكل (2).

في تجربة واحدة، كنا المضاعفة IHC للتحقيق في التعبير وتوط.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام المناعية التقليدية لتقييم التعبير البروتين محدودة، وأساليب ذاتية شبه الكمية للتحليل 22،23. وقد تم إنشاء منصات مسبقا لتحليل الإنتاجية العالية التعبير العلامات البيولوجية والتعريب. تجزئة مفصلة لكل من الأنسجة ومقصورات التحت خلوية يسمح للمستخدمين لدراسة التعبير العلامات البيولوجية، التعريب، وشارك في التعريب مع علامات أخرى من الفائدة. في دراسات سابقة، لقد أثبتنا فائدة IHC والتصوير متعدد الأطياف، وخاصة عندما تستخدم لدراسة البروتينات مترجمة إلى نفس 18،20،21 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر جامعة مبادرات البحوث بالحركة ولاية ويسكونسن في مختبر علم الأمراض، في جزء بدعم من وزارة UW علم الأمراض والطب المخبري ومنحة UWCCC P30 CA014520، لاستخدام التسهيلات والخدمات التي تقدمها.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
تصنيف الزيلينفيشر للكيماوياتX3F1GALNFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار & ndash ؛ 3 ، التفاعل &ndash ؛ 0
الكحول الإيثيلي -200 دليلعلى تصنيف فيشر العلمي4355223NFPA: الصحة &ndash ؛ 0 ، النار &ndash ؛ 3 ، التفاعل & ndash ؛ 0
تريس بيسفيشر ScientificBP152-500تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار &ndash ؛ 0 ، التفاعل &ndash ؛ 0
تريس هيدروكسي ميثيل أمينوميثان هيدروكلوريكفيشر ScientificBP153-1تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار &ndash ؛ 0 ، التفاعل & ndash ؛ 0
Tween 20Chem-Impex1512تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 0 ، النار &ndash ؛ 1 ، التفاعل &ndash ؛ 0
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتفيشر ScientificBP2944-100تصنيف NFPA: الصحة – 1 ، النار & ndash ؛ 0 ، التفاعل &ndash ؛ 0
بيروكسيدازيدبيوكير الطبيةPX968تجنب ملامسة الجلد والعينين. قد يسبب تهيج الجلد وتلف العين.
مستقبلات هرمون الاستروجين ألفاثيرمو فيشر Scientific-LabvisionRM9101غير مصنفة على أنها
مستقبلات أندروجينSCBTsc-816غير مصنفة على أنها خطرة
CD147Biodesign P87535Mغير مصنفة على أنها خطرة
E-cadherinDakoM3612غير مصنفة على أنها خطرة
رينوار ريد Andibody المخففBiocare PD904وهو مصمم خصيصا للعمل مع الأجسام المضادة القائمة على تريس
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002اتخذ الاحتياطات العادية لاستخدام قدر الضغط
Barrier pen-Immuno Edge  Vector LabsH-4000
مجموعة تغيير الطبيعة - خطوة ElutionBiocareMedical DNS001Hغير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 Goat المضادة للأرانب HRP PolymerBiocare MedicalRHRP520غير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 الماعز المضادة للأرانب AP PolymerBiocare MedicalRALP525غير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP PolymerBiocare MedicalM3M530غير مصنف على أنه خطير
Betazoid DAB Chromogen KitBiocare MedicalBDB20041. من المعروف أن DAB مادة مسرطنة مشتبه بها.
2. لا تعرض مكونات DAB للضوء القوي أو أشعة الشمس المباشرة.
3. ارتد معدات وملابس الحماية الشخصية المناسبة.
4. قد يسبب DAB حساسية الجلد. تجنب ملامسة الجلد والعينين.
5. راقب جميع البيئة الفيدرالية والولائية والمحلية فيما يتعلق بالتخلص
مجموعة الاعوجاج الأحمر للكروموجينBiocare MedicalWR806Corcorive. حمض قد يسبب تهيج الجلد أو تلف العين.
طقم فينا جرين كروموجينبيوكير ميديكالBRR807ضار إذا ابتلع
باجوران مجموعة كروموجين أرجوانيبيوكير الطبيةBJP807سائل قابل للاشتعال. يحفظ بعيدا عن الحرارة واللهب والشرر. ضار عن طريق الابتلاع أو الامتصاص. تجنب ملامسة الجلد أو العينين وتجنب الاستنشاق.
القط هيماتوكسيلينبيوكيير الطبيةCATHEالأرجواني   الحل   مع   أ   خفيف   الخليك   حمض   (الخل)   رائحه.   مايو   be
  مزعج   إلى   الجلد   أو   العيون.   تجنب   الاتصال   مع   الجلد   و   العيون.   تجنب   ابتلاع.
XYL Mounting MediaRichard Allen8312-4تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار & ndash ؛ 3 ، التفاعل & ndash ؛ 0
1.5 CoverslipsFisher Brand22266858حواف حادة
حضانة (رطوبة)الغرفةعفا عليها الزمنعفاالعديد من البائعين المتاحين
استقرار الفرن الحراري- ThermC-4008-Q
الخلفية كاشف حجب المعاقبBiocare MedicalBP974لا يصنف هذا المنتج على أنه خطر.
برنامج inFormبرنامجPerkinElmerCLS135781برنامج التصوير الأساسي متعدد الأطياف المستخدم في برنامج Nuance للمخطوطة
برنامج PerkinElmerNuance EXالمستخدم في صنع مكتبات طيفية داخل مخطوطة
مجهر Vectra وماسح ضوئي للشرائحPerkinElmerVECTRAماسح ضوئي آلي للشرائح ومجهر للحصول على مكعبات صور IM3
خطرة الطبي من عليها الزمن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed ImmunohistochemistryMultispectral ImagingProtein Expression QuantitationProtein Co localization AnalysisTissue Segmentation AlgorithmSpectral Library CreationChromogen Detection MethodsAutomated Image AcquisitionSubcellular Compartment AnalysisBiomarker Investigation Tissues

Related Articles