يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

12.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53837

⸱

أبريل 8, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

في هذه المقالة

ملخص

الكيمياء المناعية هي تقنية معملية قوية لتقييم توطين البروتين والتعبير عنه داخل الأنسجة. تقدم الأساليب شبه الآلية الحالية للقياس الكمي الذاتية وغالبا ما تخلق نتائج غير قابلة للتكرار. هنا ، نصف طرق الكيمياء المناعية متعددة الإرسال والكمية الموضوعية للتعبير عن البروتين والتوطين المشترك باستخدام التصوير متعدد الأطياف.

الملخص

الكيمياء المناعية هي تقنية كشف معملية سريرية وبحثية شائعة الاستخدام للتحقيق في تعبير البروتين وتوطينه داخل الأنسجة. تم تطوير العديد من الأنظمة شبه الكمية لتسجيل التعبير باستخدام الكيمياء المناعية ، لكن الذاتية المتأصلة تحد من قابلية التكاثر ودقة النتائج. علاوة على ذلك ، فإن التحقيق في المؤشرات الحيوية المتداخلة مكانيا مثل عوامل النسخ النووي أمر صعب مع تقنيات الكيمياء المناعية الحالية. لقد قمنا بتطوير وتحسين نظام للتحقيق المتزامن للبروتينات المتعددة باستخدام طرق عالية الإنتاجية للكيمياء المناعية متعددة الإرسال والتصوير متعدد الأطياف. يتم إجراء الكيمياء المناعية متعددة الإرسال عن طريق التطبيق المتسلسل للأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوي. تستخدم الكروموجينات المختلفة للكشف عن كل بروتين ذي أهمية. يتم تحميل الشرائح الملطخة في ماسح ضوئي آلي للشرائح ويتم إنشاء بروتوكول للحصول على الصور الآلي. يتم إنشاء مكتبة طيفية عن طريق تلطيخ مجموعة من الشرائح باستخدام كروموجين واحد على كل منها. يتم استيراد مجموعة فرعية من الصور الملطخة التمثيلية إلى برنامج التصوير متعدد الأطياف ويتم إنشاء خوارزمية للتمييز بين نوع الأنسجة عن طريق تحديد مقصورات الأنسجة على الصور. يتم تقسيم المقصورات تحت الخلوية باستخدام مضاد الهيماتوكسيلين وضبط الخوارزمية الجوهرية. يتم تطبيق العتبة لتحديد الإيجابية وتوطين البروتين المشترك. ثم يتم تطبيق الخوارزمية النهائية على مجموعة الأنسجة بأكملها. تسمح البيانات الناتجة للمستخدم بتقييم تعبير البروتين بناء على نوع الأنسجة (على سبيل المثال الظهارة مقابل السدى) والحيز تحت الخلوي (النواة مقابل السيتوبلازم مقابل غشاء البلازما). يسمح تحليل التوطين المشترك بالتحقيق في أنواع الخلايا الإيجابية المزدوجة والسلبية المزدوجة والموجبة الفردية. يعد الجمع بين التصوير متعدد الأطياف والكيمياء المناعية متعددة الإرسال والحصول الآلي على الصور طريقة موضوعية عالية الإنتاجية للتحقيق في المؤشرات الحيوية داخل الأنسجة.

المقدمة

المناعية (IHC) هي تقنية المختبرات القياسية للكشف عن البروتين داخل الأنسجة، وانها لا تزال تستخدم على نطاق واسع IHC في كل من البحث والتشخيص المرضي. تقييم IHC تلطيخ غالبا ما يكون نصف الكمية، وإدخال التحيز المحتمل في تفسير النتائج. وقد وضعت العديد من المناهج شبه الكمية التي تتضمن كلا من شدة تلطيخ ومدى تلطيخ إلى التشخيص النهائي 1-4. وتشمل الأنظمة الأخرى كثافة يحرز والمكان التحت خلوية من أجل توطين التعبير 5 أفضل. وغالبا ما تستخدم إدماج متوسط ​​درجات من المشاهدين متعددة من أجل تقليل آثار المشاهد واحد التحيز 6. وعلى الرغم من هذه الجهود، الذاتية في التحليل لا يزال، وخاصة عند تقييم مدى تلطيخ 7. توحيد البروتوكول والتقليل الذاتية من مدخلات الإنسان هو الهدف الأسمى لخلق دقيقة، النتائج IHC استنساخه.

محتوى "> وهناك خيارات أخرى إلى جانب IHC لتحديد تعبير البروتين داخل الأنسجة. وفي إعداد البحوث، وقد جرت العادة على النظر المناعية كوسيلة لفحص البروتين توطين 8، في حين ينظر إلى تقنيات أخرى مثل immunoblotting كما معيار الذهب للتحقيق في التعبير البروتين . تحديد الأنسجة أو الخلايا التعبير عن مقصورة محددة صعبة دون دمج تقنيات متقدمة مثل تجزئة الخلية أو القبض على الليزر تسليخ مجهري 9،10. استخدام الأجسام المضادة الفلورسنت على شرائح الأنسجة يقدم حلا وسطا معقولا، ولكن خلفية تألق ذاتي بسبب NADPH، lipofuscins، شبكي ألياف الكولاجين، والإيلاستين يمكن أن تجعل الكميات الدقيقة من الصعب 11.

الآلية منصات علم الأمراض الحسابية هي اتجاها واعدا لمزيد من الكميات الموضوعية للأمراض تلطيخ 12-15. الجمع بين التصوير متعدد الأطياف مع ميكروأرس الأنسجةيسهل تحليل الإنتاجية العالية من البروتين التعبير في أحجام عينة كبيرة. مع هذه التقنيات، وتحليل البروتين شارك في الترجمة، وعدم التجانس تلطيخ، والأنسجة وتوطين التحت خلوية ممكن مع تخفيض جوهري في كل من التحيزات الكامنة والوقت اللازم للتحليل، بينما كان عائدا البيانات في مستمرة بدلا من الشكل القاطع 16. ولذلك، كان الغرض من هذه الدراسة هو إثبات فائدة من ومنهجية لأداء المناعية المضاعفة مع التحليل، وذلك باستخدام برامج التصوير متعدد الأطياف.

كتب هذا البروتوكول اليدوي، وتلطيخ المناعى تعدد الإرسال من قسم الأنسجة شريحة واحدة مع أربعة أجسام مضادة وحيدة النسيلة الأمثل. كتجربة نموذجية، والمضاعفة النووي المضادة للأرنب ألفا مستقبلات هرمون الاستروجين (ERα) ومستقبلات الاندروجين (AR) مع anti-الماوس CD147 بغشاء وبغشاء لمكافحة فأر E-كادهيرين. يمكن substitut أي الأجسام المضادة في الاختيارإد عن الأجسام المضادة المدرجة هنا، ولكن كل مجموعة من الأجسام المضادة يتطلب تحسين منفصل. يجب أن تكون المعالجة المسبقة لجميع الأجسام المضادة متطابقة. يجب أن يكون الأمثل الأجسام المضادة AR وCD147 على حدة وبعد ذلك حفل كوكتيل. تم الكشف عن كل الأجسام المضادة باستخدام نظام البوليمر خالية من البيوتين واحدة من 4 المكوره فريدة من نوعها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: بروتوكول يصف هنا تلطيخ وتحليل ميكروأري الأنسجة (TMA)، التي سبق وصفها 12،17،18. تم الحصول على قسم TMA سميكة 4 ميكرون من كتلة البارافين باستخدام مشراح القياسية.

ملاحظة: مكتبة الطيفية لل4 المكوره ومباين ينبغي إنشاء لالكميات الصورة. من أجل القيام بذلك، يجب تشغيل بروتوكول الأمثل لكل الأجسام المضادة الأفراد مع الأجسام المضادة واحدة لكل شريحة، ناقص مباين النهائي. يجب أن تكون ملطخة شريحة الخامسة مع الهيماتوكسيلين لتوليد 5 الصور اللازمة لإنشاء مكتبة الطيفية.

1. المتعددة المناعية

  1. شرائح خبز في الفرن 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدام غطاء الدخان الكيميائية، وتزج الشرائح في 100٪ زيلين. كرر لمدة 2 تغييرات الزيلين. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. مع تكرار الطازجة 100٪ من الإيثانول.
  2. تزج الشرائح في الايثانول 95٪ لمدة 3 دقائق. كرر مع الطازجة95٪ من الإيثانول. تزج الشرائح في الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق. تزج الشرائح في الماء المقطر لمدة 3 دقائق. كرر مع الماء المقطر النقي. شريحة الحنفية عموديا لاستنزاف المياه من الشريحة. تطبيق 200 ميكرولتر من الجاهزة للاستخدام مانع البيروكسيداز الذاتية لمدة 5 دقائق.
  3. استنزاف البيروكسيديز مانع من الشريحة وتزج في 45 مل العازلة استرجاع جاهزة للاستخدام (الرقم الهيدروجيني أقل من 7.0). مكان حاوية الشرائح في طنجرة الضغط والبدء في برنامج لتعيين 124 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. السماح طنجرة الضغط لتبرد لمدة 20 دقيقة. قبل الافتتاح.
  4. إزالة الحاويات العازلة استرجاع والسماح لتبرد إضافي 10 دقيقة. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 10 دقيقة. استنزاف المياه من شريحة وترسيم بعناية الأنسجة على الشريحة باستخدام قلم حاجز مسعور.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) .Transfer الشرائح إلى وعاء مسطح مع غطاء (غرفة الحضانة) التي تحتوي على شاش رطبة.
  6. إعداد 1 لتر من 1X المالحة تريس مخزنة مع توين-20 (TBST) عن طريق تمييع 50 ملتر من 20x وتريس مخزنة المالحة التي تحتوي على 1٪ توين 20 و 950 مل من الماء المقطر.
  7. استنزاف برنامج تلفزيوني من الشرائح وتطبيق 200 ميكرولتر من 1X TBST. احتضان 2 دقيقة. استنزاف TBST من الانزلاق والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة. تطبيق 200 ميكرولتر من كتلة البروتين العالمي جاهزة للاستخدام، وغرفة وثيقة واحتضان لمدة 7 دقائق.
  8. استنزاف كتلة البروتين والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة. تمييع مكافحة ERα الضد 1: 400 بإضافة 0.6 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى 239.4 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة. تطبيق 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف لشريحة وغرفة قريبة.
  9. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. استنزاف الضد من الشرائح وشطف مع TBST تليها الغمر لمدة 5 دقائق في TBST.
  10. استنزاف TBST من الانزلاق والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة. تطبيق 200 ميكرولتر من الجاهزة للاستخدام الماعز المضادة للأرنب الفجل البيروكسيديز البوليمر وغرفة قريبة. احتضان لمدة 30 دقيقة. بدرجة حرارة الغرفة. شريحة شطف مع TBST ومكان الشريحة في حاوية من TBST لمدة 5 دقائق.
  11. إعداد البني الفجل البيروكسيديز-3،3'-diaminobenzidine (HRP-DAB) مولد اللون عن طريق إضافة 8 ميكرولتر من DAB مولد اللون إلى 250 ميكرولتر عازلة DAB الركيزة ويمزج جيدا.
  12. استنزاف TBST من الشريحة، شريحة العودة إلى غرفة الحضانة وتطبيق 200 ميكرولتر من بني مولد اللون HRP-DAB لمدة 6 دقائق. شطف جيدا الشريحة مع الماء المقطر ومكان الشريحة في وعاء من الماء المقطر.
  13. مزيج الحل تغيير طبيعة من خلال الجمع بين 50 ميكرولتر من كاشف شطف الأول مع 150 ميكرولتر من كاشف عازلة الثاني. استنزاف المياه قبالة الشريحة وتطبيق الحل تغيير طبيعة المخفف إلى الشريحة لمدة 3 دقائق. بدرجة حرارة الغرفة. صب وشطف تغيير طبيعة كاشف مع TBST. تزج الشرائح في TBST لمدة 5 دقائق.
  14. إعداد AR / CD147 الأجسام المضادة كوكتيل من خلال تمييع 4.2 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة AR و 2.8 ميكرولتر من مكافحة CD147 الأجسام المضادة مع 203 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة. استنزاف TBST من الشريحة، والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة وتطبيق 200 ميكرولتر من AR / CD147 جocktail إلى الشريحة. إغلاق الغرفة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شريحة شطف مع TBST وتزج في TBST لمدة 5 دقائق.
  15. استنزاف TBST، والانزلاق العودة إلى غرفة الحضانة وتطبيق 200 ميكرولتر من الجاهزة للاستخدام الماعز المضادة للأرنب الفوسفاتيز القلوية البوليمر. إغلاق الغرفة والشرائح احتضان لمدة 30 دقيقة. بدرجة حرارة الغرفة. شريحة شطف مع TBST وتزج في TBST لمدة 5 دقائق.
  16. إعداد الفوسفاتيز القلوية الأحمر مولد اللون بإضافة 3.2 ميكرولتر من مولد اللون الأحمر إلى 250 ميكرولتر عازلة مولد اللون الأحمر وتخلط جيدا.
  17. استنزاف TBST من الانزلاق والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة. تطبيق 200 ميكرولتر من المخفف قلوي أحمر الفوسفاتيز مولد اللون إلى الشريحة، وغرفة وثيقة واحتضان لمدة 7 دقائق.
  18. استنزاف مولد اللون ويشطف جيدا الشرائح مع الماء المقطر. ضع الشريحة في وعاء من الماء المقطر لمدة 5 دقائق. استنزاف المياه من الانزلاق، وشطف مع TBST والعودة إلى غرفة الحضانة. تطبيق 200 ميكرولتر الماعز المضادة للماوس HRP البوليمر إلى الشريحة وكلوسالبريد الغرفة. احتضان لمدة 30 دقيقة. بدرجة حرارة الغرفة.
  19. استنزاف البوليمر من الشرائح وشطف مع TBST. الشرائح مكان في TBST لمدة 5 دقائق. إعداد 200 ميكرولتر من الأرجواني مولد اللون المرتبطة HRP بإضافة 3.2 ميكرولتر من كاشف الاستقرار إلى 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت وتخلط جيدا. إضافة 3.2 ميكرولتر من مولد اللون الأرجواني وتخلط جيدا، ثم 3.2 ميكرولتر من كاشف بيروكسيد الهيدروجين وتخلط جيدا.
  20. استنزاف TBST من الشرائح وتطبيق 200 ميكرولتر من مولد اللون الأرجواني استعداد لشريحة واحتضان لمدة 7 دقائق. بدرجة حرارة الغرفة. شريحة شطف مع المقطر المياه الشرائح وضعها في وعاء من الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  21. مزيج الحل تغيير طبيعة عن طريق خلط 50 ميكرولتر من كاشف شطف الأول مع 150 ميكرولتر من كاشف عازلة الثاني. استنزاف المياه قبالة الشريحة وتطبيق الحل تغيير طبيعة المخفف إلى الشريحة لمدة 3 دقائق. بدرجة حرارة الغرفة.
  22. شطف تغيير طبيعة كاشف قبالة مع TBST. ضع الشريحة في حاوية من TBST لمدة 5 دقائق. تمييع مكافحة E-كادهيرين الضدإلى 1: 200 بإضافة 1.1 ميكرولتر الضد إلى 218.9 ميكرولتر مخفف الأجسام المضادة. استنزاف TBST من الشريحة، شريحة العودة إلى غرفة الحضانة وتطبيق 200 ميكرولتر من E-كادهيرين إلى الشريحة. إغلاق الغرفة واحتضان مدة 30 دقيقة. بدرجة حرارة الغرفة.
  23. شريحة شطف مع TBST ومكان الشريحة في حاوية من TBST لمدة 5 دقائق. استنزاف TBST من الشرائح، والعودة الانزلاق الى غرفة الحضانة وتطبيق 200 ميكرولتر الماعز المضادة للماوس HRP البوليمر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شريحة شطف مع TBST ومكان الشريحة في حاوية من TBST لمدة 5 دقائق.
  24. إعداد الأسود HRP المرتبطة مولد اللون عن طريق إضافة 8 ميكرولتر من مولد اللون إلى 250 العازلة ميكرولتر. تطبيق 200 ميكرولتر مولد اللون إلى الشريحة وتطوير لمدة 2 دقيقة. شطف جيدا الشرائح مع الماء المقطر وتزج في وعاء من الماء المقطر.
  25. تمييع الهيماتوكسيلين بإضافة 40 ميكرولتر الهيماتوكسيلين إلى 200 ميكرولتر الماء المقطر. استنزاف المياه من الشرائح وتطبيق 200 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين المخفف إلى الشريحة لمدة 30 ثانية. شريحة شطفتشغيل بدقة ماء الصنبور لمدة 2 دقيقة، ثم يشطف في الماء المقطر لمدة 30 ثانية. الشرائح مكان في C الفرن 60 درجة لمدة 15-30 دقيقة.
  26. تزج الشرائح في الطازجة 100٪ الزيلين لمدة 30 ثانية، ومسح زيلين الزائد وإضافة قطرة واحدة من وسائل الاعلام المتزايدة دائمة. ساترة مع رقم 1.5 ساترة.

2. الآلي الحصول على الصور وتحليل

  1. تحميل الشرائح ملطخة على ماسح الشرائح الآلية. واستنادا إلى قطر، والانفصال، وعدد من النوى TMA، إنشاء بروتوكول المسح الآلي وفقا دليل تعليمات الشركة المصنعة.
  2. فتح برامج التصوير متعدد الأطياف لبناء مكتبة طيفية من الشرائح السيطرة ملطخة المكوره الفردية والهيماتوكسيلين ملطخة الشرائح. فتح مكعب صورة تم الحصول عليها من شريحة التحكم واختر 4:56 المناطق الملون بشكل إيجابي في تحديد بصريا أن مولد اللون. كرر مع مكعبات صورة من الشرائح التحكم الأخرى حتى استكمال representi مكتبة الطيفينانوغرام جميع المكوره تم إنشاؤه، ثم قم بحفظ مكتبة الطيفية.
  3. بدء مشروع جديد ضمن برنامج التصوير متعدد الأطياف. حدد "المتعددة الأطياف (.im3)" لخيار تنسيق الصور و"Brightfield" لتنسيق العينة. أولا، تكوين المشروع عن طريق اختيار الخيارات المطلوبة: "نسيج القطاع"، "البحث الميزات"، "Phenotyping"، "نقاط" و "تصدير". في هذه المرحلة، يمكن تغيير دقة وضوح الصورة للإسراع وقت التحليل إذا رغبت في ذلك.

3. الأنسجة الإنقسام

  1. استيراد مكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها مسبقا وحدد كل المكوره ليتم تضمينها في التحليل.
  2. مكعبات صورة مفتوحة ليتم تضمينها في بيانات التدريب التي وضعتها تحديد الخيار "فتح صورة مكعب". لضمان دقة التدريب واختيار لا يقل عن 18٪ من إجمالي عدد الصور التي سيتم تحليلها. اختيار الصور التي تمثل جميع الحالات المرضية لزيادة دقة تجزئة. هذا جزء من الصور طدعا الصورة مجموعة التدريب من الصور.
  3. صور توازن اللون الأبيض في التدريب التي وضعتها اختيار أداة قطارة العين واختيار منطقة في صورة واحدة وهذا هو الأبيض.
  4. اختر زر "تقدم" للانتقال إلى تجزئة الأنسجة. استخدام "الأنسجة فئات" لوحة لاختيار أنواع الأنسجة ليتم تحليلها (أي "النسيج" و "غير الأنسجة"). لمزيد من الدقة توطين الأنسجة البروتين، وفئات النسيج متعددة يمكن استخدامها (أي. "ظهائر"، "سدى"، و "غير الأنسجة").
  5. البدء في إنشاء خوارزمية وتحديد فئات الأنسجة عن طريق الرسم حول مجموعات من الخلايا داخل الصور التدريب. عند الانتهاء من فئة الأنسجة واحدة، كرر لفئات الأنسجة الأخرى. تأكد من اختيار مجموعة من الخلايا داخل الصور التي هي سمة من هذا النوع فئة الأنسجة.
  6. كرر هذه العملية لجميع الصور ضمن مجموعة التدريب من الصور.
  7. حدد المكونات (المكوره) ليتم تضمينها في ترينينغ ل "نسيج مقتطع". عند إجراء تحليل الصور brightfield المناعية، وعادة بإدراج جميع المكونات في التدريب. تشمل وفرة الصور تلطيخ السلبية في التدريب ووضع لتجنب التحيز خلال هذه الخطوة.
  8. اختر "مقياس نمط" المناسب لتدريب مقتطع الأنسجة. تحت 20X التكبير، وعلى نطاق واسع نمط غير المناسب عادة. عند العمل مع الأنسجة مع الهندسة المعمارية الجميلة تحت أعلى التكبير، وعلى نطاق أصغر النمط هو أكثر ملاءمة.
  9. حدد "قطار نسيج مقتطع" الزر لبدء تدريب مقتطع الأنسجة. لاحظ دقة مربع المنبثقة التي تظهر يعكس نسبة بكسل داخل المناطق التدريب التي تصنف بشكل صحيح.
    ملاحظة: البرنامج يحاول باستمرار لتحسين دقة الخوارزمية حتى توقف يدويا. لقد أثبتنا سابقا أن التدريب على 18٪ من النتائج الصور في 97٪ من الدقة تدريب 12.
  10. بعد يتم تدريب مقتطع الأنسجة، واختيار القرار المناسب شريحة. يتوافق قرار شريحة إلى الوقت اللازم لصور الجزء، مع قرار الخشنة التي تتطلب وقتا أقل وقرار الغرامة التي تتطلب المزيد من الوقت.
  11. جزء من مجموعة تدريب كامل من الصور عن طريق النقر على "صور الشريحة". السماح لبرنامج الوقت الكافي لتطبيق الخوارزمية لجميع الصور التدريب. عند الانتهاء من مراجعة تدريب مجموعة من العثور على أي أنسجة المصنفة بشكل خاطئ مع خوارزمية التدريب الحالية.
  12. لضبط عملية تجزئة النسيج، إضافة، تحرير، أو إزالة مناطق التدريب الأنسجة. استخدام الخيار "حواف تقليم" إذا بكسل تمتد على حواف الفئة نسيج واحد إلى آخر. إذا أساء تصنيف مجموعات صغيرة من بكسل، ضبط عتبة على الحد الأدنى لحجم القطاع.
  13. عندما يتم الانتهاء من التعديلات، حدد "تقسيم الصور"، وهذا سوف إعادة تدريب مقتطع الأنسجة لإنشاء خوارزمية جديدة لتقسيم الأنسجة. الخوارزمية السابقةهو حفظها تلقائيا ويمكن إعادتها إلى إذا لزم الأمر.
  14. عندما ثقة مع نتائج خوارزمية تجزئة الأنسجة، وتقدم إلى تجزئة الخلية عن طريق اختيار زر "تقدم".

الإنقسام 4. خلية

  1. اختيار المقصورات التحت خلوية ليتم تضمينها في تقسيم الخلية. تأكد من أن "النواة" محدد مسبقا لاختيار "السيتوبلازم" أو "غشاء".
    ملاحظة: يجب فقط أن يتم اختيار "غشاء" تجزئة عندما أدرج بروتين علامة غشاء محددة في IHC، مثل E-كادهيرين.
  2. ضمن علامة التبويب "نوى"، وهناك العديد من الخيارات. تبدأ باختيار الإعدادات المناسبة للتجزئة النووية (راجع الخطوة 4.3). اختيار ما إذا كان سيتم إدراج فئات الأنسجة الفردية أو كل في تجزئة.
  3. حدد نهجا لتقسيم النووية
    1. حدد مباين "القائم بكسل (عتبة)" نهج لطريقة مبسطة للحصول على الخيرالنتائج دون معرفة الكثير عن إعدادات معالجة الصور.
      ملاحظة: هذا غالبا ما يجعل الخيار الأول جيد. عند اختيار هذا النهج "القائم بكسل (عتبة)" هو أكثر ملاءمة عندما يكون هناك موثوقة النووية مكافحة وصمة عار، في حين أن "وجوه وبناء" يجب أن تستخدم إذا كان هناك نقص في مباين النووية ثابت.
    2. حدد "بكسل القائم (عتبة)" نهج عندما يكون هناك مباين النووية يمكن الاعتماد عليها.
      ملاحظة: هذا النهج القائم على بكسل بحتة. ويمكن أيضا أن هذا النهج أن تستخدم لتحليل الاحتياجات الصورة الأخرى التي يمكن أن تكون راضية عن عتبة بسيطة، مثل الكشف عن بكسل ضمن فئة الأنسجة التي تلطخ إيجابية لوصمة عار IHC.
    3. اختيار النهج القائم على كائن إذا لم مباين النووية توفر تلطيخ ثابت ومحدد من الأجسام النووية، وهناك حاجة إلى نهج أكثر تقدما القائم على القياس الشكلي للكشف نوى.
    4. حدد "مكونات لتقسيم النووية"، "Nuclالأذن الحجم "، و" تنظيف "إذا كان المستخدم يرغب في زيادة تحديد إعدادات تجزئة النوى.
  4. تحديد المعلمات شكل السيتوبلازم
    1. حدد زر "تقدم" للانتقال إلى تقسيم السيتوبلازم.
      ملاحظة: هناك العديد من الخيارات ضمن تقسيم السيتوبلازم للاختيار من بينها. الخيار يسمى "المسافة الداخلية لنواة" هو بكسل القائم. وهو يعبر عن المسافة بين خارج النواة وداخل السيتوبلازم. زيادة هذه القيمة يقلل من احتمال أن إشارة النووية تجتاز في حجرة السيتوبلازم.
    2. اختر التالي، "المسافة الخارجي لنواة".
      ملاحظة: هذا هو أيضا بكسل القائم. المسافة الخارجي لنواة تعكس المسافة بين السطح الخارجي للنواة وخارج الخلية. يمكن تعيين هذه القيمة كبيرة أو صغيرة بما يكفي لتضمين أو استثناء إشارات غشاء إذا رغبت في ذلك.
    3. المقبل حدد "الحد الأدنى لحجم".
      ملاحظة: الحد الأدنى للحجم، عنصورةل مقرها، يعكس الحد الأدنى لحجم العينة السيتوبلازم ليتم تضمينها في التحليل. إذا كان حجم السيتوبلازم هو أصغر في خلية معينة مثل عندما يتم الخلايا معبأة بإحكام معا، يتم استبعاد هذا تقسيم السيتوبلازم من التحليل.
    4. حدد الخيار التالي، "مكون" مع "الابتدائية"، "الثانوية"، وحدد "التعليم العالي" كخيارات ثانوية.
      ملاحظة: وهنا يمكن للمرء أن يختار علامة السيتوبلازم محددة. على غرار تجزئة النووية، إذا تم استخدام علامة IHC هيولية محددة، وهذا العنصر يمكن أن تستخدم لتحديد السيتوبلازم من خلال إيجاد قيمة عتبة الحد الأدنى. وهذا يساعد في تحديد السيتوبلازم ولكن ليس من الضروري للتأكد من دقتها مقبولة.
    5. الانتقال إلى آخر الخيارات كلفه هو "غشاء". هنا، يمكن للمستخدم يحدد مقصورة غشاء مع علامة البروتين. اختيار "الابتدائية"، "الثانوية"، و / أو "التعليم العالي" لكل علامة محددة غشاء المستخدمة. ضبط "كامل مقياس يادال "للعثور على حد أدنى أو إيجابية لكل علامة على أغشية الخلايا.
    6. استمرار تحت علامة التبويب "غشاء" وحدد الخيار "الحد الأقصى لحجم الخلية".
      ملاحظة: هذه هي المسافة إلى قيمة الغشاء، بالبكسل، والذي يحدد الحد الأقصى لحجم الخلايا. قيمة 12 مناسبة عادة للصور التي اتخذت في 20X التكبير.
    7. بعد اختيار جميع الخيارات، حدد "تقسيم صورة" أو "الجزء جميع". تطبيق الإعدادات على الصور ومشاهدتها "فردي" أو في وضع "معرض".
      ملاحظة: ضبط الإعدادات وعتبات إذا لزم الأمر، وإعادة شريحة حتى راض عن نتائج خلية التجزئة في مجموعة التدريب من الصور.

5. Phenotyping من الخلايا

مطلوب دقيقة تجزئة الخلية من أجل الحصول على دقة phenotyping الخلية، وميزة phenotyping هو للتدريب: ملاحظة.

  1. استخدام "إضافة و# 34؛ زر لإضافة الظواهر إلى قائمة "الظواهر". يمكن للمستخدمين اختيار لون للالنمط الظاهري.
  2. انقر على "تحرير الظواهر" لتعيين النمط الظاهري للخلية. انقر على خلية معينة لإظهار القائمة المنسدلة، مما يسمح للمستخدم أن يختار النمط الظاهري ومن ثم المضي قدما. تحديد لا يقل عن خمسة (5) خلايا في كل النمط الظاهري من أجل المضي قدما. اختيار 25 أو أكثر من الخلايا من كل النمط الظاهري هو مطلوب لتحقيق أفضل النتائج.

6. يحرز IHC والتعاون التعريب

  1. اختيار "تقدم" للانتقال إلى "نتيجة IHC أو إذا" خطوة. اختيار "تصنيف الأنسجة" ليسجل.
    ملاحظة: الفئة نسيج واحد فقط يمكن أن سجل خلال تحليل معين، ولكن إذا تم النتائج المرجوة التهديف في فئة أنسجة أخرى، فإن التحليل يمكن أن يتكرر في وقت لاحق مع إعدادات مختلفة.
  2. اختيار المرجوة "يحرز" نوع.
    ملاحظة: الإيجابية يخلق اثنين من صناديق (الإيجابية والسلبية) للمكون من الفائدة، بينما يستخدم الإيجابية مزدوجة لتحليل شارك في التعريب. وتشمل الخيارات الأخرى 4-بن، 10 بن، و50 بن تحليلات علامة الاختيار.
  3. اختيار الخلية "مقصورة" لاستخدامها في يحرز التحليل.
  4. مماثلة لإيجاد حد أدنى للمكون النووي الرئيسي، حدد "عرض بيانات مكون" وتحرك المؤشر فوق الصور تدريبية لتجد المناسبة الكثافة البصرية العتبات الدنيا من تلطيخ للخلايا إيجابية للمكون (ق) من الفائدة.
  5. إذا كانت الخلايا الملون بشكل مكثف هي أن تكون مستبعدة، وانخفاض الحد الأقصى عتبة إلى مستوى مناسب. خلاف ذلك، استخدم زر السيارات لاختيار أقصى حد للتحليل.
  6. اختيار تدريب الصور ليسجل من أجل التحقق من صحة قيم العتبة.
    ملاحظة: سيتم إرجاع النسبة المئوية للخلايا داخل بن معين، ويمكن مقارنتها عن طريق التفتيش البصري أو العد والفرز اليدوي. مرة واحدة كاملة، حدد "المسبق" للشروع في خطوة "تصدير".
<ص الطبقة = "jove_title"> 7. تطبيق خوارزمية دفعة وتحليل

  1. اختبار الخوارزمية التي تم إنشاؤها من خلال تقسيم الأنسجة، وتجزئة الخلية، والقيم التهديف عن طريق تصدير البيانات لمجموعة التدريب. اتبع المطالبات لإنشاء مجلد جديد للدليل التصدير. حدد الصور والجداول المراد إنشاؤها وتدرج في التحليل. إجراء تحليل عن طريق اختيار "تصدير للجميع".
  2. ويتم تصدير الجداول في ملفات نصية مفصول ويمكن فتحها في معظم برامج تحليل البيانات.
  3. عندما التحليل الكامل، عرض البيانات تجزئة الخلية والتهديف للصور مع كل من تلطيخ ارتفاع وانخفاض لتقييم دقة الإعدادات.
  4. عندما راض عن إعدادات، وتطبيق الخوارزمية التي تم إنشاؤها من مجموعة التدريب من الصور لمجموعة كاملة من الصور من خلال تحليل دفعة واحدة. انقر فوق علامة التبويب "تحليل دفعة" وسيتم نسخ الخوارزمية فتح من المشروع النشط.
  5. اختيار دليل تصدير جديد وحدد الصور التي وطبلوفاق هي التي ينبغي إدراجها في التحليل. تحت خيار ملفات الإدخال، حدد "إضافة الصور" واختيار جميع الصور ليتم تضمينها في التحليل دفعة واحدة.
  6. إجراء تحليل عن طريق تحديد خيار "تشغيل". كما هو الحال مع تحليل مجموعة التدريب، وهذه الخطوة تتطلب كميات متفاوتة من الوقت، اعتمادا على إعدادات معينة وعدد من الصور المدرجة في التحليل.
  7. عند الانتهاء، تقدم إلى "مراجعة / دمج" علامة التبويب. يمكن تغيير الإعدادات الافتراضية دليل دفعة إلى دليل التصدير من التحليل دفعة وإذا رغبت في ذلك. حدد "تشمل جميع" وحدد "دمج" لإنشاء أوراق البيانات مع بيانات موجزة لتحليلها.

8. تحليل البيانات المصدرة

  1. فتح الجداول التي تم تصديرها في برنامج تحليل البيانات وإزالة أو إخفاء أعمدة البيانات التي لا تمت بصلة للتحليل، مثل الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم لكل مكون. البيانات الأولية المستخدمة في التحليل في متوسط ​​البصرية كثافة جolumn لكل عنصر.
  2. مراجعة تصدير خرائط التقسيم والصور الخام لتحديد أي عينات أو النوى TMA هي لاستبعادها من التحليل. الأنسجة القيم نسبة تساعد في تحديد ما إذا كان ينبغي شمل عينة أو لا، مع قطع التعسفي من <5٪ المستخدمة في معظم الأحيان لمعايير الاستبعاد.
  3. إزالة البيانات أو الصفوف التي تحتوي على عينات لا علاقة لها أن تستبعد من تحليل البيانات.
  4. استخدام البيانات البروتين الكمي للتحقيق تغييرات في الحالة المرضية أو العلاقة مع الخصائص اكلينيكية المرضية للمرض 12،18-21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الشكل 1، يتم تنفيذ التدريب على أنسجة البروستاتا إلى صور شريحة في الظهارية وانسجة أجزاء، جنبا إلى جنب مع مقصورة غير الأنسجة. باستخدام الظهارية غشاء علامة E-كادهيرين، تم إجراء تقسيم الخلية إلى فصل النواة، السيتوبلازم، وأجزاء الغشاء، كما هو موضح في الشكل (2).

في تجربة واحدة، كنا المضاعفة IHC للتحقيق في التعبير وتوط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدام المناعية التقليدية لتقييم التعبير البروتين محدودة، وأساليب ذاتية شبه الكمية للتحليل 22،23. وقد تم إنشاء منصات مسبقا لتحليل الإنتاجية العالية التعبير العلامات البيولوجية والتعريب. تجزئة مفصلة لكل من الأنسجة ومقصورات التحت خلوية يسمح للمستخدمين لدراسة التعبير العلامات البيولوجية، التعريب، وشارك في التعريب مع علامات أخرى من الفائدة. في دراسات سابقة، لقد أثبتنا فائدة IHC والتصوير متعدد الأطياف، وخاصة عندما تستخدم لدراسة البروتينات مترجمة إلى نفس 18،20،21 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر جامعة مبادرات البحوث بالحركة ولاية ويسكونسن في مختبر علم الأمراض، في جزء بدعم من وزارة UW علم الأمراض والطب المخبري ومنحة UWCCC P30 CA014520، لاستخدام التسهيلات والخدمات التي تقدمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تصنيف الزيلينفيشر للكيماوياتX3F1GALNFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار & ndash ؛ 3 ، التفاعل &ndash ؛ 0
الكحول الإيثيلي -200 دليلعلى تصنيف فيشر العلمي4355223NFPA: الصحة &ndash ؛ 0 ، النار &ndash ؛ 3 ، التفاعل & ndash ؛ 0
تريس بيسفيشر ScientificBP152-500تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار &ndash ؛ 0 ، التفاعل &ndash ؛ 0
تريس هيدروكسي ميثيل أمينوميثان هيدروكلوريكفيشر ScientificBP153-1تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار &ndash ؛ 0 ، التفاعل & ndash ؛ 0
Tween 20Chem-Impex1512تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 0 ، النار &ndash ؛ 1 ، التفاعل &ndash ؛ 0
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتفيشر ScientificBP2944-100تصنيف NFPA: الصحة – 1 ، النار & ndash ؛ 0 ، التفاعل &ndash ؛ 0
بيروكسيدازيدبيوكير الطبيةPX968تجنب ملامسة الجلد والعينين. قد يسبب تهيج الجلد وتلف العين.
مستقبلات هرمون الاستروجين ألفاثيرمو فيشر Scientific-LabvisionRM9101غير مصنفة على أنها
مستقبلات أندروجينSCBTsc-816غير مصنفة على أنها خطرة
CD147Biodesign P87535Mغير مصنفة على أنها خطرة
E-cadherinDakoM3612غير مصنفة على أنها خطرة
رينوار ريد Andibody المخففBiocare PD904وهو مصمم خصيصا للعمل مع الأجسام المضادة القائمة على تريس
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002اتخذ الاحتياطات العادية لاستخدام قدر الضغط
Barrier pen-Immuno Edge  Vector LabsH-4000
مجموعة تغيير الطبيعة - خطوة ElutionBiocareMedical DNS001Hغير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 Goat المضادة للأرانب HRP PolymerBiocare MedicalRHRP520غير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 الماعز المضادة للأرانب AP PolymerBiocare MedicalRALP525غير مصنفة على أنها خطرة
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP PolymerBiocare MedicalM3M530غير مصنف على أنه خطير
Betazoid DAB Chromogen KitBiocare MedicalBDB20041. من المعروف أن DAB مادة مسرطنة مشتبه بها.
2. لا تعرض مكونات DAB للضوء القوي أو أشعة الشمس المباشرة.
3. ارتد معدات وملابس الحماية الشخصية المناسبة.
4. قد يسبب DAB حساسية الجلد. تجنب ملامسة الجلد والعينين.
5. راقب جميع البيئة الفيدرالية والولائية والمحلية فيما يتعلق بالتخلص
مجموعة الاعوجاج الأحمر للكروموجينBiocare MedicalWR806Corcorive. حمض قد يسبب تهيج الجلد أو تلف العين.
طقم فينا جرين كروموجينبيوكير ميديكالBRR807ضار إذا ابتلع
باجوران مجموعة كروموجين أرجوانيبيوكير الطبيةBJP807سائل قابل للاشتعال. يحفظ بعيدا عن الحرارة واللهب والشرر. ضار عن طريق الابتلاع أو الامتصاص. تجنب ملامسة الجلد أو العينين وتجنب الاستنشاق.
القط هيماتوكسيلينبيوكيير الطبيةCATHEالأرجواني   الحل   مع   أ   خفيف   الخليك   حمض   (الخل)   رائحه.   مايو   be
  مزعج   إلى   الجلد   أو   العيون.   تجنب   الاتصال   مع   الجلد   و   العيون.   تجنب   ابتلاع.
XYL Mounting MediaRichard Allen8312-4تصنيف NFPA: الصحة &ndash ؛ 2 ، النار & ndash ؛ 3 ، التفاعل & ndash ؛ 0
1.5 CoverslipsFisher Brand22266858حواف حادة
حضانة (رطوبة)الغرفةعفا عليها الزمنعفاالعديد من البائعين المتاحين
استقرار الفرن الحراري- ThermC-4008-Q
الخلفية كاشف حجب المعاقبBiocare MedicalBP974لا يصنف هذا المنتج على أنه خطر.
برنامج inFormبرنامجPerkinElmerCLS135781برنامج التصوير الأساسي متعدد الأطياف المستخدم في برنامج Nuance للمخطوطة
برنامج PerkinElmerNuance EXالمستخدم في صنع مكتبات طيفية داخل مخطوطة
مجهر Vectra وماسح ضوئي للشرائحPerkinElmerVECTRAماسح ضوئي آلي للشرائح ومجهر للحصول على مكعبات صور IM3
خطرة الطبي من عليها الزمن

المراجع

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكيمياء النسيجية المناعية المتعددةتقدير كمية التعبير البروتينيتحليل التموضع المشترك للبروتيناتخوارزمية تقسيم الأنسجةإنشاء المكتبة الطيفيةطرق الكشف عن المواد الملونةالحصول الآلي على الصورتحليل المقصورات تحت الخلويةأنسجة استقصاء المؤشرات الحيوية
الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.