Method Article

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن الكوكسيلا البورنيتية

DOI:

10.3791/53839

⸱

April 18th, 2016

 , 
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> وصفنا هنا طريقة بسيطة للتضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة (LAMP) باستخدام الكواشف المجففة بالتجميد للكشف عن C. burnetii في عينات المرضى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكوكسيلا البورنيتية، وكيل يسبب حمى Q، هو البكتيريا داخل الخلايا إلزام. وقد وضعت PCR المقايسات التشخيص للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا والعينات السريرية. PCR يتطلب معدات متخصصة وتدريب المستخدمين واسعة نهاية، وبالتالي، فإنه ليس مناسبة للعمل الروتيني وخصوصا في منطقة محدودة الموارد. لقد قمنا بتطوير فحص بوساطة حلقة متساوي الحرارة التضخيم (LAMP) للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات من المرضى. يتم تنفيذ هذه الطريقة في درجة حرارة واحدة نحو 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة. حساسية هذا الاختبار LAMP هي مشابهة جدا لPCR مع حد الكشف عن حوالي 25 نسخة في رد الفعل. ويصف هذا التقرير إعداد رد فعل باستخدام الكواشف مجفف بالتجميد وتصور النتائج باستخدام اللون الأزرق hydroxynaphthol (HNB) أو مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع صبغة الإقحام الفلورسنت في رد الفعل. كانت الكواشف LAMP lyophiliزيد وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة شهر واحد دون فقدان للحساسية الكشف. هذا الاختبار مصباح قوي بشكل خاص لإعداد خليط التفاعل لا ينطوي على خطوات معقدة. هذه الطريقة مثالية للاستخدام في المناطق ذات الموارد المحدودة حيث حمى Q متوطن.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسلبية الغرام بكتيريا صغيرة الكوكسيلا البورنيتية هو العامل المسبب للحمى Q، وهو مرض حيواني المصدر في جميع أنحاء العالم. نظرا للتوزيع في جميع أنحاء العالم س حمى في والعدوى عالية من C. البورنيتية والموظفين العسكريين والمدنيين الأمريكيين المنتشرين في الخارج معرضون لخطر الإصابة بالعدوى في المناطق الموبوءة.

يظهر حمى Q في شكلين: الالتهابات الحادة والمزمنة. يعرض الحاد Q-حمى نفسه من أعراض تشبه أعراض الأنفلونزا، والتهاب الكبد، أو الالتهاب الرئوي، وعادة ما يكون المرض الذاتي الحد مع معدل وفيات منخفض. المزمنة حمى Q، في حين أن أقل انتشارا، وغالبا ما يؤدي إلى التهاب الشغاف، والتي لديها معدل وفيات أعلى من ذلك بكثير إذا تركت دون علاج 1،2. لذلك فإن التشخيص المبكر لتوجيه العلاج المناسب هو أمر حاسم لرعاية المرضى. وقد وضعت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي الكمي PCR (QPCR) فحوصات للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا وعينات سريرية 3-5 </ سوب>. كلا PCR وQPCR مكلفة وغالبا ما تكون غير متاحة بسهولة في المناطق ذات الموارد المحدودة للعمل الروتيني.

وصف الأصلية كتبت بواسطة Notomi 6، بوساطة حلقة التضخيم متساوي الحرارة (LAMP) يوفر طريقة الحمض النووي التضخيم بديل. يستخدم مصباح البلمرة بتوقيت جرينتش الحمض النووي حبلا النزوح توليف الحمض النووي جنبا إلى جنب مع مجموعات التمهيدي مصممة خصيصا تعترف لا يقل عن ستة أقاليم مستقلة عن الجينات المستهدفة. أهم ميزة من مصباح هو أن التضخيم يحدث في ظل ظروف متساوي الحرارة. لذلك، فقط مطلوب حمام مائي، كتلة التدفئة أو حاضنة. وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن عدة مسببات الأمراض ريكيتسي 7-9. التصور منتجات تضخيم الحمض النووي من قبل الكهربائي للهلام هو الأسلوب الأكثر دقة التي يمكن أن تفرق ايجابيات الحقيقية من ايجابيات كاذبة بسبب التضخيم غير محددة. ومع ذلك الإجراءات المتعلقة الكهربائي للهلام ليست عملية لع ذات الموارد المحدودةقمة شرق آسيا. وقد وضعت عدة طرق بديلة للكشف عن منتجات التفاعل. هذه البدائل، مثل تعكر المستمدة من تشكيل بيروفوسفات المغنيسيوم 10 أو باستخدام صبغة الفلورسنت الإقحام أن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 11،12 هم أكثر ملاءمة من تشغيل هلام. كانت الكواشف LAMP مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة الجو المحيط في البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية حيث حمى Q متوطن 13.

وقد تم تطوير فحص مصباح في مختبرنا للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات البلازما 14. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإعداد خليط التفاعل مصباح من الكواشف مجفف بالتجميد. الكواشف مجفف بالتجميد مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في RT. عندما جنبا إلى جنب مع وسيلة سهلة التصور، وهذا هو الأسلوب الأمثل لاستخدام للكشف عن C. البورنيتية في إعداد محدودة الموارد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد البلازميد الحمض النووي التخفيفات وفقا لمعايير رد الفعل LAMP

  1. استخدام معمل لقياس الكثافة الضوئية (OD) في 260 نانومتر لتحديد البلازميد (التي تحتوي على IS1111a الجين المستهدف من جيم البورنيتية RSA 493) تركيز الحمض النووي. وOD 260 من 1 يساوي 50 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي.
  2. تحويل مبلغ من البلازميد في عدد النسخ. منذ حجم البلازميد هو 6330 سنة مضت، والوزن الجزيئي لهذا البلازميد هو 4.1 × 10 6 ز (6330 بي بي س 649 ز / بي بي). تركيز الحمض النووي البلازميد هو 34.2 نانوغرام / ميكرولتر (كما هو محدد من الخطوة 1.1). 1 ميكرولتر من هذه عينة من الحمض النووي يحتوي على 34.2 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد، ما يعادل 5 × 10 9 نسخ (34.2 × 10 -9 ز / 4.1 × 10 6 GX 6.02 × 10 23) من الحمض النووي.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من البلازميد (5 × 10 9 نسخ / ميكرولتر) إلى 90 ميكرولتر من الماء لتخفيف 10 أضعاف لتقديم عينة من الحمض النووي من 5 × 10 8 نسخ / ميكرولتر.
  4. كرر الخطوة 1.3 لإعداد عينات من الحمض النووي من 5 × 10 7، 5 × 10 6، 5 × 10 5، 5 × 10 4، 5 × 10 3، 5 × 10 2، 5 × 10 1، و 5 × 10 0 نسخة / ميكرولتر.

2. إعداد قالب الحمض النووي من عينات لرد الفعل LAMP

  1. أداء استخراج الحمض النووي من عينات البلازما البشرية باستخدام طقم الحمض النووي مصغرة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام ما مجموعه 200 عينة ميكرولتر لاستخراج وأزل الحمض النووي المستخرج في حجم 20 ميكرولتر.

3. إعداد 2X العازلة LAMP رد الفعل

  1. مزيج 200 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 320 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 12 ميكرولتر من 1 M MgSO 4، 280 ميكرولتر من خليط dNTP (10 ملم لكل منهما) و 188 ميكرولتر من الماء لجعل 1 مل من العازلة 2X مصباح. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.

4. تنفيذ ستاندرد LAMP رد الفعل

  1. مزيج 12.5 ميكرولتر من 2X LAعازلة النائب (كما أعدت في الخطوة 3 و 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 20 ملي بوكل، 16 ملي MgSO 4، 20 ملم (NH 4) 2 SO 4، 0.2٪ تريتون X-100، 1.6 M trimethylglycine، 1.4 ملي خليط dNTP)، و 1.2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي، 1 ميكرولتر من بوليميريز بتوقيت جرينتش الحمض النووي (8 U / ميكرولتر)، و 5.3 ميكرولتر من الماء لجعل خليط التفاعل (20 ميكرولتر) في 0.2 مل أنبوب PCR.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي (من الخطوة 1 أو 2) إلى خليط التفاعل 20 ميكرولتر وتخلط جيدا.
  3. انهيار أنبوب واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو كتلة التدفئة. هذا هو أفضل درجة حرارة التفاعل التي سبق تحديدها.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 10X هلام تحميل لإنهاء رد فعل.
  5. تحميل 5 ميكرولتر من المنتجات رد فعل على هلام الاغاروز 2٪ ملطخة الإقحام وصمة عار الحمض النووي.
  6. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 35 دقيقة في المخزن 1X TBE.
  7. تصور النتائج وفقا لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

5. تنفيذ رد فعل مصباح مع المعادالكواشف

  1. مزيج 125 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 200 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 7.5 ميكرولتر من 1 M MgSO 4، 667.5 ميكرولتر من الماء لجعل 1 مل من العازلة إعادة. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.
  2. إزالة الأنابيب التي تحتوي على الكواشف مجفف بالتجميد من يختم كيس رقائق الألومنيوم. لا تستخدم الأنابيب إذا لم يتم ختم كيس من رقائق الألومنيوم أو إذا كان تالفا.
  3. إضافة 20 ميكرولتر من العازلة إعادة في كل أنبوب لاعادة تعليق الكواشف مجفف بالتجميد.
  4. مزيج من قبل pipetting عازلة صعودا وهبوطا 5 مرات. نلقي نظرة للتأكد من الانتهاء من إعادة وقف التنفيذ الكواشف مجفف بالتجميد. يجب أن تختفي مسحوق أبيض في الأنبوب.
  5. إضافة 5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (من الخطوة 1 أو 2) إلى الكواشف تشكيلها وتخلط جيدا.
  6. انهيار أنبوب واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو كتلة التدفئة.
  7. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 10X هلام تحميل لإنهاء رد فعل.
  8. تحميل 5 ميكرولتر من رد فعلالمنتجات للهلام الاغاروز 2٪ ملطخة الإقحام وصمة عار الحمض النووي.
  9. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 35 دقيقة في المخزن 1X TBE.
  10. تصور النتائج وفقا لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

6. تنفيذ LAMP رد الفعل مع إعادة إعماره العازلة التي تحتوي على HNB أو الفلورية الإقحام صبغ

  1. مزيج 125 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 200 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 7.5 ميكرولتر من 1 M MgSO 4، 7.5 ميكرولتر من 20 ملي HNB (أو 12.5 ميكرولتر من 100X صبغة الفلورسنت الإقحام) و 660 ميكرولتر (أو 655 ميكرولتر) من الماء ل جعل 1 مل من العازلة إعادة. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.
  2. استخدام المخزن المؤقت أعيد أعدت في قسم 6 إلى تكرار الخطوات 5،2-5،6.
  3. تصور النتائج وفقا لبالعين المجردة (رد فعل تحتوي على HNB) أو الأشعة فوق البنفسجية (رد فعل تحتوي على صبغة الفلورسنت الإقحام).

7. تنفيذ في الوقت الحقيقي LAMP رد الفعل مع الماسح الضوئي أنبوب

  1. إضافة 5 ميكرولتر الحمض النووي للreconstitutالكواشف الطبعة تحتوي على صبغة الإقحام الفلورسنت، أنبوب الوثيق وأدخله إلى الماسح الضوئي أنبوب.
  2. ضبط درجة الحرارة الحضانة عند 60 درجة مئوية. قياس مضان في 520 نانومتر لمدة 60 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكواشف LAMP مجفف بالتجميد داخل أنبوب 0.2 مل تحتوي على الحمض النووي بتوقيت جرينتش البلمرة، الاشعال، وdNTPs. ويستخدم 20 ميكرولتر من العازلة إعادة لإعادة تعليق الكواشف مجفف بالتجميد. ويبين الشكل 1 نتائج رد الفعل LAMP على المواد الهلامية الاغاروز مع الكواشف الطازجة والكواشف مجفف بالتجميد. كاشف مجفف بالتجميد لا يقلل من نشاطه. ردود الفعل مصباح من قبل كل من الكواشف التي أعدت يمكن الكشف عن 25 نسخة من قالب الحمض النووي. وي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سابقا، وضعنا حساس ونوعي مصباح فحص استهداف عنصر الإدراج IS1111a 14. وقد تم اختيار العنصر IS1111 لأنه حفظها للغاية بين سلالات مختلفة من C. البورنيتية ورقمه عالية النسخ (7-110) في البكتيريا (كلي 2006). وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها مصباح يمكن الكشف عن 25 نسخة من العنصر IS1111، والتي قد ربط إلى أقل من واحد نسخة الكروموسومات من الحمض النووي الكوكسيلا. في هذه الدراسة، تم مجفف بالتجميد بتوقيت جرينتش الحمض النووي بوليميري...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث من قبل مركز البحوث الطبية البحرية، والبحوث وحدة العمل 6000.RAD1.J.A0310. الآراء الواردة في هذا المقال هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية أو موقف وزارة البحرية، وزارة الدفاع، أو الحكومة الأمريكية. وي مي تشينغ هو موظف في حكومة الولايات المتحدة. وقد أعد هذا العمل كجزء من مهامها الرسمية. يوفر عنوان 17 USC §105 أن "حماية حق المؤلف تحت هذا العنوان لا تتوفر في أي عمل من حكومة الولايات المتحدة." العنوان 17 USC §101 يحدد عمل حكومة الولايات المتحدة كما عمل من قبل عضو في الجيش أو موظف في حكومة الولايات المتحدة إعدادها كجزء من الواجبات الرسمية لذلك الشخص.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
بادئات LAMPEurofins MWG operon10 نانومول ، خالية من الملحتسلسل صممه العميل
Bst DNA polymeraseNew England BiolabsM0275L8 وحدات / مل
10x Thermo polNew England BiolabsB9004S
dNTP خليطNew England BiolabsN0447L10 mM لكل
من BetaineSigma-AldrichB03005 م ، ثلاثي ميثيل جلايسين
كبريتات المغنيسيومسيجما-ألدريتشM3409-1ML1 م
10x BluejuiceInvitrogen10816-015جل تحميل العازلة
SYBR الأخضرInvitrogenS758510،000x ، تصور المنتجات في أنابيب
GelRedPhenix Research ProductsRGB-410310،000x ، تصور المنتجات في المواد الهلامية
الكواشف المجففة بالتجميدGene Reach
هيدروكسي نافثول الأزرقفلوكا33936-10G
ESEQuant أنبوب الماسحQiagenالكشف في الوقت الحقيقي
buffer الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LAMP AssayLyophilized ReagentsCoxiella BurnetiiQ Fever DetectionIsothermal AmplificationHydroxynaphthol BlueFluorescent Intercalating DyeTube ScannerResource Limited SettingsDNA Template

Related Articles