Method Article

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

DOI:

10.3791/53840

⸱

March 22nd, 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لتضخيم مواقع تكامل الفيروسات القهقرية من الحمض النووي الجيني للخلايا المصابة ، وتسلسل تقاطعات الفيروس المضيف المضخمة ، ثم تعيين هذه التسلسلات إلى جينوم مرجعي. نصف أيضا تقنيات لتحديد توزيع مواقع التكامل بالنسبة للتعليقات التوضيحية الجينومية المختلفة باستخدام BEDTools.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات القهقرية معرض تفضيلات التكامل التوقيع على كل من المستويين المحلي والعالمي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل ل(1) جيل من مكتبات متنوعة من مواقع التكامل فيروسات باستخدام PCR (LM-PCR) والتضخيم بوساطة ربط وتسلسل الجيل التالي (خ ع)، (2) رسم خرائط الموقع الجيني لكل virus- تستضيف ملتقى باستخدام BEDTools، و (3) تحليل البيانات الإحصائية لأهميتها. تجزئة الحمض النووي الجيني المستخرجة من الخلايا المصابة عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد أو صوتنة. بعد مناسبة الحمض النووي نهاية إصلاح، و تربط linkers المزدوج تقطعت بهم السبل على نهايات الحمض النووي، ويجري شبه متداخلة PCR باستخدام بادئات التكميلية لكل من طويلة تكرار محطة (LTR) نهاية الفيروس والحمض النووي رابط ligated. الاشعال PCR تحمل متواليات اللازمة لتجميع الحمض النووي خلال NGS، يلغي الحاجة إلى ربط محول منفصل. وتجري مراقبة الجودة (QC) لتقييم تفتيت الحمض النووي حجم التوزيع والتكيفإيه التأسيس الحمض النووي قبل خ ع. يتم تصفيتها ملفات الإخراج تسلسل LTR التي تحتوي يقرأ، وتسلسل تحديد LTR ورابط واقتصاص بعيدا. يتم تعيين قلص تسلسل الخلية المضيفة لجينوم مرجع باستخدام بلاط ويتم تصفيتها عن الهوية الحد الأدنى 97٪ إلى نقطة وحيدة في الجينوم المرجعية. هي تمحيص مواقع التكامل فريدة من نوعها لالنوكليوتيدات المجاورة (الإقليم الشمالي) تسلسل والتوزيع النسبي لمختلف الخصائص الجينومية. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات موقع تكامل عالية التعقيد يمكن بناؤها من الحمض النووي الجيني في ثلاثة أيام. وبالتالي يمكن إجراء بروتوكول بأكمله الذي يشمل التهاب فيروسي خارجي من خلايا نسيج الثقافة عرضة للتحليل الموقع التكامل في ما يقرب من 1-2 أسابيع. التطبيقات الحديثة لهذه التكنولوجيا تتعلق التحليل الطولي للمواقع التكامل من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دمج الحمض النووي الفيروسي (vDNA) في الجينوم الخلية المضيفة خطوة أساسية في دورة حياة فيروس. ويتم إنجاز التكامل من إنزيم مدمج الإنزيم الفيروسي (IN)، التي تنفذ عمليتين الحفازة متميزة تؤدي إلى إنشاء طليعة الفيروس إدراج مستقر 1. في مفارز إشراك طرفي vDNA الخطية التي يتم إنشاؤها من خلال النسخ العكسي، وتشكيل intasome العليا مع vDNA ينتهي عقد معا من قبل في متعدد القسيمات 2-4. في يشق 'ينتهي من vDNA المصب من 5'-CA-3 ثابتة "3 تسلسل في عملية تعرف باسم 3'معالجة تاركة راحة 3" ينتهي مع مجموعة الهيدروكسيل على رد الفعل في كل vDNA النهاية 5-8. يتم استيراد intasome في وقت لاحق الى نواة كجزء من التجمع كب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد مخزونات فيروس

ملاحظة: وصفت مخطط تدفق الجانب مقاعد البدلاء الرطب من هذا البروتوكول في الشكل 1 وتفاصيل إنتاج الأسهم الفيروسية والعدوى لاحق من خلايا نسيج الثقافة ينطبق عموما على أنواع مختلفة من الفيروسات. بالنسبة لبعض التجارب، والخلية المستهدفة قد لا تعبر عن مستقبلات الفيروسية الذاتية (ق)، وفي مثل هذه الحالات بناء جزيئات فيروس pseudotyped إيواء مغاير الفيروسي بروتين سكري مغلف، مثل بروتين سكري G من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)، سيكون مطلوب للعدوى 44،45.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 4 قوائم نتائج تجربة تمثيلية لتوضيح حساسية خ ع لاستعادة مواقع التكامل من ثقافة الخلايا المصابة. تم استخدام الحمض النووي الخلوي غير مصاب لتمييع متسلسل الحمض النووي الجيني من عدوى فيه كل خلية في المتوسط ​​تحتوي على التكامل واحد 40. تم إعداد التخفيفات في الخطوات من خمس إلى التخفيف إلى أقصى حد من 1: 15625. الحمض النووي الجيني في سلسلة المعايرة ثم تجزئة صوتنة أو عن طريق الهضم مع تقييد نوكلياز داخلي MseI وBglII، تليها LM.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول لتحليل مواقع التكامل فيروسات، من الخطوة عدوى فيروس الأولية من خلال رسم خرائط لأنماط توزيع الجينومية، وصفت. هذا البروتوكول ينطبق على أي الارتجاعي وأي نوع من الخلايا مصابة. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب فحص حساس جدا، مع القدرة على استعادة عدد كاف من مواقع التكامل فريدة من التخفيفات المسلسل يعادل الحمض النووي الجيني إلى أن عدوى بدأت مع وزارة الداخلية من 6.4 × 10 -5. هذه الحساسية يجعل بروتوكول مفيدة بشكل خاص عند تطبيقه على عينات من المرضى المصابين التي قد تحتوي ع.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لزملائنا ستيفن هيوز وهنري ليفين للحصول على المشورة التي كانت حاسمة لوضع بروتوكول NGS للفيروسات موقع التكامل التسلسل في المختبر Engelman. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح AI039394 وAI052014 (لمتفجرات نترات الأمونيوم) وAI060354 (مركز جامعة هارفارد للأبحاث الإيدز).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco11965-084وسط زراعة الخلايا القياسي ، متوافق مع الخلايا
HEK293T مصل الأبقار الجنينيThermo ScientificSH 30088.03قد تحتاج كميات مختلفة من المصل إلى الفحص المسبق للحصول على الإنتاج الفيروسي الأمثل
البنسلين / الستربتومايسينCorning30-002-Clالمضادات الحيوية لإضافتها إلى DMEM
Phosphate-Frozen SalineMediatech21-040-CVتستخدم لغسل الخلايا
التربسين EDTACorning25-053-CIتستخدم لفصل الخلايا الملتصقة عن ألواح زراعة الأنسجة
PolyJetSignaGenSL100688كاشف تعداء الحمض النووي
0.45 & micro ؛ م مرشحاتحراري علمي09-740-35Bتستخدم لتصفية وسائط زراعة الخلايا المحتوية على جزيئات الفيروس
Turbo DNaseAmbionAM2239تستخدم لتحلل الحمض النووي البلازميد المرحل من مخزونات الفيروسات
HIV-1 p24 Antigen Capture AssayABL Inc.5447تستخدم لتحديد إنتاجية إنتاج الفيروس
DNeasy Blood & مجموعة الأنسجةQiagen69506تستخدم لتنقية الحمض النووي الجيني من الخلايا
SonicatorCovarisS2مع هذا النموذج من الصوتنة أداء جولتين من دورة العمل ، 5٪ ؛ الكثافة ، 3 ؛ دورات لكل انفجار ، 200 ؛ الوقت ، 80 ثانية
ماء Nuclease الخاليمن Nuclease GeneMateG-3250-125يوصى بالمياه المتوفرة تجاريا لتقليل احتمالية التلوث المتبادل للعينة
QIAQuick PCR Purification KitQiagen28106تستخدم لتنقية الحمض النووي أثناء بناء المكتبة
End-It DNA End-It End-RepairKit EpicenterER81050تستخدم لإصلاح نهايات الحمض النووي لعينات الحمض النووي الصوتية
Klenow Fragment (3'-5' exo –)New England Biolabs (NEB)M0212Sتستخدم مع dATP إلى شظايا الحمض النووي التي تم إصلاحها من A-tail
dATPThermo ScientificR0141Deoxyadenosine triphosphate
MseINEBR0525Lتقييد نوكلياز داخلي لانقسام الحمض النووي الجيني
BglIINEBR0144Lنوكلياز داخلي لقمع تضخيم تسلسل HIV-1 U5
T4 DNA LigaseNEBM0202L / 6218إنزيم للانضمام التساهمي لنهايات الحمض النووي المتوافقة
DNA قليل النوكليوتيداتتقنيات الحمض النووي المتكاملةالمخصصةاطلب من الشركة تنقية oligos. تنقية HPLC كافية للحمض النووي < 30 نيوكليوتيدات PAGE تنقية الحمض النووي الأطول 
ميزة 2 مزيج البوليميرازClontech639202مزيج تجاري يحتوي على بوليميراز الحمض النووي ل PCR
dNTPs (محاليل 100 ملم)Thermo ScientificR0181تمييع المواد الكيميائية الأربع الموجودة على الجليد بالماء المعقم للوصول إلى التركيزات الوسيطة البالغة 2.5 ملي مولار لكل مقياس
الطيف الضوئي dNTP NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000لتقدير تركيز
الحمض النوويQubit FluorimeterLife TechnologiesQubit & reg; 3.0مقياس الفلور المستخدم لتأكيد تركيز الحمض النووي لمكتبة موقع التكامل
2200 نظام TapeStationAgilentG2964AAالفحص القائم على الشريط لتأكيد توزيع حجم الحمض النووي لمكتبة موقع
التكامل MiSeqIlluminaSY-410-1003المستخدمة في NGS
مختبرات تقييد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retroviral Integration SitesLigation mediated PCRNext generation SequencingGenomic DNA MappingRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

Related Articles