يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

15.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53846

⸱

مارس 25, 2016

 , 
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

في هذه المقالة

ملخص

العدلات هي أكثر أنواع خلايا الدم البيضاء وفرة. يتم وصف عزل العدلات عن دم الإنسان عن طريق طريقة فصل التدرج الكثافة وتمايز الخلايا النخاعية البشرية (HL60) على طول المسار الحبيبي هنا ؛ لاختبار دورها في حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للعوامل المضادة لسرطان الغدد الليمفاوية.

الملخص

العدلات هي أكثر أنواع خلايا الدم البيضاء وفرة (40٪ إلى 75٪) ومن بين الخلايا الالتهابية الأولى التي تهاجر نحو موقع الالتهاب. إنهم لاعبون رئيسيون في جهاز المناعة الفطري ويلعبون أدوارا رئيسية في بيولوجيا السرطان. تم اقتراح العدلات كوسطاء رئيسيين للتحول الخبيث ، وتطور الورم ، وتكوين الأوعية الدموية ، وفي تعديل المناعة المضادة للأورام. من خلال إطلاقها للعوامل القابلة للذوبان أو تفاعلها مع الخلايا السرطانية. لتوصيف الوظائف المحددة للعدلات ، يتم اختيار طريقة سريعة وموثوقة لعزل العدلات في المختبر عن دم الإنسان. هنا ، يتم إثبات طريقة فصل تدرج الكثافة لعزل العدلات وكذلك الخلايا أحادية النواة من الدم. يتكون الإجراء من وضع طبقات من محلول تدرج الكثافة مثل Ficoll بعناية فوق الدم المخفف الذي تم الحصول عليه من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بابيضاض الدم الليمفاوي المزمن (CLL) ، متبوعا بالطرد المركزي ، وعزل الطبقة أحادية النواة ، وفصل العدلات عن كرات الدم الحمراء بواسطة ديكستران ثم تحلل كريات الدم الحمراء المتبقية. ثبت أن هذه الطريقة تعزل العدلات ≥ 90٪ نقية. لتقليد البيئة المكروية للورم ، تم إجراء تجارب ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام مصفوفة غشاء القاعدية مثل Matrigel. نظرا لقصر عمر النصف للعدلات في المختبر ، لا يمكن إجراء تجارب ثلاثية الأبعاد مع العدلات البشرية الجديدة. لهذا السبب ، يتم تمييز خلايا HL60 النخاعية على طول المسار الحبيبي باستخدام محفزات التمايز ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وحمض الريتينويك (RA). الهدف من تجاربنا هو دراسة دور العدلات على حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للعوامل المضادة لسرطان الغدد الليمفاوية. ومع ذلك ، يمكن تعميم هذه الطرق لدراسة تفاعلات العدلات أو الخلايا الشبيهة بالعدلات مع مجموعة كبيرة من أنواع الخلايا في مواقف مختلفة.

المقدمة

تشكل الخلايا المناعية الفطرية نسبة أساسية من الخلايا داخل المكروية الورم وارتبطت مع خباثة الورم في المرضى والنماذج الحيوانية من السرطان 1. في الآونة الأخيرة، فقد أصبح موضع تقدير على نطاق واسع أن الاستجابات المناعية المزمنة تلعب أدوارا حاسمة في تعزيز تطور الورم، ورم خبيث ومقاومة الكيميائي 2. الضامة هي خلايا المناعة الفطرية الهامة التي ثبت لتنظيم مباشرة استجابة الخلايا السرطانية للعلاج الكيميائي 3،4. ومع ذلك، لا يعرف دور العدلات، اللاعبين الرئيسيين في نظام المناعة الفطري، في تنظيم استجابة الورم للعلاج مضاد للسرطان. أهداف هذه البروتوكولات هي استخدام طريقة سريعة وموثوق بها لفصل العدلات من عينات الدم CLL المريض وللتمييز خلايا HL60 على طول الطريق المحببات لدراسة دورها في تنظيم حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى وكلاء المضادة للسرطان الغدد الليمفاوية.

= "jove_content"> العدلات هي العنصر الخلوي الأكثر وفرة من نظام المناعة الفطري في الدم 5 ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة 6. العدلات دورا أساسيا في ارتفاع الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة بالإضافة إلى وظائف المستجيب المتغيرة في العديد من الحالات المرضية 7. لذلك، وهي طريقة سريعة وموثوق بها لعزل العدلات من خلايا الدم الأخرى، مثل طريقة الفصل التدرج الكثافة، مطلوب للدراسات في المختبر. وسوف تستخدم هذه الطريقة لعزل العدلات تسهيل إجراء مزيد من البحوث على وظائف مناعية بوساطة العدلات في الجسم الحي وخارج الحي.

القدرة على الحصول على مجموعات نقية من العدلات هي خطوة أولى مهمة للتحقيق في المرضى الذين يعانون من الأمراض المناعية 8. كثافة طريقة فصل الانحدار هو أسلوب المثالية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من الخلايا. وmethoد ينطوي على إضافة حل كثافة التدرج في الجزء السفلي من أنبوب يحتوي على الدم البشري المخفف تليها الطرد المركزي في 300 غ لمدة 35 دقيقة دون انقطاع. تظهر حلقة من الخلايا وحيدة النواة في واجهة والعدلات الموجودة أدناه السابق. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب الأخرى المتاحة مثل مجموعات العزلة المتعادلة التي هي أكثر تكلفة بكثير 9. وبالإضافة إلى ذلك، عزل العدلات من الدم البشري من قبل مجموعات تجارية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة إلى علامة السطحية النوعية للعدلات الإنسان، تزيد من خطر تنشيط الخلايا أو تمييز. يسمح كثافة طريقة فصل التدرج عزل العدلات في غضون فترة قصيرة من الزمن. ضمن نفس الخطوة، وأيضا فصل الخلايا وحيدات النوى واستردادها. إنها تقنية الأساسية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا نقية من أجل تحقيق السلامة الوظيفية.

من أجل تقليد microenv الورمironment، أجريت تجارب 3D. ونظرا لنصف عمر قصير العدلات في المختبر، والتجارب 3D مع العدلات الإنسان العذبة ليست نهائية. لهذا السبب، وبفعل البرولمفوسيت (HL60) الخلايا على التمايز إلى خلايا تشبه الخلايا المتعادلة باستخدام محرضات تمايز سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) وحمض الريتينويك (RA). وذلك باستخدام خلايا HL60 متباينة (HL60 فرق) منع وجود استجابات مختلفة من العدلات بسبب العزلة من مختلف الجهات المانحة.

في 3D المختبر تمثل نماذج ثقافة مرحلة وسيطة بين في المختبر نماذج 2D و في النماذج الحية. في ثقافة 2D، والخلايا المنتشرة على سطح البلاستيك تشكيل إرفاق ملفات خلية غير طبيعية للبروتينات المودعة التي التشويه والتحريف على هذا السطح الاصطناعية. على العكس من ذلك، فإن الخلايا في شكل ثقافة 3D إرفاق ملفات الطبيعية خلية خلية منذ الخلايا والمصفوفة خارج الخلية التي توليف هي المواد الطبيعية التي ترد فيها.لهذا السبب، ونماذج 3D شارك في ثقافة، خصوصا بين الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى، كانت مفيدة جدا للإشارة إلى مساهمتها في نمو الورم، الأوعية الدموية، والانبثاث. ونتيجة لذلك، والثقافات 3D جعل ثقافة خلية محاكاة الظروف الفسيولوجية التي توجد في الجسم الحي 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. العدلات عزل والمشارك الثقافة مع خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية

أجريت إجراءات بموجب موافقة لجنة ليون الأخلاق مستشفى مع جميع المرضى توقيع الموافقة المسبقة عن: ملاحظة.

  1. عزل خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية والعدلات
    1. جمع أنابيب من الدم المحيطي على EDTA (EDTA 1.8 ملغ لكل مليلتر من الدم) من المرضى الذين شخصت إصابتهم بسرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL).
    2. إضافة كل 15 مل من الدم إلى أنبوب 50 مل العقيمة وتمييع مع 15 مل RPMI (تخفيف 1: 1)، ثم بعناية وببطء إضافة 15 مل من كثافة حل الانحدار إلى أسفل الأنبوب دون خلط المراحل. ضمان أن الحل كثافة التدرج في RT لإعداد.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 35 دقيقة في RT ودون فرامل. يجب فصل الدم إلى أربع مراحل متميزة كما هو مبين في الشكل 1A، من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما وخلايا وحيدات النوى (ثحلقة هيت)، حل التدرج الكثافة، المحببة وكريات الدم الحمراء.
    4. جمع عصابة البيضاء التي تمثل خلايا اللوكيميا الأولية مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل الجديد.
      1. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم) تصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
      2. Resuspend وبيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
      3. Resuspend وبيليه مع المتوسطة RPMI كاملة (RPMI 1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ملغ / مل الستربتومايسين) لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    5. نضح المراحل العليا وترك مرحلة المحببة وكريات الدم الحمراء وإضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 25 مل ثم يضاف 3٪ ديكستران في 0.9٪ NaClup إلى 50 مل في المجموع. خلط الأنابيب 10 مرات والاحتفاظ بها لمدة 30 دقيقة في RT دون خلط.
    6. جمع العلوي RBC الفقراء طبقة العدلة لد وضعها في أنبوب مل العقيمة 50 نظيفة وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT. resuspend كل بيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة عازلة خلية تحلل الأحمر إلى 50 مل في المجموع.
    7. إبقاء الأنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في RT ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني (إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في المجموع) ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
    8. Resuspend والكريات مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد. الحفاظ 3 × 10 5 من كل نوع من الخلايا في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) في 5 أنابيب مل من البلاستيك لتحديد نقاء عزلتهم باستخدام التدفق الخلوي.
  2. تحليل عدد المورفولوجية من بالسكان خلية معزولة
    1. للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10 4 عدلات و 3 × 10 4 خلايا وحيدة النواة في 150 ميكرولتر كامل المتوسطة RPMI. تجميع الشرائح الزجاجية، وبطاقات الترشيح، وغرف العينة في جهاز الطرد المركزي cytospin، وضمان أن رانه الطرد المركزي غير متوازن.
    2. وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 10 دقيقة في RT إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
    3. وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
  3. اختبار نقاء خلايا معزولة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. تسمية الخلايا اللوكيميا الأولية المعزولة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). تسمية العدلات النقاء مع خليط من أضداد الإنسان المدرجة في الجدول 1 (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    2. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) من أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    3. resuspend كل بيليه في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
    4. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PerCP-Cy5.5 (695/40 BP )، PE (575/26 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، APC-Cy7 (780/60 BP). ضمان تعويض اللون.
  4. Coculture من خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية مع ذاتي العدلات
    1. البذور 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية وحدها أو مع العدلات ذاتي في 1:10 النسبة في المتوسط ​​RPMI كاملة. للقيام بذلك، وضبط أعداد الخلايا عن طريق تمييع تعليق خلية وإضافة 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية إلى 2 × 10 6 خلية / مل العدلات. مزيج بعناية.
    2. إضافة 25 ميكرومتر مثبط التيروزين كيناز بروتون (BTK) (ibrutinib) إلى الخلايا. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  5. خلية الحصاد وتحليل FACS
    1. كولإلخ الخلايا في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. غسل الكريات مع 1 مل PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    2. الكريات Resuspend في Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 10 دقيقة في RT. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 2A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP). ضمان تعويض اللون.

2. تمايز الخلايا HL60 على طول المحببات المسار وCoculture مع خلايا RL سرطان الغدد الليمفاوية B في 3D النموذجي

  1. تمايز البرولمفوسيت الإنسان (HL60) الخلايا إلى خلايا تشبه العدلات
    1. ضبط HL60 عدد الخلايا إلى 3 × 10 5 خلية / مل ثم يضاف 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO للحث على تمايز بهم. البذور كل 3 × 10 5 خلايا HL60 لكل بئر في لوحة 48-جيدا ثم احتضان لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    2. وفي وقت لاحق، وجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    3. ثم تمييع تعليق خلية في المتوسط ​​RPMI كاملة لضبط عدد الخلايا HL60 إلى 3 × 10 5 خلية / مل وحمل مرة أخرى التمايز من خلال إضافة 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO. البذور كل 3 × 10 5 HL60 الخلايا لكل بئر في لوحة 48-جيدا واحتضان لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. تحليل التمايز HL60 (HL60 فرق)
    1. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الكرية مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    2. لتحليل التغيرات في التعبير علامات سطح الخلية التدفق الخلوي. ضع كل 3 × 10 5 خلايا غير متمايزة HL60 (من ثقافة الخلية) و 3 × 10 5 HL60 الخلايا المختلفة في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    3. Resuspend والكريات في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪). تسمية الخلايا مع CD11b مكافحة الإنسان مترافق إلى AF700 أو CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend والكريات في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
    5. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة من 3A الشكل والتكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، اليكسا فلور 700 (730/45 BP).
    6. لاختبار التغيرات الشكلية في فرق HL60، لشل حركة الخلايا على الشرائح الزجاجية للفحص المجهري.
      1. للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10 4 خلايا غير متمايزة HL60 (من ثقافة الخلية) و 3 × 10 4 HL60 فرق في 150 ميكرولتر كاملة RPMI المتوسطة. تجميع الشرائح الزجاجية، وبطاقات الترشيح، وغرف العينة في جهاز الطرد المركزي cytospin، وضمان أن أجهزة الطرد المركزي متوازن.
      2. وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
      3. وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
  3. 3-الأبعاد (3D) الثقافة
    ملاحظة: تأكد من أن المواد المستخدمة في هذه التجربة باردة والتجربة تجري على الجليد.
    1. resuspend كل 5 × 10 4 خلايا RL، إما وحدها أو مختلطة مع فرق HL60 في نسبة RL: HL60 فرق 01:10، مع 300 ميكرولتر الغشاء القاعدي مصفوفة باستخدام 1 مل ماصة قطع مع مقص معقم من أجل توسيع الانفتاح على حوالي 2 إلى 3 مم. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة.
    2. البذور لكل 300 ميكرولتر من تعليق خلية / جيد في 24 لوحة جيدا. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ثم يضاف 1 مل إكمال RPMI المتوسطة لكل بئر واحتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تغيير المتوسطة كل يومين. إضافة 10 نانومتر الفينكريستين في يوم 5.
  4. تحليل FACS
    1. بعد 7 أيام من الثقافة، نضح المتوسطة ويغسل كل جيدا مع 1 مل PBS الجليد الباردة مرتين. إضافة 3 مل / جيد من الجليد الباردة PBS-EDTA (5 ملم). فصل جل من قاع البئر عن طريق كشط استخدام الجزء السفلي من 200 رأس ماصة ميكرولتر. يهز لوحة بلطف على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. نقل تعليق خلية في أنبوب معقم 15 مل ويهز أنابيب بلطف على جيمه لمدة 30 دقيقة أخرى. تحقق من ظهور التعليق الخلية متجانسة. (إذا لم يكن كذلك، ثم يهز الخلايا لوقت أطول أو إضافة المزيد من PBS-EDTA).
    3. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. و resuspend مع برنامج تلفزيوني-FBS (4٪) وعلامة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق PE-Cy7 والأجسام المضادة CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪)، ثم أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية.
    6. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 4A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP)، PE-Cy7 (780/60 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP). ضمان تعويض اللون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كثافة طريقة فصل التدرج الموصوفة هنا يوفر خلايا اللوكيميا الأولية والعدلات unstimulated عزل من دم المرضى CLL يمثل الشكل 1A طبقات الدم المختلفة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة (من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما، حلقة بيضاء تمثل الخلايا وحيدة النواة، التدرج الكثافة حل، المحببة وكريات الدم الحمراء). 1B الشكل و1C تظهر الاختلافات في مباراة شكلية بين العدلات (خلايا نوى متعددة الفصوص) والخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الموصوفة هنا، بروتوكول فعالة وبسيطة وسريعة وغير مكلفة لعزل العدلات من الدم البشري مع نقاء عالية باستخدام نهج الطرد المركزي التدرج الكثافة والواقعة في نفس الخلايا وحيدة النواة خطوة فهي أيضا مفصولة واستردادها. السكان خلية معزولة و≥90٪ نقية.

تتوفر لعزل العدلات من الدم البشري عدة طرق. وتشمل هذه الأساليب مماثلة باستخدام التدرجات متقطعة 11،12، أو باستخدام مجموعات تجارية لعزل العدلات عن طريق الانتقاء المناعية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (INCa-DGOS-4664).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI 1640 جيبكو إنفيتروجين21875-034
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو إنفيتروجين10270-106
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (يحتوي PBS على الكالسيوم والمغنيسيوم)جيبكو إنفيتروجين14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)تقنيات الحياة25030-024
بنسلين ستربتومايسين (Pen Strep)تقنيات الحياة15140-122
مثبط بروتون تيروزين كيناز (Btk) (إيبروتينيب)  CliniSciencesA3001
Vincristine القاعدة EG labo
BD Matrigel Biosciences354234وضعت في 4 o< / sup>C بين عشية وضحاها (O / N) قبل يوم التجربة
عازلة تحلل الخلايا الحمراء  BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll) PANBiotechP04-60500
Dextran سيجما ألدريتشD8906
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
حمض الريتينويكسيجما ألدريتشR2625
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتشA7906
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE5134
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)يوروميدكسS3014
ملحق V-FLOUS طقم تلوين روش11  988  549  001
كيت RAL 555 طقم تلطيخ Giemsa المعدلCosmos BiomedicalCB361550-0000
LSRII قياس التدفق الخلويBD Biosciences
الطرد المركزي الخلويThermo Scientific
Leica DMR-XA المجهرLeica Microsystems
مقياس السيلو Auto T4 Cell VivabilityCounter Nexcelom  علوم الحياة
مصفوفة غشاء BD

المراجع

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606(2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586(2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940(2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HL60 CD15 CD16 Matrigel
عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.