مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل S. venezuelae دورة الحياة عن طريق جهاز ميكروفلويديك

Streptomycetes هي البكتيريا التي تعيش في التربة التي تتميز بها دورة التنموية المعقدة التي تنطوي على تمييز الصرفي من ذلك، أفطورة متعددة الخلايا، مسح المغذيات إلى نائمة، جراثيم unigenomic ^1-3.

في ظل ظروف النمو المواتية، يبدأ بوغ نموذجية السبحية لتنبت قذف واحد أو اثنين من أنابيب الجرثومية (الشكل 1). هذه الأنابيب استطال استطرادا طرف وتنمو لتصبح شبكة خوطي متفرعة المعروفة باسم أفطورة الخضري. يتم توجيه النمو القطبي والمتفرعة خوطي من قبل DivIVA البروتين ضروري. هذا البروتين ملفوف لفائف هو جزء من مجمع حشوية كبير يسمى polarisome، وهو أمر حاسم لإدخال مواد جديدة خلية المغلف في الطرف تمتد ^4-7. خلال النمو الخضري، وخيوط خوطي تصبح مجزأة عن طريق تشكيل نادرة من ما يسمى عبر الجدران ^8. تشكيل هذه الجدران عبر إعادة ملازم بروتين زد، البروتين مثل تويولين هيكل الخلية التي لا غنى عنها لانقسام الخلايا في معظم البكتيريا ^9. في السبحية، ولكن هذه الخضري عبر الجدران لا تؤدي إلى انقباض وخلية خلية الانفصال، وبالتالي يبقى كتلة فطر كشبكة من المقصورات المخلوي مترابطة. وردا على الحد من المغذيات والإشارات الأخرى التي ليست مفهومة جيدا، خيوط جوي متخصص كسر بعيدا عن أفطورة الخضري وتنمو في الهواء ^3. تشييد هذه الهياكل يبدأ المرحلة الإنجابية للتنمية، وخلالها خيوط الجوي متعدد الجيني طويلة تصبح مقسمة إلى عشرات متساوية الحجم مقصورات prespore unigenomic. هو الدافع وراء هذا الحدث انقسام الخلايا الهائل من انقباض متزامن من حلقات بروتين زد متعددة داخل واحد ^2،10 خيوط مولد الأبواغ. اكتمال التمايز الصرفي من قبل الافراج عن نائمة، وجراثيم المصطبغة سميكة الجدران.

أحداث التنموية الرئيسية في دورة الحياة السبحية تتميز بشكل جيد ^1،3. ومع ذلك، ما يزال نادرة هي الخلايا البيولوجية الدراسات التي تستخدم مضان الوقت الفاصل بين المجهري لتوفير نظرة ثاقبة على العمليات التي تقوم عليها التحت خلوية التمايز، مثل ديناميات البروتين التوطين والحركة كروموسوم وانقسام الخلايا تسيطر تنمويا. وقد تم التصوير تعيش خلايا التنمية السبحية صعبة بسبب تعقيد دورة الحياة والخصائص الفسيولوجية للكائن الحي. وقد استخدمت الدراسات السابقة على النمو الخضري والمراحل الأولى من تحوجز تبوغ غرف التصوير الأكسجين منفذة، أو نمو المدعومة الاغاروز من السبحية coelicolor على خشبة المسرح المجهر ^11-15. هذه الطرق، ومع ذلك، محدودة بسبب عدد من العوامل. بعض الأنظمة لا تسمح التصوير على المدى القصير من النمو الخلويد البروتينات الفلورية قبل خلايا تعاني من عدم كفاية إمدادات الأوكسجين أو تنمو من طائرة الوصل بسبب نمط ثلاثي الأبعاد للتنمية خوطي. في الحالات التي يكون فيها التصوير على المدى الطويل هو ممكن، وزراعة الخلايا على منصات الاغاروز حدود المرونة التجريبية لأن الخلايا لا يمكن أن تتعرض لظروف النمو أو الإجهاد البديلة، ومضان الخلفية من المتوسط ​​في منصات الاغاروز يحد بشدة من قدرة على رصد أضعف الفلورسنت إشارات.

نحن هنا تصف بروتوكول للتصوير الخلايا الحية من دورة الحياة الكاملة السبحية بدقة ممتازة وحساسية. من خلال زراعة السبحية في جهاز ميكروفلويديك متصلة مضان widefield المجهر (الشكل 2)، ونحن الآن قادرون على رصد الإنبات والنمو الخضري وتحوجز تبوغ على مدى فترة زمنية تصل إلى 30 ساعة. ومما يسهل هذا كثيرا من استخدام السبحية نموذج حي الجديدة م> venezuelae لأنه sporulates إلى قرب الانتهاء في الثقافة المغمورة، وبالتالي يتغلب على الحد من الأنواع النموذج الكلاسيكي س. coelicolor، التي sporulates فقط على وسائل الاعلام الصلبة ^16-20. للمساعدة في تصور النمو الخضري وتبوغ، شاركنا في التعبير عن الموسومة fluorescently إصدارات DivIVA علامة الخلية القطبية والمفتاح البروتين انقسام الخلايا بروتين زد.

نحن نستخدم جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا التي استخدمت بنجاح لالمتفطرات، كولاي، الوتدية glutamicum، العصوية الرقيقة والخميرة ^21-25. نظام الفخاخ الخلايا في المستوى البؤري واحدة، وتتيح للسيطرة نضح المستمر من مستنبت من مختلف الخزانات. في بروتوكول مفصلة علينا أن نستفيد من هذه الميزة لفضح س. venezuelae أفطورة الخضري إلى بالاستعداد الغذائية لتعزيز تبوغ.

بروتوكول ديمكتوب هو للتصوير الخلايا الحية من دورة حياة السبحية بأكملها، ولكن الظروف وسائل الإعلام البديلة أو إعدادات المجهر ويمكن اختيار إذا مراحل نمو محددة ذات أهمية خاصة.

الشكل 2: رسم تخطيطي تصور التجريبي تدفق العمل. وتظهر الخطوات الرئيسية الثلاثة المذكورة في البروتوكول. أولا، يتم إعداد الجراثيم والمتوسطة أمضى من ثقافة مرحلة ثابتة. ثانيا، يتم تحميل جراثيم جديدة في نظام ميكروفلويديك وس. والتقط venezuelae طوال دورة حياتها التنموية باستخدام المجهر المقلوب مؤتمتة بالكامل مع غرفة الحضانة للحفاظ على درجة حرارة النمو المثلى. ثالثا، تحليل السلاسل الزمنية الفاصل بين الحصول على ومعالجتها باستخدام برمجيات المصدر المفتوح فيجي.

1. عزل الطازجة س. venezuelae الجراثيم وإعداد المتوسطة ثقافة المستهلك

1. تطعيم 30 مل المالتوز وخلاصة الخميرة و استخراج الشعير (حركة الشباب المجاهدين) المتوسطة، على أن تستكمل مع 60 ميكرولتر R2 حل العناصر النزرة (TE)، مع 10 ميكرولتر من الجراثيم SV60 سلالة [attB _{φ BT1} :: pSS209 (P _divIVA - divIVA-mcherry ف _{بروتين زد} -ftsZ-ypet)]. للنمو ثابت وتبوغ من الخلايا، واستخدام قارورة حيرة أو قارورة تحتوي على الربيع للسماح للتهوية كافية.
2. الخلايا ثقافة 35-40 ساعة عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
3. دراسة الخلايا عن طريق السائل شنت المجهر على النقيض من المرحلة. عند هذه النقطة شظايا فطر وجراثيم سوف تكون واضحة.
4. الطرد المركزي 1 مل الخلايا في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة في 400 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير المشيجة وشظايا خلية أكبر.
5. نقل ما يقرب من 300 ميكرولتر طاف التعاونntaining تعليق الجراثيم إلى أنبوب 1.5 مل جديد والحفاظ على الجليد. الحفاظ على مستنبت المتبقية للخطوة 1.7.
6. تمييع جراثيم 01:20 في حركة الشباب المجاهدين-TE (تركيز النهائي: 0،5-5 × 10 ⁷ أبواغ / مل)، والحفاظ على الجليد لحين الحاجة إليها (راجع الخطوة 2.3).
   ملاحظة: على الرغم من أن الظروف الدقيقة التي تؤدي تبوغ في السبحية غير مفهومة، وذلك باستخدام قضى المتوسطة حركة الشباب المجاهدين-TE، بما في ذلك أية إشارات الخلية غير معروف من ثقافة sporulating، ويحفز تكاثر.
7. فلتر تعقيم 10 مل من مستنبت المتبقية للحصول قضى حركة الشباب المجاهدين-TE خالية من الجراثيم وشظايا فطر. استخدام معقم 0.22 ميكرون تصفية المحاقن ونقل قضى حركة الشباب المجاهدين-TE إلى أنبوب 15 مل العقيمة.
8. حافظ على استعداد قضى حركة الشباب المجاهدين-TE لبضعة أيام في 4 درجات مئوية إذا تجارب إضافية باستخدام ظروف النمو المماثلة التي ستجرى.

2. إعداد الجهاز ميكروفلويديك

ملاحظة: كل جيش التحرير الشعبى الصينى ميكروفلويديكالشركة المصرية للاتصالات تمكن ما يصل إلى أربعة تجارب مستقلة التي يتعين الاضطلاع بها. لتجنب التلوث من الدوائر تدفق غير المستخدمة، واستخدام الحلول العقيمة وظروف العمل عند إعداد التجربة.

1. إزالة حل الشحن من لوحة ميكروفلويديك وشطف الآبار العقيمة مع حركة الشباب المجاهدين-TE.
2. إضافة 300 ميكرولتر حركة الشباب المجاهدين-TE إلى مدخل جيدا 1 و 300 ميكرولتر قضى حركة الشباب المجاهدين-TE إلى الآبار 2-6.
3. تحميل 40 ميكرولتر المخفف جراثيم من الخطوة 1.6 في الخلية تحميل جيدا 8 من حارة "A" وختم متعددة لوحة وفقا لتعليمات بتصنيع.
4. إطلاق برنامج للتحكم على microfluidics، حدد نوع لوحة المناسب ووضع برنامج تدفق لرئيس قناة تدفق وغرفة الثقافة التي تتدفق المتوسطة من الآبار مدخل 1-5 في 6 رطل لمدة 2 دقيقة لكل بئر.
5. في برنامج للتحكم على microfluidics، إنشاء بروتوكول تدفق للتجربة: تدفق حركة الشباب المجاهدين-TE من مدخل جيد 1 ل6 ساعات للسماح للإنبات والنمو الخضري للخلايا. تحولثم نضح من قضى حركة الشباب المجاهدين-TE من بئر 2-5 للمرة المتبقية من التجربة. خلال التجربة حفاظ على تدفق ضغط ثابت في 6 رطل (المقابل لحوالي 9 ميكرولتر المتوسطة / ساعة). بدء برنامج التدفق بعد خطوة 3.5.

3. إعداد للمجهر وبروتوكول الوقت الفاصل

ملاحظة: تم تنفيذ هذا الأسلوب على المجهر widefield مقلوب بمحركات تماما والآلية مزودة بكاميرا sCMOS، مصباح المعادن هاليد، وضبط تلقائي للصورة الأجهزة، حامل مرحلة لوحات 96-جيدا والغرفة البيئية.

1. قبل تدفئة الغرفة البيئية إلى 30 درجة مئوية في وقت مبكر من أجل منع حدوث مشاكل مع ضبط تلقائي للصورة بعد بدء التجربة. الوقت اللازم يعتمد على غرفة البيئية المستخدمة، والمجهر ونظام التدفئة. بدء لتسخين النظام في الليلة التي سبقت التجربة.
2. بدوره على المجهر وأتمتة الفحص المجهري والسيطرة softwaإعادة. استخدام الفتحة العددية (NA) هدف عالية الغمر النفط لجمع إشارة الأمثل والقرار المكانية، مثل 100X، 1.46 NA النفط هدف مدينة دبي للإنترنت. اختيار المرشحات المناسبة والمرايا مبصر اللونين للحصول على فرق تدخل النقيض (DIC) الصور والصور من اندماج البروتين أصفر فلوري والأحمر الفلورسنت.
3. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف وإضافة الغمر السائل إلى الجزء السفلي من الإطار التصوير على لوحة ميكروفلويديك لتحسين التركيز الخلية خلال الحصول على الصور. بعناية تركيب جهاز ميكروفلويديك مختومة (الخطوة 2.5) على خشبة المسرح من مجهر مقلوب. تأكد من أن لوحة وضعت بشكل آمن في حامل مرحلة ولا تحول على مدى التجربة.
4. جعل نافذة التصوير من غرفة الثقافة ميكروفلويديك إلى التركيز باستخدام علامات موقف جزءا لا يتجزأ من لالتوجه. التركيز على جزء أقصى اليسار من غرفة التدفق الأول (المسمى "A") مع حجم فخ 5، المقابلة لارتفاع فخ 0.7 ميكرون.
5. في البرنامج على microfluidics، خلايا الحمل من مدخل جيد 8 في 4 رطل لمدة 15 ثانية. تحقق من كثافة الخلايا في غرفة الثقافة عن طريق تحريك المرحلة عبر نافذة التصوير. إذا حوصر أي جراثيم، كرر الخطوة خلية التحميل أو بدلا من ذلك زيادة الضغط تحميل و / أو الوقت حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة (1-10 الجراثيم في نافذة التصوير مع 2048 س 2048 بكسل). تجنب إثقال غرفة الثقافة.
   ملاحظة: نحن عادة استخدام فخ حجم 5 لتصوير السبحية، ولكن لدينا أيضا الحصول على نتائج جيدة مع فخ أحجام 4 و 3. يرجى الرجوع إلى دليل المورد للحصول على اقتراحات إضافية على تحسين عملية خلية التحميل.
6. بدء تشغيل البرنامج التدفق في برنامج حاسوبي لمراقبة من الخطوة 2.5 والسماح لوحة ميكروفلويديك لتسخين-تتوازن لمدة 1 ساعة في المرحلة المجهر قبل البدء في الحصول على الصور.
7. في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، وتشكيل لاكتساب متعدد الأبعاد لاتخاذ موصور ltiple في مواقع متعددة المراحل على مر الزمن:
   1. لالحفظ التلقائي: تحديد دليل على الحفظ التلقائي للملفات الصور.
   2. للحصول على ضبط الإضاءة، تحديد إعدادات الإضاءة المثلى لكل بناء محددة مسبقا. للتجربة المذكورة، استخدم مرات التعرض التالية: مدينة دبي للإنترنت 150 ميللي ثانية، YFP 250 ميللي ثانية، طلب تقديم العروض 100 ميللي ثانية.
   3. لالسلاسل الزمنية: إنشاء سلسلة الوقت للحصول على الصور عند نقاط زمنية محددة في التسلسل. لتصوير دورة حياة س. venezuelae، حدد الفاصل الزمني 40 دقيقة على مدى 24 ساعة.
   4. لشغل وظائف المرحلة وضبط تلقائي للصورة: مسح غرفة الثقافة عن طريق تحريك المواقف مرحلة ومرحلة مخزن لكل وظيفة التصوير من الفائدة. تأكد من أن مواقف مرحلة واحدة تقع بعيدا بما فيه الكفاية لتقليل photobleaching من وphototoxicity.Typically استخدام ما يصل إلى 12 وظيفة. تشغيل روتين أوتوفوكس عن كل نقطة زمنية لتصحيح الانحراف البؤري بطيئة. إذا كان متوفرا في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، على وضع الاستراتيجيات ضبط تلقائي للصورة إلى "تحديث سطح المحلي من خلال ضبط تلقائي للصورة الأجهزة". وحالما يتم التحقق من الإحداثيات Z من المواقف مرحلة محددة، تفعيل خاصية التركيز التلقائي الأجهزة.
8. بدء التجربة مرور الزمن في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر.
9. تأكد من أن جميع المناصب مرحلة لا تزال في التركيز على نقاط في وقت لاحق. للتجارب الوقت الفاصل بين تشغيل أكثر من عدة ساعات، وأحيانا نلاحظ الانجراف المرحلة حتى عند استخدام ضبط تلقائي للصورة. إذا تحتاج إلى تركيز وظائف المرحلة، إيقاف التجربة في أي نقطة زمنية مناسبة، وضبط التركيز وإعادة التجربة ضمن فترة زمنية محددة التصوير (الخطوة 3.7.3). راجع الخطوة 4.3 لكيفية لسلسلة السلاسل الزمنية.
10. وقف الحصول على الصور بعد 24-30 ساعة أو عند خيوط في المنطقة من اهتمام ومتباينة في جراثيم (انظر مدينة دبي للإنترنت سلسلة صورة). وقف برنامج التدفق في البرنامج وتفكيك الجهاز ميكروفلويديك.
11. إعداد لوحة ميكروفلويديك تستخدم لستو على المدى القصيرالغضب. إزالة حركة الشباب المجاهدين-TE المتبقية وقضى حركة الشباب المجاهدين-TE من بئر 1-6، وأيضا النفايات فارغة 7 وكذلك خلية تحميل 8. تحت ظروف معقمة، وإعادة ملء تستخدم آبار حارة "A" والآبار الممرات غير المستخدمة ( "B" ل "D") على لوحة مع معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ختم لوحة مع بارافيلم لمنعها من الجفاف وتخزينها في 4 درجات مئوية.

4. الجيل الأفلام الوقت الفاصل عن طريق فيجي البرمجيات

ملاحظة: نلاحظ أن تختلف حزم البرمجيات التجارية والمجانية المتاحة لمعالجة الوقت الفاصل بين الصور المجهر بما في ذلك ZenBlue، Metamorph، الجليدية، ImagePro أو يماغيج. نحن هنا نركز على فيجي، وهو برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر على أساس يماغيج، والذي يوفر عددا من الإضافات المثبتة مسبقا مفيدة.

1. نقل البيانات التصوير من تجربتك مرور الزمن إلى الكمبيوتر الذي فيجي تثبيت.
2. إطلاق برنامج واستيراد ملف التصوير باستخدام و# 34؛ ملف> استيراد> بيو تنسيقات ". أو ببساطة عن طريق سحب الملف التصوير في فيجي في" بيو تنسيقات خيارات استيراد "، وضع علامة في مربع" قنوات تقسيم "للحصول على صورة كومة منفصلة لكل قناة الإضاءة (DIC ، طلب تقديم العروض، YFP).
3. اختياري: لدمج منفصلة السلاسل الزمنية الناتجة عن كسر في في الحصول على الصور بسبب إعادة تركيز (الخطوة 3.9)، فتح مداخن صورة منها، وتشغيل "صورة> الأكوام> أدوات> سلسلة" لكل قناة (DIC، طلب تقديم العروض، YFP ).
4. تقييم جودة البيانات في الوقت الفاصل بين طريق التمرير من خلال مداخن صورة. بحث عن خيوط التي بقيت في التركيز على مر الزمن، وتظهر نمو فطر وتشكل في نهاية المطاف جراثيم (DIC كومة). دراسة توطين التحت خلوية المتوقع لDivIVA-mCherry في نصائح خوطي (RFP كومة) وبروتين زد-YPet تشكيل عصابات واحد أو عدة هياكل، مثل سلم في الخضري أو خيوط مولد الأبواغ (YFP كومة)، على التوالي.
5. عزل المنطقة التي تهم اللازم المصبنانوغرام من الصور. الوقت الفاصل بين المجهري غالبا ما تنتج الملفات الكبيرة التي قد تبطئ المعالجة من قبل فيجي. لذا فمن المستحسن لتحديد وعزل المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ولأداء المزيد من الخطوات لمعالجة الصور على هذا الإصدار أصغر من المكدس صورة.
   1. حدد أداة "اختيار مستطيلة" في القائمة ورسم العائد على الاستثمار مستطيلة في كومة صورة مدينة دبي للإنترنت في مثل هذه الطريقة التي يتم تضمينه في خيوط النامية عن طريق العائد على الاستثمار في جميع أنحاء سلسلة صورة.
   2. تكرار العائد على الاستثمار كومة مع "السيطرة" + "التحول" + "D".
   3. انقر على شريط اسم كومة صورة YFP واختر "تحرير> اختيار> استعادة التحديد" في القائمة لاستعادة اختيار مستطيلة السابقة من مدينة دبي للإنترنت الأصلي كومة إلى نفس positon في كومة YFP وتكرار العائد على الاستثمار مع "السيطرة" + "التحول" + "D".
   4. كرر هذه العملية لكومة طلب تقديم العروض.
6. محاذاة الصور في صورة ثلاثية مداخن رس إزالة الانجرافات مرحلة في الطائرة س ص مع مرور الوقت. انتقل إلى الإطار الأخير في كومة مدينة دبي للإنترنت وحدد "المساعد> التسجيل> StackReg> RigedBody" من القائمة. كرر هذه الخطوة لطلب تقديم العروض وكومة صورة YFP. إذا لزم الأمر، والمحاصيل العائد على الاستثمار بتكرار الخطوة 4.5.1-4.5.3.
7. اختياري: ضبط السطوع والتباين يدويا لكل كومة صورة مع "ضبط أداة السطوع والتباين" ( "السيطرة" + "التحول" + "C") أو حدد "عملية> تعزيز التباين" من القائمة وتطبيق "تطبيع" الأوامر لجميع الصور في المكدس. وتجدر الإشارة إلى أن الأمر الأخير سوف يغير القيم بكسل، وبالتالي قد تؤثر على تحليل الصور المصب.
8. اختياري: الجمع بين أكوام الفردية (تحويلها إلى تنسيق ملف RGB، انظر 4.11) أفقيا أو رأسيا باستخدام البرنامج المساعد "صورة> الأكوام> أدوات> الجمع بين".
9. إضافة شريط مقياس ( "تحليل> أدوات> مقياس بار") والختام الوقت (&# 34؛ صورة> الأكوام> الوقت الختام ").
10. حفظ مداخن صورة تعديلها حسب تسلسل الصورة في شكل "TIFF.". لإنتاج الفيلم، حفظ باسم "افي". بدلا من ذلك، سلسلة صورة التصدير في شكل كويك تايم باستخدام "بيو تنسيقات> بيو تنسيقات مصدر" المساعد وحدد "وسائل التحقق" نوع الملف.
11. للحصول على الصور من الأطر واحد، حدد الإطار من الاهتمام وتكرار الصورة على "السيطرة" + "التحول" + "D". تغيير نوع الصورة الناتجة إلى "RGB" أو "8 بت" تحت عنوان "صورة> نوع> لون RGB أو 8 بت" وحفظ الصورة باسم "و tiff".
    ملاحظة: تقدم فيجي عددا من وظائف إضافية لمواصلة تعليم أو سلسلة عملية مرور الزمن. الذهاب إلى دعم فيجي على الانترنت للحصول على معلومات تفصيلية (http://fiji.sc/Fiji).

الناجح التصوير الخلية الحية من S. كامل دورة الحياة venezuelae غلة مستمر السلاسل الزمنية بما في ذلك مراحل النمو الرئيسية للإنبات والنمو الخضري وتبوغ (الشكل 3، فيلم 1). ومما يعزز التصور للتطور من خلال دورة حياة أبعد من ذلك توطين التحت خلوية متميزة من DivIVA-mCherry وبروتين زد-YPet. أثناء الإنبات والنمو الخضري، DivIVA-mCherry يتراكم على وجه الحصر في تزايد نصائح خوطي أو علامات تشكيل حديثا نقاط فرع الشكل (4A). هذه النتائج تتماشى مع المواقع التحت خلوية ذكرت سابقا من DivIVA 12،26. في المقابل، بروتين زد-YPet تشكل هياكل تشبه حلقة واحدة على فترات غير منتظمة في المشيجة تبعها (الشكل 4B). وتوفر هذه الهياكل السقالة لتركيب غير التضييقية الخضري الجدران عبر، مما يؤدي إلى تشكيل interconnالمقصورات خوطي ECTED 8. وتمايز الخلايا على النمو خيوط في خيوط مولد الأبواغ تصبح مرئية من قبل اختفاء القطبية بؤر DivIVA-mCherry، القبض على النمو القطبي ويصاحب ذلك زيادة في بروتين زد-YPet مضان (الشكل 4C). في sporulating خيوط، ونمط توطين بروتين زد-YPet يتغير بشكل كبير. الأولى حلزونية خيوط بروتين زد-YPet تعثر على طول خوط وبعد ذلك، في المفاجئ، حدث متزامن تقريبا، وهذه اللوالب تتجمع في سلم متباعدة بصورة منتظمة حلقات بروتين زد-YPet. في ظل الظروف التجريبية الموصوفة هنا، هذه موزعة بالتساوي سلالم بروتين زد-YPet تستمر لحوالي 2 ساعة. وأخيرا، تبوغ الحاجز تصبح مميزا في المقابل تدخل الفرق (DIC) صور (الشكل 4D) وفي النهاية يتم الافراج عن جراثيم جديدة.

بروتوكول لاحق واصفا معالجة الصور باستخدام تنص على البرنامج فيجي تيب بخطوة شرح لكيفية إنتاج فيلم للنشر من سلسلة مرور الزمن المكتسب (فيلم 1).

الشكل (3): صور لقطة من ممثل الوقت الفاصل بين مضان المجهر سلسلة من س. venezuelae إنتاج fluorescently المسمى بروتين زد (الخضراء) وDivIVA (الأحمر) أظهرت هي إطارات مختارة من الصور المدمجة (أعلى لوحة: طلب تقديم العروض-YFP-مدينة دبي للإنترنت، أسفل لوحة: DIC). تصور دورة حياة السبحية بما في ذلك الإنبات والنمو الخضري والتجرثم. وقد أخذت صور من الفيلم 1. الوقت في ساعة: دقيقة. على نطاق والحانات = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

د / 53863 / 53863fig4.jpg "/>
الشكل 4: نتائج الممثل لنجاح سلسلة الوقت الفاصل بين دورة حياة السبحية (A) توطين DivIVA-mCherry. المعروضة هي لقطات من يومين النقاط الزمنية اللاحقة من الفيلم 1 مع الصور المدمجة من طلب تقديم العروض والقنوات مدينة دبي للإنترنت. يصادف DivIVA-mCherry مواقع فرع خوطي الجديدة (شغل في رأس السهم) ويموضع في الطرف خوطي لتوجيه النمو القطبي (مفتوحة رأس السهم). شريط مقياس = 10 ميكرومتر (ب) بروتين زد-YPet توطين خلال النمو الخضري (رأس السهم). بروتين زد-YPet تشكل هياكل تشبه حلقة واحدة (لوحة العليا) التي لا انقباض (DIC، اللوحة السفلى). (C) بروتين زد-YPet (الأخضر) توطين خلال تحوجز تبوغ. وتظهر بؤر DivIVA-mCherry باللون الأحمر، مع الوقت المنقضي يصور أدناه (ساعة: دقيقة). مقياس شريط: 5 ميكرون. (D) الموافق صور مدينة دبي للإنترنت من خيوط sporulating من (C) والتي تبين شكلأوجه من المقصورات prespore مع الحاجز تبوغ مرئية (الصورة اليسرى)، والتي تستحق في نهاية المطاف إلى سلسلة من الجراثيم (الصورة اليمنى). الوقت في ساعة: دقيقة. مقياس شريط = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: الوقت الفاصل بين مضان المجهر سلسلة من السبحية venezuelae دورة الحياة ويتكون الفيلم من صور-طلب تقديم العروض YFP المدمجة (يسار) والمقابلة تدخل الفرق المقابل (DIC) صور (يمين). يظهر DivIVA-mCherry في الحمراء وبروتين زد-YPet باللون الأخضر. الفاصل الزمني بين الإطارات واحدة 40 دقيقة. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض ثيالصورة الفيلم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.