Method Article

بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لوصف توطين مستقبلات الأنجيوتنسين II من النوع 1 في دماغ الفئران عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي الكمي ، وقياس الكثافة ، في المختبر باستخدام نظير اليود 125 المسمى من الأنجيوتنسين II.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مستقبلات أنماط ملزمة للأنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني) في الدماغ الفئران باستخدام جين مشع معين لمستقبلات انج الثاني لأداء مستقبلات رسم الخرائط autoradiographic.

ويتم حصاد عينات الأنسجة وتخزينها في -80 درجة مئوية. ويستخدم ناظم البرد إلى قسم coronally النسيج (الدماغ) وذوبان الجليد يشن المقاطع على الشرائح المشحونة. يتم تحضين المقاطع الأنسجة محمولة على الشرائح في 125 I-SI-آنغ الثاني لradiolabel مستقبلات انج الثاني. يتم فصل الشرائح المجاورة إلى مجموعتين: "غير محددة ملزمة" (اس بي) في وجود مستقبلات تشبع تركيز غير رديولبلد انج الثاني، أو AT 1 آنغ الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 1 R) انتقائية انج الثاني مستقبلات و'توتال ملزمة "مع عدم وجود AT 1 R خصم. وهناك تركيز تشبع من AT 2 انج الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 2 R) خصم (PD123319، 10 ميكرومتر) موجود أيضا في incubatiعلى عازلة للحد 125 I-SI-آنغ الثاني ملزما للR النوع الفرعي AT 1. خلال 30 دقيقة قبل الحضانة في ~ 22 درجة مئوية، وتتعرض الشرائح برنامج الفضاء الوطني إلى 10 ميكرومتر PD123319 واللوسارتان، في حين أن 'توتال ملزمة "يتعرض الشرائح إلى 10 ميكرومتر PD123319. ثم يتم تحضين الشرائح مع 125 I-SI-آنغ الثاني في وجود PD123319 ل 'مجموع ملزمة "، وPD123319 واللوسارتان لبرنامج الفضاء الوطني في المخزن الفحص، تليها عدة" يغسل "في المخزن، والماء لإزالة الملح وغير ملزمة لجين مشع على وجه التحديد. يتم تجفيفها الشرائح باستخدام ضربة المجففات، ثم تتعرض لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام فيلم المتخصصة والكاسيت. تم تطوير الفيلم ويتم تفحص الصور إلى جهاز كمبيوتر لقياس كثافة بصرية والكمية باستخدام نظام التصوير الملكية والبيانات. مجموعة إضافية من الشرائح وثيونين-ملطخة للمقارنات النسيجية.

وميزة استخدام مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو القدرة على تصورآنج مستقبلات الثاني في الموقع، في قسم من عينة الأنسجة، وتشريحيا تحديد منطقة الأنسجة عن طريق مقارنتها إلى قسم المراجع النسيجي المجاور.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال مرض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز في الولايات المتحدة، مما تسبب في أكثر من 30٪ من الوفيات في الولايات المتحدة في عام 2011 1. إن الإحصاءات التي صدرت مؤخرا عن جمعية القلب الأمريكية تشير إلى أن أكثر من شخص واحد من كل ثلاثة لديها واحد أو أكثر من نوع من مرض القلب والأوعية الدموية. يستمر البحث القلب والأوعية الدموية لاتخاذ خطوات واسعة ضد فهم هذا المرض، ولكن عندما تبدأ الأجيال الحصول على كبار السن لا بد من مواصلة هذه الجهود. نظام رينين أنجيوتنسين (RAS) يلعب دورا مركزيا في تنظيم نظام القلب والأوعية الدموية في المقام الأول من خلال تعزيز تصلب الشرايين، والتهاب، تضيق الأوعية النظامية، وتفعيل الجهاز العصبي الودي (الشكل 1) 2-8.

وRAS هو نظام الهرموني الذي يتم تفعيلها عند الخلايا المجاورة للكبيبة الكلى تفرز الرينين في مجرى الدم استجابة لانخفاض ضغط الدم، وزيادة sympatالتحفيز hetic، أو انخفاض تدفق الصوديوم البقعة الكثيفة. الرينين يتأيض مولد الأنجيوتنسين (تصنيعه في الكبد) لتشكيل أنجيوتنسين الأول (آنغ لي). آنج لي ثم يتم استقلاب من قبل المحول للأنجيوتنسين انزيم (ACE)، وهو إنزيم خارجي على الجانب اللمعية من خلايا بطانة الأوعية الدموية، وخاصة في الرئتين والكليتين، لتشكيل أنجيوتنسين الثاني (آنج الثاني)، والببتيد المستجيب الرئيسي للRAS. آنج الثاني قادر على تفعيل نوعين مستقبل. مستقبلات نوع 1 (AT 1 R) ومستقبلات نوع 2 (AT 2 R)، على حد سواء التي تنظم نظام القلب والأوعية الدموية، والحفاظ على السوائل والكهارل التوازن وتعتبر الآن أن تؤثر على الوظيفة المعرفية والأمراض العصبية التنكسية العمليات 8،9. وتفيد التقارير ان، RAS في الدماغ محددة المحلي لتجميع مستقل انج الثاني. في الدماغ، ويتم تصنيعه في مولد الأنجيوتنسين البروتين السلائف في دبق نجمي الخلايا 10 تحويلها إلى آنغ لي من قبل مثل الرينين انزيم 3، ربما ملزمة prorenin لمستقبلات prorenin11، وبعد ذلك تحويلها إلى آنغ الثاني بواسطة انزيم المحول للأنجيوتنسين وهو ما يعبر عنه بكثرة على سطح الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ (12). هذا intrabrain ولدت آنغ الثاني هو ناهض للدماغ AT 1 وايه 2 المستقبلات التي يتم عزل من المنقولة عن طريق الدم انج الثاني.

في حين أن AT 1 R تلعب دورا هاما الفسيولوجية، وأفضل المعروف للآثار المرضية في جميع أنحاء الجسم، مما يؤثر في المقام الأول على نظام القلب والأوعية الدموية والكلى (الشكل 2). عندما يربط انج الثاني لAT 1 R، فإنه يتسبب تضيق الأوعية. زيادة المقاومة لتدفق الدم ورفع ضغط الدم. كما أنها تشجع على تخليق وإفراز الألدوستيرون وفاسوبريسين، مما يؤدي إلى زيادة الصوديوم واحتباس الماء. ويمكن لهذه الآثار أيضا لحث تلف في الدماغ الإقفاري وإدراكيا ويرتبط مرض باركنسون ومرض الزهايمر، وتنظيم السكرقسم التدريب والامتحانات، وكذلك يجري تحديدها مؤخرا أن تؤثر على التعلم والذاكرة 13-15. هناك حلقة مفرغة في RAS في هذا AT 1 R على الخلايا المجاورة للكبيبة في الكلى يحول دون إفراز الرينين. ومن المثير للاهتمام، وAT 2 R عموما مكافحة ينظم عمل AT 1 R، مما تسبب توسع الأوعية، ثمرة neurite، تجدد المحاور، ومكافحة انتشار الأسلحة النووية، وcerebroprotection ضمن أشياء أخرى كثيرة 16-20. كما تم تحديد AT 2 R كهدف لمكافحة ارتفاع ضغط الدم ومؤخرا، الأدوية المضادة للسرطان 21. تحديد توطين وكثافة من مستقبلات انج الثاني في الأنسجة المختلفة، وكيف تتأثر من قبل مختلف العلاجات والحالات المرضية باستخدام الكمي قياس الكثافة تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات سوف تساعد في الكشف عن الدور الذي لعبته RAS في أمراض معينة.

وقد استخدم مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي لأكثر من 30 عاما في وسيلة فعالة لتشير إلى وجود أنجيوتنسين الأولأنا مستقبلات وغيرها من مكونات RAS في الدماغ وغيرها من أنسجة الجرذان والفئران، خنزير غينيا، والكلب والإنسان في إطار مجموعة من الظروف التجريبية 22-34. أهمية تحديد مستقبلات انج الثاني داخل الدماغ هو أن واحدة يمكن تطبيقها التشريح الوظيفي لتصرفات انج الثاني في الدماغ، على سبيل المثال، فإن وجود AT 1 R في النواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد (PVN) يشير إلى وجود وظيفة من آنغ الثاني في الدماغ لتحفيز فاسوبريسين، الأوكسيتوسين أو الإفراج القشرية الافراج عن هرمون (CRH)، أو تفعيل الجهاز العصبي الودي. وهكذا، والأدوية التي تعمل على منع AT 1 R قد يقلل من بعض هذه الآثار بوساطة PVN المرتبط مع أكثر نشاط RAS الدماغ. التقدم في العمل يشير إلى أن استخدام AT 1 الخصوم R يمكن أن تقلل ما بعد الصدمة الإجهاد اضطراب (PTSD) الإفراج -induced من CRH ويخفف من أعراض اضطراب ما بعد الصدمة (هيرت وآخرون، قدم للنشر). وPVN، تحت القبوومن المعروف جهاز (SFO)، واللوزة لتنظيم التوازن، شهية / العطش والنوم والذاكرة، وردود الفعل العاطفية، وهي المناطق المستهدفة من هذه الدراسة مظاهرة. تم فحص هذه المناطق من خلال جمع أقسام الاكليلية من الدماغ على شرائح المجهر، وعلاج المقاطع مع مثبطات محددة جنبا إلى جنب مع لجين مشع معين لمستقبلات انج الثاني. في هذه الدراسة، يتم سرد، واستخدام كافة المواد والكواشف جنبا إلى جنب مع البائعين اقترح اليود 125 إلى radiolabel على مستقبلات انج الثاني، ساركوزين 1، آيسولوسين 8 انج الثاني (SI انج الثاني)، الذي كان آنذاك وتنقيته كما أحادية 125 I -SI انج الثاني باستخدام أساليب HPLC كما هو موضح سابقا (35). استخدام هذا جين مشع نشاط معين مرتفع يسمح التصور من مناطق منخفضة، متوسطة وعالية الكثافة مستقبلات بعد التعرض للأقسام رديولبلد إلى فيلم الأشعة السينية. من خلال معايرة الفيلم مع المعايير عجينة الدماغ التي تحتوي على كميات معروفة من اليود 125، ومبلغ محددمن آنغ الثاني مستقبلات ملزم في منطقة يمكن قياسها كميا. في الدراسات التجريبية، ومستقبلات انج الثاني ملزمة في أدمغة الاشخاص الخاضعين للتجارب يمكن مقارنة ذلك في أدمغة الأشخاص الخاضعين للمراقبة. يمكن أن تشير إلى هذا سواء يتم تغيير تصرفات انج الثاني ردا على حالة وراثية، شذوذ المظهري، دولة المرض أو العلاج من تعاطي المخدرات. ومن ثم يمكن تطبيق هذه المعرفة لتطوير علاجات لعلاج الأمراض المرتبطة ديسريغولاتيون من RAS. التقنيات البديلة التي تحدد مستقبل مواقع الربط، ولكن مع قرار خفض التشريحية، ملزمة المقايسات التي تستخدم الاستعدادات غشاء الأنسجة المستمدة من الخليط الأنسجة، والتي يتم تحضين مع لجين مشع على مجموعة من تركيزات لتقييم جين مشع تقارب ملزمة كما ثابت التفكك (K D ) وقدرة ملزمة القصوى (ماكس ب) من الأنسجة من الاهتمام.

بروتوكول صفها هنا يمكن تقسيمها إلى 5 المشارك الرئيسيmponents: إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. تعرض فيلم والتنمية؛ علم الانسجة؛ وقياس الكثافة تحليل الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت لهذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة جنوب شرق نوفا في اتفاق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، 8 الطبعة ال (الأكاديميات الوطنية الصحافة، واشنطن، DC، 2011 ).

1. إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي

  1. على التضحية، والحصاد أنسجة المخ جديدة، والتفاف في رقائق الألومنيوم وضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن. للحفاظ على الشكل الصحيح، ووضع العقول في قالب الدماغ الذي يحاكي داخل الجمجمة، والتفاف في رقائق الألومنيوم ومكان في - 20 درجة مئوية الفريزر. بعد 30 دقيقة، والأنسجة مكان في حقيبة التخزين المجمد اغلاقها باحكام والانتقال إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.
    1. الحصول على عينة الأنسجة الطازجة والمجمدة من الفائدة من الفريزر -80 درجة مئوية، ونقل إلى ناظم البرد لتعيين الحد الأدنى من -10 درجة مئوية والحد الأقصى من -18 درجة مئوية، لتجنب ذوبان الجليد.
    2. ضع العينة على الأنسجة جبل مع غليكول وراتنجات المتوسطة التضمين، فقط تضمين جزء صغير من العينة في المتوسط. لالدماغ، هي التي شنت الدماغ عموديا لتمكين باجتزاء في الطائرة الاكليلية.
  2. وضع الأنسجة جبل على مشراح داخل ناظم البرد وتشديد ثابتا في مكانه. ضمان الجانب الأيسر والأيمن من الدماغ هي في الإحداثيات انتيرو-postero نفسها، وأن محور ظهراني بطني هو الأطالس الدماغ عمودي على شائعة الاستخدام.
  3. تبدأ خفض في سمك المطلوب (20 ميكرون موصى به) وذوبان الجليد جبل المقاطع على الشرائح المجهر في الاتجاه العمودي أن يكون لها مساحة سطح أكبر مساحة في الشريحة. جمع المقاطع على الشرائح في مجموعات متتابعة من خمسة، أي أول مجموعة من الشرائح وصفت 1-1، 1-2، 1-3، 1-4، و1-5 (الشكل 3).
  4. بعد ملء مجموعة من الشرائح مع أقسام، تسمح الشرائح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 1 ساعة، ثم ضع سليقصر في مربع من البلاستيك الشريحة في حقيبة التخزين المجمد الختم الذاتي، ومخزن في -20 درجة مئوية.

2. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي

تنبيه: النشاط الإشعاعي. استخدام الملابس الواقية للتعامل مع النشاط الإشعاعي. ويعتمد التخلص عند إنشائها، ويجب أن تتبع مبادئ توجيهية للتسوس بشكل صحيح (نصف العمر 60 يوما) أو يتم انتقاؤها من قبل شركة معتمدة.

  1. إزالة الشرائح "-1" و "-2" من مصلحة من الثلاجة -20 درجة مئوية وجبل إلى السيطرة شريحة (الشكل 5). جبل "-1" الشرائح معا لتلقي العلاج "غير محددة"، و "-2" الشرائح ل"مجموعه" العلاج. الجرار "غير محددة" سيتضمن 10 ميكرومتر تركيزات النهائي من PD123319 على AT 2 R خصم، واللوسارتان على AT 1 R خصم، في المخزن فحص المتوسطة (AM5) (الجدول 1)، و "المجموع" سيحتوي الجرار ملزمة فقط 10 ميكرومتر PD123319 في AM5.
  2. عكس الشريحةالسيطرة على وضع الشرائح في الجرار Coplin مرحلة ما قبل الحضانة مليئة 35-40 مل من AM5، ومثبطات منها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدء مجموعات لاحقة في حمام مرحلة ما قبل الحضانة الخاصة بهم في 4 فترات دقيقة.
  3. على الفور نقل الشرائح من الحل الحضانة قبل لبريدية حضانة الشرائح، التي تحتوي على 10 مل من AM5، بالإضافة إلى تركيز محدد سلفا من 125 I-SI-آنغ الثاني (محسوبة في الشكل 4) مع مثبطات منها، ل60-90 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. إذا كان هناك جين مشع كاف، 10 الشرائح يمكن وضعها (العودة إلى الوراء) في السيطرة وتعديل الشرائح وحضنت مع 125 I-SI-آنغ الثاني في الجرار Coplin.
  4. مكان الشرائح مرة أخرى إلى السيطرة الشرائح (إذا لزم الأمر)، وصمة عار، وشطف من قبل يحوم برفق لمدة 1-2 ثانية في 400 مل من الماء المقطر في حاويتين منفصلة.
  5. نقل الشرائح بالتتابع إلى أربعة الجرار Coplin تحتوي على 35-40 مل من AM5 بالضبط 1 دقيقة لكل منهما (كما هو موضح في الشكل رقم 4 </ قوي>).
  6. بعد آخر 1 دقيقة شطف، دوامة بلطف الأقسام لمدة 1-2 ثانية في أربعة تغييرات من الجليد الباردة الماء المقطر.
  7. مجففا الشرائح مع الهواء البارد (تحذير: الهواء الساخن volatizes مجمع المشع) باستخدام أربعة مجففات الشعر اقامة من زوايا مختلفة لمدة 4 دقائق (الشكل 5)، حتى تكون جميع أقسام جافة، ثم وضع على منشفة ورقية.
  8. جبل الشرائح مع الأنسجة التي تواجه حتى على الورق المقوى لبدل إلى فيلم الأشعة السينية باستخدام الشريط مزدوجة من جانب.
  9. جبل واحد على الأقل، و 125 اليود معايرة الشرائح القياسية على كل من الورق المقوى (الشكل 6).
    ملاحظة: المعايير معايرة تتكون من عجينة الدماغ يخلط جيدا مع 125 اليود بد أن مجمعا يضم حلقة الفينول، ضغط بواسطة الطرد المركزي في حقنة 1 مل السلين، التي هي ناظم البرد مقطوع في سمك نفس أقسام الدماغ ومحمولة على ذوبان الجليد على المجهر الشرائح. بدلا من ذلك، 125 المعايير أنا المعايرة فيراتنج البلاستيك مقطوع في 20 سماكة ميكرون يمكن الحصول تجاريا. الراتنج البلاستيكية في هذه المعايير الدروع جزئيا الفيلم من الإشعاع بحيث يجب أن تؤخذ في معادلة أنسجة ~ 40٪ في المعايرة.

3. التعرض السينمائي والتنمية

  1. انتقل إلى غرفة مظلمة مع حزام الظهر كاسيت الأشعة السينية والفيلم تصوير الإشعاع الذاتي. فتح الكاسيت ووضع الورق المقوى مع الشرائح داخل (الشكل 6).
    1. تحويل الأنوار وتشغيل safelight. بعناية فتح مربع من فيلم الأشعة السينية، وإزالة فيلم واحد، ووضع الجانب اللامع الفيلم حتى (مع حافة خشنة في الزاوية اليمنى السفلى) على رأس الشرائح في الكاسيت. بعناية إغلاق الكاسيت، وتحريف الحانات قفل لاغلاق خارج الضوء (الشكل 6). كشف الشرائح لعدة أيام إلى عدة أسابيع في -20 درجة مئوية.
  2. في غرفة مظلمة، فتح الكاسيت والمضي قدما في فيلم تطوير بروكوفاق سطيف.
    1. ضع الشرائح في الصواني على التوالي. مطور لمدة 2 دقيقة، الماء الذي يحتوي على 5٪ حامض الخليك الجليدي لمدة 30 ثانية، ويتدخل لمدة 5 دقائق. الأفلام هي وضعها في علبة مع المياه الجارية لمدة 20 دقيقة، ثم وضعها في Photoflo لمدة لا تتجاوز 10 ثانية، وعلق.
      ملاحظة: يتم تحديد وقت التعرض تجريبيا ويمكن أن تنطوي على أفلام متعددة مع أوقات التعرض مختلفة: فترة طويلة بما فيه الكفاية للحصول على إشارات قابلة للقياس من المناطق مع انخفاض ملزمة، ولكن لا طالما لتشبع الفيلم من المناطق مع ارتفاع ملزمة. مرة واحدة يتم الحصول على التعرض مقبولة، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.

4. علم الأنسجة

  1. إعداد وصمة عار ثيونين والكواشف تلطيخ (الجدول 2، الشكل 7).
    1. وضع "-3" الشرائح في رف الشريحة، ونقل بالترتيب بدءا منزوع الأيونات الماء لمدة 1 دقيقة، ثم ثيونين حل وصمة عار لمدة 10 دقيقة تليها ثلاث الانخفاضات في deionمياه أوتوماتيكية، واحدة غسل 30 ثانية في الماء منزوع الأيونات.
    2. بعد الماء، وضع رف الانزلاق الى يغسل الايثانول على النحو التالي؛ 50٪، 70٪، و 90٪ لمدة 30 ثانية، تليها اثنين من يغسل الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لكل منهما. وأخيرا، وضع رف الشريحة في الزيلين لمدة 3 دقائق، ثم نقل الى حل زيلين الثاني لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة شريحة واحدة في وقت واحد من الحمام زيلين الماضي، وتغطية الحافة العلوية من الشريحة مع قاعدة الراتنج في المذيبات العضوية المتوسطة المتزايدة، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة على الشريحة. تسمح الشرائح لتجف بما فيه الكفاية ل~ 48 ساعة ثم مسح في الكمبيوتر في 2400 الرمادي نقطة لكل بوصة.

5. تحليل صورة قياس الكثافة

  1. وضع الجانب اللامع الفيلم إلى أسفل، مع حافة خشنة في الزاوية اليسرى السفلية والمسح الضوئي باستخدام ماسحة الملكية قادرة على نقل المعلومات كثافة الفيلم من دون أي تحريف في الكمبيوتر نظام التصوير.
  2. فتح تميز الكلية الملكية التصويرتيم والاستفادة من الحانات المعايرة لوضع معايير المعايرة لتحليل قياس الكثافة في المستقبل من الصور على فيلم (أرقام 9-12).
  3. المناطق قدر من الفائدة عن طريق إما إنشاء القالب أو تحدد تجريبيا مجالات الاهتمام. والبيانات التي تم جمعها وفصلها على أساس الفيلم، إما السيطرة أو النوع البري (قسم)، والمنطقة. تأكد من تضمين الكثافة (fmol / ز)، منطقة المسح الضوئي، ومجموع المنطقة المستهدفة في القياسات (الشكل 9).
    1. ضبط الحانات منطقة المسح الضوئي عن طريق ضمان أن المنطقة ذات الاهتمام يقع بين المعلمات من تسليط الضوء على (الشكل 10).
    2. تصدير البيانات إلى جدول (الجدول 4). مضاعفة مرات كثافة المساحة الإجمالية المستهدفة، ثم القسمة على منطقة المسح الضوئي من أجل الحصول على قيمة الربط في تلك المنطقة المحددة. حالما يتم ذلك لجميع القيم المقاسة، الركيزة التي أنشئت غير محددة من مجموع تسفر ع محددة ملزمةتستاء. ويمكن أيضا أن يؤديها المتوسطات لهذه القيم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر محة عامة عن المسار الأيضي للنظام رينين أنجيوتنسين في الشكل (1) والتركيز المباشر على أنواع فرعية مستقبلات الأنجيوتنسين الثاني (AT 1 R وايه 2 R) الموضح في الشكل 2 الشكل 3 يعرض نقل الدماغ الاكليلية أقسام على الشرائح المجهر، التي يتم تشغيلها بعد ذلك من خلال إجراء مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام تركيز 125 I-سيانغ الثاني سلفا كما رأينا في الشكل 4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويحدد بروتوكول صفها التصور من "مجموع" و "غير محددة" ملزمة للجين مشع في المقاطع المتجاورة من أقسام الاكليلية من الدماغ القوارض من قبل حصادها وتخزينها في -80 درجة مئوية، ويمكن أن تكون قابلة للتطبيق بسهولة إلى كل الأنسجة التي حلت تشريحيا الأساسات التي تعرض كميات التفاضلية من المستقبلات أو مواقع لجين مشع ملزمة. الإجراءات الموضحة ضمن بروتوكول بسيطة وتحليل أمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج بشكل صحيح. تم تحديد سماكة 20 ميكرون لتكون الأمثل. إذا كان المقطع سميكا جدا وغير ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قام روبرت سبيث بترخيص الأجسام المضادة لمستقبلات الأنجيوتنسين II لبائع تجاري ويتلقى إتاوات من بيع الأجسام المضادة المذكورة. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة HL-113905

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 مل أكواب بلاستيكيةفيشر02-591-30
24 مم × 60 مم أغطيةفيشر22-050-25
فيلم تصوير التصوير الشعاعي الذاتي 24 مم × 30 سمفيلم Carestream-Biomax MR891-2560
Bacitracin (من Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
8 × 11لوحة توضيح الهلال #201201
مجففات شعر كوبلين برطماناتفيشر ScientificE94
مجففات شعر تجاريةكونيرموديل SD6X
أنابيب ثقافة يمكن التخلص منهافيشر14-961-26
EDTA (ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات)USB Corporation15-699
الإيثانولفيشر16-100-210   ؛
بديل الوصفات ل D-19 DeveloperPhotographers Formulary, Inc. 01-0036
حمض الخليك الجليديفيشرA38 SI-212
Histoprep / OCTFisherSH75-125D
Film FixerKodak5160320
Photo floKodak1464502
LosartanFisher / Tocris37-985-0
MCID & trade ؛ Core 7.0MCIDN / A
NaClFisherS271
مقابض منزلقة Peel-A-WayVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
شرائح مشحونة فاخرة ، شرائح مجهر بريمير بحافة الأرضالدقيقة 9308W
125I LigandsPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II جامعة جورج واشنطنباليود المشع بواسطة الدكتور سبيث
سلايد ميلرزفيشر العلميHS15986
الصوديوم ثنائي القاعدة الفوسفات اللامائي (Na2< / sub>PO4)فيشرRDCS0750500
أسيتات الصوديوم (اللامائية)فيشرBP333-500
Thionin فيشرT409-25
كاسيت الأشعة السينية (10 × 12)شركة SpectronicsCorporation Four Square
XyleneFisher  X3P-1GAL
ورقة من الورق المقوى

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles