بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لوصف توطين مستقبلات الأنجيوتنسين II من النوع 1 في دماغ الفئران عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي الكمي ، وقياس الكثافة ، في المختبر باستخدام نظير اليود 125 المسمى من الأنجيوتنسين II.

الملخص

يصف هذا البروتوكول مستقبلات أنماط ملزمة للأنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني) في الدماغ الفئران باستخدام جين مشع معين لمستقبلات انج الثاني لأداء مستقبلات رسم الخرائط autoradiographic.

ويتم حصاد عينات الأنسجة وتخزينها في -80 درجة مئوية. ويستخدم ناظم البرد إلى قسم coronally النسيج (الدماغ) وذوبان الجليد يشن المقاطع على الشرائح المشحونة. يتم تحضين المقاطع الأنسجة محمولة على الشرائح في ¹²⁵ I-SI-آنغ الثاني لradiolabel مستقبلات انج الثاني. يتم فصل الشرائح المجاورة إلى مجموعتين: "غير محددة ملزمة" (اس بي) في وجود مستقبلات تشبع تركيز غير رديولبلد انج الثاني، أو AT ₁ آنغ الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT ₁ R) انتقائية انج الثاني مستقبلات و'توتال ملزمة "مع عدم وجود AT ₁ R خصم. وهناك تركيز تشبع من AT ₂ انج الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT ₂ R) خصم (PD123319، 10 ميكرومتر) موجود أيضا في incubatiعلى عازلة للحد ¹²⁵ I-SI-آنغ الثاني ملزما للR النوع الفرعي AT _1. خلال 30 دقيقة قبل الحضانة في ~ 22 درجة مئوية، وتتعرض الشرائح برنامج الفضاء الوطني إلى 10 ميكرومتر PD123319 واللوسارتان، في حين أن 'توتال ملزمة "يتعرض الشرائح إلى 10 ميكرومتر PD123319. ثم يتم تحضين الشرائح مع ¹²⁵ I-SI-آنغ الثاني في وجود PD123319 ل 'مجموع ملزمة "، وPD123319 واللوسارتان لبرنامج الفضاء الوطني في المخزن الفحص، تليها عدة" يغسل "في المخزن، والماء لإزالة الملح وغير ملزمة لجين مشع على وجه التحديد. يتم تجفيفها الشرائح باستخدام ضربة المجففات، ثم تتعرض لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام فيلم المتخصصة والكاسيت. تم تطوير الفيلم ويتم تفحص الصور إلى جهاز كمبيوتر لقياس كثافة بصرية والكمية باستخدام نظام التصوير الملكية والبيانات. مجموعة إضافية من الشرائح وثيونين-ملطخة للمقارنات النسيجية.

وميزة استخدام مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو القدرة على تصورآنج مستقبلات الثاني في الموقع، في قسم من عينة الأنسجة، وتشريحيا تحديد منطقة الأنسجة عن طريق مقارنتها إلى قسم المراجع النسيجي المجاور.

المقدمة

لا يزال مرض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز في الولايات المتحدة، مما تسبب في أكثر من 30٪ من الوفيات في الولايات المتحدة في عام 2011 ^1. إن الإحصاءات التي صدرت مؤخرا عن جمعية القلب الأمريكية تشير إلى أن أكثر من شخص واحد من كل ثلاثة لديها واحد أو أكثر من نوع من مرض القلب والأوعية الدموية. يستمر البحث القلب والأوعية الدموية لاتخاذ خطوات واسعة ضد فهم هذا المرض، ولكن عندما تبدأ الأجيال الحصول على كبار السن لا بد من مواصلة هذه الجهود. نظام رينين أنجيوتنسين (RAS) يلعب دورا مركزيا في تنظيم نظام القلب والأوعية الدموية في المقام الأول من خلال تعزيز تصلب الشرايين، والتهاب، تضيق الأوعية النظامية، وتفعيل الجه....

البروتوكول

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت لهذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة جنوب شرق نوفا في اتفاق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، 8 الطبعة ^ال (الأكاديميات الوطنية الصحافة، واشنطن، DC، 2011 ).

1. إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي

1. على التضحية، والحصاد أنسجة المخ جديدة، والتفاف في رقائق الألومنيوم وضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن. للحفاظ على الشكل الصحيح، ووضع العقول في قالب الدماغ الذي يحاكي داخل الجمجم....

النتائج

يظهر محة عامة عن المسار الأيضي للنظام رينين أنجيوتنسين في الشكل (1) والتركيز المباشر على أنواع فرعية مستقبلات الأنجيوتنسين الثاني (AT ₁ R وايه ₂ R) الموضح في الشكل 2 الشكل 3 يعرض نقل الدماغ الاكليلية أقسام على الشرائح المجهر، التي يتم تشغيلها بعد ذلك من خلال إجراء مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام تركيز ¹²⁵ I-سيانغ الثاني سلفا كما رأينا في الشكل 4

المناقشة

ويحدد بروتوكول صفها التصور من "مجموع" و "غير محددة" ملزمة للجين مشع في المقاطع المتجاورة من أقسام الاكليلية من الدماغ القوارض من قبل حصادها وتخزينها في -80 درجة مئوية، ويمكن أن تكون قابلة للتطبيق بسهولة إلى كل الأنسجة التي حلت تشريحيا الأساسات التي تعرض كميات التفاضلية من المستقبلات أو مواقع لجين مشع ملزمة. الإجراءات الموضحة ضمن بروتوكول بسيطة وتحليل أمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج بشكل صحيح. تم تحديد سماكة 20 ميكرون لتكون الأمثل. إذا كان المقطع سميكا جدا وغير .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
500 مل أكواب بلاستيكية	فيشر	02-591-30
24 مم × 60 مم أغطية	فيشر	22-050-25
فيلم تصوير التصوير الشعاعي الذاتي 24 مم × 30 سم	فيلم Carestream-Biomax MR	891-2560
Bacitracin (من Bacillus licheniformis)	Sigma	B-0125
8 × 11	لوحة توضيح الهلال #201	201
مجففات شعر كوبلين برطمانات	فيشر Scientific	E94
مجففات شعر تجارية	كونير	موديل SD6X
أنابيب ثقافة يمكن التخلص منها	فيشر	14-961-26
EDTA (ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات)	USB Corporation	15-699
الإيثانول	فيشر	16-100-210   ؛
بديل الوصفات ل D-19 Developer	Photographers Formulary, Inc.	01-0036
حمض الخليك الجليدي	فيشر	A38 SI-212
Histoprep / OCT	Fisher	SH75-125D
Film Fixer	Kodak	5160320
Photo flo	Kodak	1464502
Losartan	Fisher / Tocris	37-985-0
MCID & trade ؛ Core 7.0	MCID	N / A
NaCl	Fisher	S271
مقابض منزلقة Peel-A-Way	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
شرائح مشحونة فاخرة ، شرائح مجهر بريمير بحافة الأرض		الدقيقة 9308W
125I Ligands	Perkin Elmer	NEX- 248
125SI-Ang II	جامعة جورج واشنطن	باليود المشع بواسطة الدكتور سبيث
سلايد ميلرز	فيشر العلمي	HS15986
الصوديوم ثنائي القاعدة الفوسفات اللامائي (Na2< / sub>PO4)فيشر		RDCS0750500
أسيتات الصوديوم (اللامائية)	فيشر	BP333-500
Thionin	فيشر	T409-25
كاسيت الأشعة السينية (10 × 12)	شركة Spectronics	Corporation Four Square
Xylene	Fisher	X3P-1GAL

ورقة من الورق المقوى