مقالة منهجية

خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا

DOI:

10.3791/53914

⸱

مايو 21, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طرقا لبناء أقطاب كهربائية لتسجيل النشاط العصبي خارج الخلية في وقت واحد وإطلاق مواد عصبية متعددة بالقرب من مواقع التسجيل في الفئران المستيقظة. تسمح هذه التقنية بالتحليل التفصيلي للمدخلات المشبكية المحلية المفترضة للخلايا العصبية ذات الأهمية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاختلافات في نشاط الناقلات العصبية وneuromodulators، والاستجابات العصبية المختلفة وبالتالي، يمكن العثور بين الحيوانات تخدير ومستيقظا. لذلك، يطلب من أساليب تتيح التلاعب في أنظمة متشابك في الحيوانات المستيقظة من أجل تحديد مساهمة مدخلات متشابك لمعالجة الخلايا العصبية تتأثر التخدير. هنا، نقدم منهجية لبناء أقطاب لتسجيل وقت واحد النشاط العصبية خارج الخلية والافراج عن المواد neuroactive متعددة في المنطقة المجاورة للمواقع تسجيل في الفئران مستيقظا. من خلال الجمع بين هذه الإجراءات، أجرينا حقن microiontophoretic من gabazine لمنع انتقائي مستقبلات GABA ألف في الخلايا العصبية للأكيمة أدنى من الفئران ضبط النفس الرأس. Gabazine تعديل بنجاح خصائص استجابة العصبية مثل منطقة استجابة التردد والتكيف التحفيز محددة. وبالتالي، علينا أن نبرهن على طرقنا هي مناسبة لrecordinز النشاط وحدة واحدة ولتشريح دور المستقبلات العصبية المحددة في المعالجة السمعية.

القيد الرئيسي للإجراءات المنصوص مدة التسجيل قصيرة نسبيا (~ 3 ساعة)، والتي يتم تحديدها من قبل مستوى التعود من الحيوان إلى تسجيل الدورات. من ناحية أخرى، تسجيل جلسات متعددة لا يمكن أن يؤديها في نفس الحيوان. وميزة هذه التقنية على الإجراءات التجريبية الأخرى المستخدمة لمعالجة مستوى العصبي أو تعديل العمليات العصبية (مثل الحقن النظامية أو استخدام نماذج علم البصريات الوراثي)، هو أن تأثير الدواء يقتصر على مدخلات متشابك المحلية إلى الخلايا العصبية المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العرف تصنيع أقطاب يسمح تعديل معايير محددة وفقا للهيكل العصبي ونوع من الخلايا العصبية من الفائدة (مثل مقاومة نصيحة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من التسجيلات).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعل بين الإثارة العصبية وتثبيط أمر أساسي لمعالجة المعلومات الحسية 1. ومن المعروف أيضا أن التخدير له تأثير قوي على ديناميات تفعيل القشرية ونمط الزمني للمدخلات متشابك 2،3. على سبيل المثال، فقد لوحظ أن التخدير يغير مدة الردود أثار بصريا في الخلايا العصبية القشرية 3،4. وعلاوة على ذلك، فإن النسبة بين مثير ومدخلات متشابك المثبطة مختلفة في الحيوانات تخدير ومستيقظا 4،5، وتغيير كل من أثار ومعدلات النشاط العفوي 6،7. عن طريق قياس المواصلة متشابك، وجدت حيدر وزملاؤه 4 أن تثبيط مطابقة الإثارة في السعة تحت التخدير بينما أثناء اليقظة، وتثبيط أقوى من الإثارة. هذه النتائج ستدفع تطوير الإجراءات التجريبية لدراسة تأثير مدخلات متشابك محددة بشأن معالجة الحسي في الحيوانات مستيقظا.

<وقد استخدمت الطبقة ص = "jove_content"> وطرد رقابة من المواد neuroactive التي يتقاضاها تطبيق الحقن الحالية صغيرة (بناء على أمر من غ) على نطاق واسع لدراسة مساهمة مدخلات متشابك ودور مستقبلات الخلايا المفترضة في معالجة الحسي 8-13 . هذه التقنية، المعروفة باسم microiontophoresis، تسمح للتطبيق المخدرات في محيط الخلايا العصبية المسجلة، مما يساهم في التأثير السريع والمحصورة. هذا الإجراء هو أكثر ملاءمة لدراسة الآثار المحلية من المواد neuroactive، مقارنة مع تأثير واسع النطاق التي تسببها التلاعب التجريبية أخرى مثل الحقن النظامية، microdialysis أو استخدام تقنيات علم البصريات الوراثي. عادة، يتم استخدام التكوين القطب أصبع الظهير 14،15 لتسجيل وقت واحد الخلايا العصبية المستهدفة وتسليم المواد neuroactive من الفائدة. وهو يتألف من القطب تسجيل تعلق على ماصة multibarrel الذي يحمل المواد neuroactive. تعديلات سوقد تم تنفيذ الإجراء riginal التي وصفها Havey وكاسباري 14. على سبيل المثال، التنغستن القطب، بدلا من كوب واحد، ويمكن استخدامها لتسجيل النشاط العصبي 16. الطرق التي تم نشرها مسبقا لتصنيع أقطاب التنغستن 17،18 تنطوي على ثلاث خطوات عامة: النقش كهربائيا من النصائح سلك التنغستن، عزل الزجاج، وتعديل التعرض طرف لتلبية متطلبات التسجيل.

حقل مثيرة للاهتمام وطارئة في علم الأعصاب السمعية هو دراسة التحفيز محدد التكيف (SSA 19). SSA هو انخفاض معين في الاستجابة العصبية للأصوات المتكررة التي لا التعميم إلى أصوات أخرى، ونادرا ما قدمت. أهمية SSA تكمن في دوره المحتمل بوصفه آلية العصبية كشف الانحراف الكامن في الدماغ السمعي، وكذلك من الممكن إلى المترابطة الخلايا العصبية لعنصر عدم تطابق السلبية الراحل السمعية أثار المحتملين 20،21. SSA سccurs من IC تصل إلى القشرة السمعية 19،22-24. وقد تجلى GABA A تثبيط بوساطة ليكون بمثابة آلية السيطرة على منطقة أفريقيا جنوب الصحراء 7،16،25، التي ثبت أيضا أن تتأثر التخدير 26. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين الأساليب المذكورة سابقا لتسجيل نشاط وحدة واحدة من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء تطبيق خصم الانتقائي لل-receptors GABA (أ) في الفئران مستيقظا. أولا، نحن تصف صناعة أقطاب كهربائية أصبع الظهير والقادم، والأساليب الجراحية والتسجيل. لاختبار فعالية إطلاق المخدرات، قارنا مجال تقبلا فضلا عن مستوى منطقة أفريقيا جنوب الصحراء من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء طرد microiontophoretic من gabazine.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية من في جامعة سالامانكا بموافقة، واستخدام أساليب مطابقة للمعايير، وجامعة لجنة رعاية الحيوان سالامانكا فضلا عن معايير الاتحاد الأوروبي (التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي) ل استخدام الحيوانات في البحوث الأعصاب.

1. التنغستن الأقطاب الكهربائية

ملاحظة: ويستند صناعة أقطاب كهربائية التنغستن على تقنية الأصلي هو موضح في ميريل لواينسورث 27 و اينسورث وآخرون 28، وأجرى باستخدام الإعداد محطة العمل المبين في بولوك وآخرون (17)..

  1. لتسجيل واحد وحدة النشاط خارج الخلية من الخلايا العصبية IC، واستخدام الأقطاب الكهربائية مع مقاومة غيض من 1،5-2،5 MΩ. هنا، يتم وصف الخطوات المتبعة في صناعة التنغستن القطب فقط لفترة وجيزة، منذ وجدت وصفا مفصلا في المراجع المذكورة أعلاه.
  2. وضع أسلاك التنجستن في محاذاة مبنية خصيصاأداة (الشكل 1A) لمساعدة خفضها إلى الطول المطلوب. تتكون أداة محاذاة 30 الإبر (25 G) لصقها في نفس الوقت على فترات 2 مم، مع توقف في نهاية واحدة للحد من طول الأسلاك إلى ~ 40 ملم. بعناية إرفاق المغفلة من الأسلاك بشريط لاصق، وقطع ما تبقى من الأسلاك مع مقص قوية.
  3. سحب بلطف من الشريط من أجل إزالة الأسلاك التنغستن من أداة المحاذاة، والتأكد من أن جميع الأسلاك لا تزال تعلق على الشريط. لفة الشريط على النحاس المصقول المغزل (الشكل 1B، C)، وعقد الأسلاك بحزم ضد المغزل حتى لا يكون هناك اتصال الكهربائي جيدة.
  4. ربط المغزل المحركات 5 دورة في الدقيقة في محطة العمل، وتزج نصائح الأسلاك جاحظ إلى حل الحفر (كنو 2، 90 غ لكل 80 مل). زاوية المغزل محور 45 درجة بالنسبة إلى سطح النقش الحل. تزج نصائح الأسلاك بحيث ~ 1/3 من أسلاك الاتصال الحل.
  5. إمERSE القطب قضيب الكربون في حمام الحفر لإغلاق الدائرة. استخدام ربيع النحاس جديلة فرشاة لتطبيق العرض النقش على رمح المغزل بينما المغزل يدور. ضبط الحالية التي يتم تمريرها من خلال الأقطاب والنقش الحل إلى 250 مللي أمبير. وقف الحفر تلميح عندما يسقط النظام الحالي إلى 200 مللي أمبير. ستحفر النصائح الأسلاك إلى نقطة دقيقة جدا.
  6. تمرير الأسلاك شحذ واحد من خلال لهب لإزالة أي الشحوم والمواد اللاصقة بقايا. وضع الأسلاك (كليلة نهاية أول) في الشعرية البورسليكات الزجاج (1.5 مم OD، 0.86 ملم ID) مع نهاية الدنيا لها سدت مع الصلصال. المشبك ماصة عموديا في أعلى وأسفل. سحب ماصة باستخدام لفائف التدفئة (قطر 5 مم، عمق 5 ملم) والغطاس مع وقف التنفيذ. كما يتم سحب السلك بنسبة وزن المكبس، والزجاج المنصهر يشكل معطف جيد جدا حوله.
  7. إزالة الزجاج تغطي طرف في نهاية حادة من القطب مع مساعدة من حبة المنصهرة من الصوديومبورات ثنائي. لتشكيل حبة، مزيج من بورات ثنائي الصوديوم (~ 0.25 غ) مع كمية صغيرة من الماء (~ 0.5 مل)، وببطء وضعه على عنصر التدفئة، حتى يذوب في حبة ~ 2 مم في القطر. يتم التحكم في درجة حرارة عنصر التسخين من الجهد. وضع حبة وعنصر التسخين على الذراع مناور ثابتة على الطاولة، وتحريكه حتى يتركز حبة تحت المجهر في التكبير المنخفض.
  8. تأمين الأسلاك المغطاة بالزجاج إلى شريحة ووضعه تحت المجهر. نقل الشريحة مع المقابض مرحلة حتى غيض وحبة بورات ثنائي هم في التركيز. تسخين حبة حتى يذوب قليلا، وإدراج الأسلاك طرف ~ 10-15 ميكرون. تحويل الجهد التدفئة قبالة. كما يبرد حبة إلى أسفل، فإنه عقود وسوف إزالة الزجاج من طرف القطب، وفضح التنغستن الأساسي. القطب التنغستن جاهزة للاستخدام.

التصنيع 2. Multibarrel الزجاج ماصة

  1. حماية نهايات متعددةالشعيرات الدموية برميل الزجاج (خمسة براميل في H-التكوين) مع أنابيب الحرارة يتقلص، للسماح للقبضة أفضل لالمشابك مجتذب ومنع الكسر، ومكان واحد في مجتذب العمودي.
  2. للحصول على أطوال غيض من ~ 15 ملم، تعيين مجتذب إلى المعايير التالية: الحرارة: 84، الفرعية قوة المغناطيس: 49، قوة المغناطيس الرئيسية: 38. صقل هذه المعايير وفقا لنمط معين، وكذلك بعد تغيير عنصر التسخين.
  3. سحب شعري للحصول على اثنين من الماصات مع نصائح المغطي. جبل ماصة على شريحة باستخدام الصلصال وكسر غيض ماصة تحت المجهر حتى القطر الخارجي ~ 20 - 30 ميكرون، وذلك باستخدام مقص أو ملقط غرامة، أو الجانب المسطح من مشرط. إذا حافة كسر خشنا جدا، تحسينها باستخدام تقنية بورات ثنائي حبة هو موضح في الخطوة 1.7.
  4. وضع التنغستن القطب (من المادة 1) في حامل قدمت مع 20 G إبرة في نهاية 3 محاور micropositioner مصغرة محمولة على الأيل المجهره. باستخدام ملقط، ثني نهاية القطب 5-10 درجة مئوية، ~ 30 ملم من غيض.
  5. تحت المجهر، محاذاة بعناية القطب التنغستن على طرف multibarrel. مرة واحدة الانحياز، وانخفاض الكهربائي حتى إنها تجري اتصالات مع multibarrel، من المناسب في الأخدود بين اثنين من البراميل العليا. حرك غيض من القطب إلى أن يبرز ~ 15-20 ميكرون بعيدا عن غيض من multibarrel. جعل زاوية بين القطب وmultibarrel صغيرة قدر الإمكان للحصول على الترابط أفضل وفرقة أرق.
  6. تطبيق قطرة صغيرة من الضوء قابل للشفاء لاصقة ~ 5 ملم بعيدا عن النصائح. كن حذرا الغراء لا يصل إلى طرف لتجنب حجب القنوات multibarrel.
  7. علاج الغراء باستخدام مصباح الضوء الأزرق LED. كرر الغراء التطبيق / علاج إذا لزم الأمر، لتحسين الروابط.
  8. نقل المرحلة المجهر بلطف حتى يتم تحرير نهاية القطب التنغستن من حاملها. إزالة الفرقة أصبع المرتدة من الشريحة.
  9. التفاف عشره الجزء الأوسط من القطب أصبع مرة أخرى في طول قصيرة من الحرارة يتقلص أنبوب وتطبيق السريع علاج الايبوكسي مناسبا للزجاج لزيادة تأمين القطب التنغستن إلى multibarrel.

3. أدوية لMicroiontophoresis

ملاحظة: الأدوية المستخدمة لmicroiontophoresis يجب أن يكون لها شحنة كهربائية عندما يذوب في الماء. تحقق من الأدب لمعرفة ما إذا كانت المخدرات من اهتمام غير مناسبة لهذا الإجراء. هنا، وإجراء gabazine، وهو خصم من GABA ومستقبلات، وصفت.

  1. تصفية الماء المقطر باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرون لتعقيم المياه وتأمين التي لا تحتوي على المواد المذابة. إعداد ~ 1000 ميكرولتر من 20 ملي gabazine استخدام هذا الماء المقطر.
  2. ضبط درجة الحموضة في التخفيف إلى 4 مع 0.2 ميكرون تصفية هيدروكسيد الصوديوم باستخدام غرامة طرف الرقم الهيدروجيني القطب.
  3. تخزين 100-200 مكل في -20 درجة مئوية. تذويب يوم التسجيل. في ذلك اليوم، قبل أن الحيوان هو كبح جماحالطبعه، وملء برميل (3-5 ميكرولتر) من القطب multibarrel مع الأدوية، وذلك باستخدام محقنة مكروية 100 ميكرولتر مزودة إبرة بلاستيكية مرنة.

4. جراحة وزرع Headpost

  1. إجراء تجارب في اثنين من الذكور الفئران CBA / J (المصحف العضلة) مع أوزان 27 و 30 ز. اتبع الإجراءات الجراحية وتسجيل براينت وزملاؤه 29، Portfors والمتعاونين 30-32، ودوكي ومالمييركا 26.
  2. في قبل أيام لعملية جراحية، والتعامل مع الحيوانات وروض منهم إلى غرفة تسجيل عن طريق السماح لهم استكشاف بحرية. أداء 3 جلسات في اليوم الواحد، كل واحد دائم لا يقل عن 30 دقيقة. بهذه الطريقة الحيوانات سيكون أكثر هدوءا وراحة خلال التسجيلات.
  3. تخدير الماوس باستخدام مزيج من الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن في العضل. مع هذه الجرعة الحيوان هو تخدير بعمق حوالي 1 ساعة. إعطاء جرعات تكميلية من حجابهن واحدد من الجرعة الأولي حسب الحاجة.
  4. وضع الحيوان على بطانية التدفئة مستعدة للحفاظ على درجة حرارة 38 ± 1 درجة مئوية واستقرار رأس الحيوان في إطار التجسيمي باستخدام اثنين من القضبان الأذن وشريط لدغة. يجب الحرص على عدم اختراق الغشاء الطبلي مع قضبان الأذن.
  5. حماية العينين من خلال تطبيق قطرة من هلام العيون.
  6. حلق فروة الرأس باستخدام مقص وتطبيق بوفيدون اليود لتطهير الجلد.
  7. باستخدام مشرط، وجعل شق على طول خط الوسط لفضح الجمجمة وسحب السمحاق التي تغطي جداري والجزء الأكثر منقاري من عظام القذالي.
  8. الغراء headpost خفيفة الوزن الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس (الوزن ~ 0.65 غرام، وطولها 30 ملم، الشكل 2A) مع جولة وقاعدة مسطحة (مم 5) على الجمجمة. الغراء سلك الفضة الى منتصف headpost ترك أهدافها مجانا. سيتم استخدام الأسلاك الفضة كما القطب مرجعية لتسجيل الكهربية.
  9. تطبيق طبقة رقيقة من دوري الدرجةلاصق حزب التحرير قابل للشفاء في الجمجمة وقاعدة headpost. انتظر لمدة 10 ثانية، ووضع headpost على المنطقة منقاري من العظام الجدارية، على طول خط الوسط.
  10. للحصول على قوة الترابط فعالة، وعلى ضوء علاج لاصقة باستخدام مصدر ضوء أزرق لمدة 20 ثانية.
  11. حفر ثلاثة ثقوب حول وخلف قاعدة headpost باستخدام الحفر الكهربائية ومثقاب صغير.
  12. وضع اثنين من البراغي ووتش (~ 2 مم طول) في حفر ثقوب لخدمة جهات الاتصال كما إضافية بين الجمجمة وheadstage. تتطلب مسامير 1½ يتحول إلى تحقيق نوبة دافئ. اختبار مسامير مع ملقط للتأكد من أنها ليست فضفاضة.
  13. إدراج غيض من سلك الأرض الفضة في الحفرة الثالثة التأكد من إنها تجري اتصالات مع الجافية. تطبيق قطرة صغيرة من الماء cyanoacrylate مقاومة الغراء لربط الأسلاك في الجمجمة.
  14. تطبيق مركب علاج ضوء لتعزيز السندات من headpost مع الجمجمة. تغطية قاعدة headpost، الجزء المنخفض من الأسلاك الفضة،ومسامير، والحرص على عدم تمديد وراء امدا، للسماح بالوصول أثناء التسجيل. علاج باستخدام مصدر ضوء الأزرق.
  15. التراجع العضلات في الجزء الخلفي من الرقبة قرب الإدراج على الجمجمة. باستخدام منقب صغير (2.35 مم)، حفر نافذة مستديرة أسفل خياطة امدا والجانبية على خط الوسط، لفضح أكيمة أدنى (IC). عندما تكون الحدود فضفاضة، سحب ما يصل إلى العظم غطاء مع ملاقط غرامة. في حالة حدوث نزيف، وشطف مع المياه المالحة عقيمة الباردة لوقفه.
  16. جعل صغيرة (~ 1 ملم واسعة و~ 1 ملم عالية) الجدار حول نافذة مع مركب وخفيفة في الشفاء منه.
  17. تغطية الجمجمة المكشوفة والعضلات مع مرهم مضاد حيوي. ثم، والرطب على سطح مكشوف من IC مع ملحي معقم وتغطية ذلك مع الفازلين، وملء ولدت بشكل جيد بعد إجراء الجدار حول نافذة التسجيل.
  18. حقن تحت الجلد البوبرينورفين (0.03 ملغ / كغ، مخففة 01:10 في محلول ملحي) بمثابة مسكن.
  19. حفاظ على الحيوانات على رانه التدفئة بطانية حتى يصحو وإعادته إلى قفص الإسكانية للتعافي من الجراحة لمدة ثلاثة أيام قبل تسجيل الدورات. حيوانات المنزل في الفردي قفص rat's الإسكان لمنع زملائه في قفص تنظيف هلام وheadpost لمس الغطاء المعدني الشبكة. وضع بعض تخصيب اليورانيوم في القفص عندما يقع الحيوان واحدة. أيضا، تغيير يوميا نشارة الخشب لمنع العدوى والتحقق بعناية من أن هذا الحيوان يتعافى بشكل صحيح ولا تظهر أي علامات الانزعاج. تحقق أيضا إذا الفازلين هو على نافذة تسجيل وحماية الدماغ عرضة للخطر.

5. تسجيل الكهربية وMicroiontophoresis

  1. بعد الشفاء، وإعطاء الوقت الحيوان للتأقلم مع البيئة تسجيل وجود رئيسها ضبط النفس. تأقلم الحيوان عن طريق تحديد headpost لصاحب حين أن الفأر هو يجلس على خففت رادع رغوة مصنوعة خصيصا منحوتة لحجم الجسم (الشكل 2B). هذه الإرادة ليمانها حركات الماوس وسوف يسهم في الهدوء فيها.
  2. تبدأ مع 10 جلسات دقيقة وزيادة تدريجيا مدة تصل إلى 120 دقيقة. وخلال الدورة، مكافأة الحيوانات مع السوائل الحلوة (الحليب المكثف، تضعف 30:70 في الماء) في فترات معينة 33. وفي وقت لاحق، خلال الدورة تسجيل، وإعطاء نفس المكافأة في بداية وفي نهاية الدورة أو أثناء عزل أي الخلايا العصبية.
  3. إذا الحيوان متحمس جدا قبل التسجيل، حقن آسيبرومازين خفيف مهدئ (2 ملغ / كغ، داخل الصفاق). ووفقا للنظام العصبي للاهتمام، يمكن أن المسكنات يؤثر على النتائج.
  4. السماح للحيوان استكشاف بحرية غرفة تسجيل ل5-10 دقيقة.
  5. وضع جسم الحيوان إلى رادع حسب الطلب رغوة خففت (الشكل 2B).
  6. تأمين headpost إلى صاحب تعلق على إطار المجسم (الشكل 2C). هذا هو الوقت المناسب لإعطاء الحيوان مكافأة السائل.
  7. شاركالنسخة جسم الحيوان مع بطانية القطن وفضفاضة ربط ذلك باستخدام hemicylinder البلاستيك وشريط لاصق.
  8. إزالة الفازلين من نافذة تسجيل وشطف مع المياه المالحة عقيمة الدافئة.
  9. النشاط العصبي قياسية وتطبيق iontophoretic من gabazine.
    1. وضع القطب multibarrel على حامله، التي تسيطر عليها مايكرو محرك وتعلق على micromanipulator.
    2. ربط الأسلاك للتسجيل، وذلك باستخدام لقطات التماسيح الصغيرة. قم بتوصيل الطرف الموجب إلى نهاية القطب التنغستن، ومحطة أرضية للأسلاك الفضة ان الاتصالات الجافية.
    3. وضع أسلاك الفضة غير المصقول داخل كل برميل، لذلك واحدة الاتصالات نهاية الحل والطرف الآخر هو الوصول إليها. ربط تلك الغايات إلى الجهاز microiontophoresis، تنفيذا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. نقل القطب multibarrel حتى الاتصالات طرف سطح الدماغ. تطبيق محلول ملحي دافئ لمنع جفاف عشرالبريد أنسجة المخ. عند هذه النقطة تطبيق الاحتفاظ الحالية (-10 غ لgabazine، والتحقق من الأدب لدواء معين) لتجنب تسرب من المخدرات من طرف برميل في حين يبحث عن النشاط وحدة واحدة.
    5. استخدام التقنيات القياسية لعزل الخلايا العصبية واحدة النشاط خارج الخلية. الحصول على مساحة استجابة التردد (FRA) من الخلايا العصبية، أي مزيج من الترددات وشدة القادرة على إثارة استجابة لأن الخلايا العصبية الحساسة لهذه الأصوات 34-36.
    6. اختيار ترددين (F1 و F2) التي تثير معدل إطلاق مماثل ونمط. تقديم كل من تلك الترددات التحفيز كما نادر ومتكررة في ظل نموذج غريب الاطوار.
      ملاحظة: لفترة وجيزة، في نموذج غريب الاطوار، وتقدم وتيرة واحدة (F1)، والتحفيز المتكرر مع وجود احتمال كبير لحدوث، في حين أن الثاني (F2) هو التحفيز المنحرف نادرا ما تحدث، تتخللها عشوائيا بين تلك المتكررة. في تسلسل غريب الاطوار الثاني، وقريبيتم عكس الاحتمالات من المحفزات اثنين. وقد وصفت تفاصيل نموذج التحفيز سابقا 22،37.
    7. الافراج عن gabazine عن طريق تحويل التيار إلى القيم الإيجابية (10-20 غ). الحصول مرة أخرى على FRA وتكرار نموذج غريب الاطوار في ظل تطبيق gabazine. الحفاظ على طرد حتى أثر واضح في معدل إطلاق النار لوحظ. انها عادة ما يستغرق 5-20 دقيقة، اعتمادا على دواء معين، تركيزه، وما يحمله من طرد الحالي. كرر بروتوكول تسجيل للحصول على القيم تحت تأثير المخدرات.
    8. وقف الحقن عن طريق إعادة التيار إلى القيم استبقاء. انتظر تأثير المخدرات ليغسل عن طريق مراقبة أن FRA أو استجابة لنموذج غريب الاطوار يعود إلى سيطرة القيم.
      ملاحظة: يمكن للتسجيل جلسات تستمر 2-3 ساعة يوميا، ويجب أن انتهت في وقت سابق إذا تبين الحيوان أي علامة على عدم الراحة أو المتعثرة. إعطاء مكافأة السائل وتغطية الفصل تسجيلالعنبر مع الفازلين.

تحليل 6. البيانات

  1. قياس FRA قبل وأثناء الحقن gabazine فضلا عن مستوى منطقة أفريقيا جنوب الصحراء.
  2. قياس قوة الرد SSA تلاه مؤشر شائع-SSA (CSI) ومؤشر SSA تردد معين (SI) كما هو موضح سابقا 19،22،23،38،39. منظمة التضامن المسيحي الدولية وSI تعكس الفرق تطبيع بين استجابة الخلايا العصبية لحافز نادر وردا على احد متكرر. الإيجابية القيم منظمة التضامن المسيحي الدولية وSI تشير الاستجابة العصبية (المسامير في التحفيز) كانت أعلى إلى نادرة من لنغمات المتكررة.
  3. مقارنة البيانات من السيطرة وطرد المخدرات الشرط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سجلنا النشاط وحدة واحدة من 4 الخلايا العصبية معزولة جيدا من IC. وتظهر نسب نموذجية إشارة إلى الضوضاء التي تم الحصول عليها خلال التسجيلات خارج الخلية في الفئران مستيقظا في الشكل 3B. ويبين الشكل 4A المنطقة استجابة التردد (FRA) من كل عصبون قبل وأثناء الحصار المفروض على GABA و-receptors مع gabazine. وقد لوحظ زيادة في قوة استجابة (السنابل / التحفيز) فضلا عن توسيع نطاق ضبط الطيفي. وكانت الزيادة في استجابة أثار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وmicroiontophoresis المواد neuroactive في الحيوانات المستيقظة هي تقنية قوية لتحقيق وتشريح دور مدخلات متشابك محددة على نشاط الخلايا العصبية واحدة 40،41. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يسمح بتحديد تأثير الناقلات العصبية وneuromodulators على الدوائر العصبية دون أي تشويش محتمل من التخدير. هنا، علينا أن نبرهن على تطبيق gabazine في IC من الفئران مستيقظا تغيرت بقوة ضبط التردد (الشكل 4A)، وأنماط الاستجابة الزمنية (الشكل 4B) ومنطقة أفريقيا جنوب الصحر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا المشروع تم تمويله من قبل MINECO يمنح BFU201343608 ف وPSI2013-49348-EXP، ومنحة SA343U14 JCYL لتمويل MSM وMRC الأساسية لARP. عقدت YAA على CONACYT (216106) وزمالة سبتمبر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلك التنغستنHarvard Apparatus LTD33-00990.005 بوصة × 3 بوصات
زجاج البورسليكات الشعري   ؛هارفارد جهاز المحدودة30-0053البورسليكات الجدار القياسي بدون خيوط ، 1.5 مم OD ، 0.86 مم ID ، 100 مم
الشعيرات الدموية الزجاجية متعددة البرماسورات   ؛الأجهزة الدقيقة العالمية5B120F-4 شعرية 5 أسطوانات ، بطول 4 بوصات ، OD 1.2 مم ، مع خيوط
بالضوء DiaplusDiaDent2001-2101، تستخدم لربط قطب التنغستن بماصة زجاجية متعددة الأسطوانات
G-BondGC Corporation2277لاصق معالج بالضوء ، يستخدم لربط عمود الرأس بجمجمة
CharismaHeraeus Kulzer66000087مركب معالج بالضوء ، يستخدم لتقوية رابطة عمود الرأس مع الجمجمة
Araldit CristalCeys2-component expoxy ، تستخدم لزيادة تأمين ربط قطب التنغستن بالماصة الزجاجية متعددة الماسورات
بطانية التدفئةCibertecRTC1
الإطار التجسيميNarishigeSR-6Nمعدل للفئران
جهاز MicroiontophoreticHarvard Apparatus LTDNeurophore BH-2بما في ذلك مضخات الرحلان الأيوني IP-2 (واحدة لكل قناة توصيل المخدرات) ووحدة التوازن
مجتذب الماصة الزجاجية متعددة البراميلNarishigeModel PE-21
مصباح LEDTechnofluxCV-2155 W ، 430-485 نانومتر
MicroFilWorld Precision InstrumentsMF34G-5إبرة بلاستيكية مرنة ، 34 AWG
ImalgeneMerialKetamine ، 100 مجم / مل
رومبونبايرزيلازين ، 20 مجم / مل
جابازين / SR-95531سيجماS106تحضير ~ 1000 وميكرو ؛ لتر من 20 ملي مولار من الجابازين في الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني على 4
طويلة مادة لاصقة للمعالجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  3. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  4. Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
  5. Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
  6. Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
  7. Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
  8. Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
  9. Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
  10. Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
  11. Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
  12. Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
  13. Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
  14. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
  15. Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358(2013).
  16. Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297(2012).
  17. Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
  18. Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
  19. Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
  20. Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
  21. Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111(2014).
  22. Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
  23. Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071(2010).
  24. von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
  25. Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107(2012).
  26. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
  27. Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
  28. Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
  29. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
  30. Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
  31. Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
  32. Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
  33. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  34. Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
  35. Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
  36. Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
  37. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89(2013).
  38. Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
  39. Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119(2013).
  40. Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
  41. Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
  42. Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
  43. Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
  44. LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
  45. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة