مقالة منهجية

استهداف بيوفيلم أسوشيتد

13.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53925

⸱

مايو 5, 2016

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

تنتج معظم الالتهابات البكتيرية غشاء حيوي. بحكم بيئتها ، غالبا ما تكون البكتيريا المرتبطة بالغشاء الحيوي مقاومة للأدوية ظاهريا. وبالتالي فإن الجزيئات الجديدة المضادة للبكتيريا التي تقتل البكتيريا في الأغشية الحيوية هي أولوية قصوى. أنشأنا اختبارا للفحص السريع للمركبات المضادة للميكروبات الفعالة في القضاء على الأغشية الحيوية.

الملخص

معظم البكتيريا المسببة للأمراض قادرة على تكوين أغشية حيوية أثناء الإصابة ، ولكن نظرا لصعوبة معالجة وتقييم الأغشية الحيوية ، يتم إجراء الغالبية العظمى من العمل المختبري باستخدام الخلايا العوالق. هنا ، نصف مقايسة الأغشية الحيوية للوحة الوتد كما تم إجراؤها باستخدام المكورات العنقودية الذهبية. تزرع الأغشية الحيوية البكتيرية على أوتاد متصلة بغطاء صفيحة ميكروتيتر سعة 96 بئرا ، ويتم غسلها من خلال الغمر اللطيف في المخزن المؤقت ، وتوضع في لوحة تحدي الدواء. بعد الحضانة اللاحقة يتم غسلها مرة أخرى ونقلها إلى لوحة استرداد نهائية ، حيث تعمل صبغة الفلورسنت ريزازورين كمؤشر للحياة. يوفر هذا الاختبار زيادة كبيرة في سهولة الاستخدام والموثوقية والاستنساخ ، بالإضافة إلى ثروة من البيانات عند إجراؤها كقراءة حركية. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا الاختبار مع نهج فحص الأدوية متوسط الإنتاجية الذي يتم من خلاله أخذ قراءة فلورية نقطة النهاية بدلا من ذلك ، مما يوفر مسارا لجهود اكتشاف الأدوية.

المقدمة

يمكن الميكروبات المسببة للأمراض تشكل الأغشية الحيوية في الجسم الحي مما يؤدي إلى الالتهابات المزمنة غير الحادة 1. العدوى المرتبطة بيوفيلم هو عامل خطر جدي من الإجراءات الطبية التي تنطوي على زرع أجسام غريبة (على سبيل المثال، استبدال العظام الاصطناعية، ثدي) أو تركيب أنابيب القصبة الهوائية أو القسطرة البولية 2. في هذه السياقات، العلاج المضاد للعدوى هو دائما تقريبا عند الضرورة نادرا ما يتم مسح العدوى القائم على بيوفيلم من تلقاء نفسها، حتى في الأفراد المناعة. المكورات العنقودية الذهبية هي واحدة من مسببات الأمراض الأكثر لوحظ في كثير من الأحيان المتورطين في مضاعفات بيوفيلم التي تحدث أثناء استخدام الأجهزة الطبية الغازية 3.

وللأسف، فإن طبيعة الأغشية الحيوية بمثابة حاجز وقائي يجعلها أكثر مقاومة للعلاج من خلايا العوالق 1،4، وتقييم الفعالية السريرية تنبأ هو جزء هام من كلا الأوليتطوير العقاقير وكذلك مراقبة مقاومة العقاقير. هناك اعتراف متزايد أن الظروف المختبرية، وتركز على ثقافات العوالق، قد لا تمثل بأمانة المرض في العالم الحقيقي 5. مما زاد من تفاقم المشكلة، وتكرار الظواهر بيوفيلم أمر صعب، ونماذج بيوفيلم القائمة ومملة ويعانون من ارتفاع المشترك بين وداخل فحص 6 التباين. وهكذا، كثير من الباحثين، من خلال ضرورة، افتراضية المقايسات خلية العوالق قابلية المخدرات، وبالتالي يحتمل أن إهمال جانب هام من جوانب الفوعة البكتيرية والأمراض.

نحن هنا تصف البروتوكول لمعايرة البكتيريا، وتحديدا س. الذهبية، في الأغشية الحيوية نمت قبل استخدام مقرها 7،8 نظام بيوفيلم جيدا 96. بينما بروتوكول لتشكيل بيوفيلم والتحدي يتبع أساسا على توصية الصانع، ونحن تقديم منهجية غنية بالمعلومات بديلة لقياس جدوى biofILM بعد التحدي. لفترة وجيزة، والبكتيريا يتم تربيتها في لوحة الربط، حيث تشكل الأغشية الحيوية على أوتاد جاحظ تعلق على غطاء لوحة ل. بعد تشكيل بيوفيلم، وانخفض أوتاد بلطف في آبار لوحة جديدة مليئة PBS لإزالة الخلايا العوالق. و-غطاء الوتد، مع الأغشية الحيوية المرفقة، يتم نقلها إلى لوحة التحدي الجديدة، التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية لأن يعاير. بعد الحضانة الثانية، تتم إزالة الأغطية مرة أخرى، وغسلها، ونقله إلى لوحة الانتعاش التي تحتوي على ريسازورين صبغ، حيث يخضع لعملية حضانة النهائية. تحويل ريسازورين يمكن تسجيل حركيا أو اعتباره قراءة نقطة النهاية بعد فترة نقاهة محددة. هذا الأسلوب القائم على صبغ قياس قابلية الأغشية الحيوية يختلف اختلافا كبيرا من كفو (وحدات تشكيل مستعمرة) مملة منهجية قائمة على العد هو موضح في البروتوكول الأصلي 7. OD 600 القياسات من لوحة التحدي المخدرات وريسازورين حركية تحويل بمثابة قابلية القراءةعموميات من العوالق وبيوفيلم الخلايا، على التوالي، وتقدم موثوق بها، فحص سريع، وبسيط من الناحية الفنية الغنية بالمعلومات من أجل البقاء بيوفيلم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بيوفيلم بدء

  1. تنمو ثقافة إنتاج بيوفيلم الكائن في وسط غني بالمغذيات. تطعيم المكورات العنقودية الذهبية سلالة نيومان في 10 مل من مولر هينتون المتوسطة من المخزون الجلسرين. أداء جميع الأعمال التي تنطوي على التعامل مع س. الذهبية مع قفازات وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  2. احتضان لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية على شاكر دوارة (100-200 دورة في الدقيقة).
  3. تحديد OD 600 من ثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي وكفيت القياسية (طول المسار: 1CM).
  4. حساب حجم (V) الثقافة اللازمة لإعداد 20 مل من اللقاح مع OD 600 (اللقاح) من 0.1 في chelexed سائل الإعلام معهد الحديقة التذكارية روزويل (CRPMI) 9 باستخدام المعادلة التالية: [V = 20 مل * 0.1 / OD 600 (ثقافة )]
    ملاحظة: مرجع 9 تفاصيل عن إعداد CRPMI.
    1. إضافة الحجم ثقافة احتساب (من فوق) لأنبوب الطرد المركزي والخلايا بيليه عن طريق الدوران لمدة 1 دقيقة في 10000 ز س. لاستعداداتإعادة اللقاح بيوفيلم، نضح قضى متوسط ​​النمو و resuspend بيليه الخلية في 20 مل CRPMI.
  5. صب اللقاح في خزان 25 مل.
  6. بعناية إزالة الغطاء من معقمة 96-جيدا لوحة الربط عن طريق سحبها على التوالي.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلويث أوتاد تتدلى من الغطاء. غطاء يمكن وضعها رأسا على عقب على سطح نظيف داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  7. باستخدام 200 ميكرولتر ماصة متعدد القنوات، إضافة 125 ميكرولتر اللقاح إلى كل بئر من الصفوف ألف إلى زاي من أسفل لوحة.
  8. ملء المتوسطة CRPMI 125 ميكرولتر العقيمة في كل بئر من الصف H كعنصر تحكم العقم.
  9. اتخاذ الربط بين الغطاء والاحتفاظ بها فوق الجزء السفلي لوحة مع أوتاد التي تواجه هبوطا. بعناية محاذاة أوتاد الفردية مع الآبار الخاصة بها. تجنب الاتصال الجسدي بين لوحة وأوتاد. مرة واحدة الانحياز، وانخفاض الغطاء بعناية أسفل. تجنب اختلالات كما تعديلات أجريت بعد أوتاد لمست لوحة أسفل قد تابعضوابط العقم يؤمين في H. التوالي
  10. ختم غطاء لوحة مع فيلم البارافين لمنع التبخر وضعها في كيس من البلاستيك قابل للغلق، وختم بإحكام. الحفاظ على حجم الهواء في الكيس عند أدنى مستوى ممكن لتقليل التبخر.
  11. احتضان دون أن تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    ملاحظة: لقد تم 48 ساعة من النمو الأمثل لس. الذهبية، ولكن سوف تختلف استنادا إلى كائن المستخدمة.
    ملاحظة: على الرغم من الحضانة ثابتة هي نقطة انطلاق جيدة لتحسين الفحص، والهز برفق في 150 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة هو الاختلاف الممكن أن قد يعزز تشكيل بيوفيلم من بعض س. العنقودية الذهبية المعزولة.

2. إعداد لوحة بيوفيلم التحدي

  1. في يوم التحدي بيوفيلم تأخذ لوحة 96-جيدا الطازجة وإضافة 100 ميكرولتر من CRPMI، معايرتها إلى RT، إلى كل بئر من الصفوف B إلى H. لتجنب نتائج غير متناسقة، واستخدام لوحة 96-جيدا التي يمكن أن تعقد 200 ميكرولتروسائل الإعلام عندما أوتاد هي في الداخل، وتتميز الآبار ذات أبعاد مماثلة لتلك التي من لوحة بيوفيلم بدء.
  2. تمييع تصل إلى 4 مركبات اختبار على حدة في 1.0 مل من CRPMI إلى 2x التركيز النهائي المطلوب، وذلك لحساب لتخفيف النهائي في الخطوة 2.7.
    ملاحظة: نقطة انطلاق جيدة 8 أضعاف أعلى تركيز مثبط للخلايا العوالق.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من مركب 1 في الآبار A1 إلى A3، مجمع 2 في الآبار A4 إلى A6، مركب 3 في الآبار A7 إلى A9 ومجمع 4 في الآبار A10 إلى A12.
  4. مخفف تسلسليا المركبات الاختبار باستخدام ماصة الأقنية ونقل 100 ميكرولتر من الصف ألف إلى صف باء والمزيج.
  5. على هذا النحو، ومواصلة نقل 100 ميكرولتر جيدا جيدا. خلط بعد كل عملية تحويل ووقف في الصف F.
  6. بعد الاختلاط، وطرد 100 ميكرولتر من الصف F في حاوية النفايات. لا نقل أي السائل إلى صفوف G و H.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من CRPMI إلى كل بئر من لوحة باستخدام ماصة الأقنية لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. انظر الشكل رقم 1 لتخطيط لوحة النهائي.

3. بيوفيلم التحدي

  1. إضافة 200 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى معقمة لوحة 96-جيدا الطازجة التي تتميز الآبار ذات أبعاد مماثلة لتلك التي من لوحة بيوفيلم بدء.
  2. إزالة كيس من البلاستيك وفيلم البارافين من المحتضنة لوحة بيوفيلم بدء.
  3. رفع الغطاء على التوالي. تجنب الاتصال بين أوتاد وأسفل لوحة لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف بيوفيلم. حافظ على الجزء السفلي لتحليلها لاحقا OD 600 (انظر 3.8).
  4. شطف خلايا العوالق عن طريق وضع الربط بين غطاء على لوحة تحتوي على برنامج تلفزيوني (من الخطوة 3.1). غمر أوتاد لمدة 5 ثوان، ورفع من برنامج تلفزيوني، ويغرق مرة أخرى، والحرص على عدم ضرب أوتاد ضد الجانبين أيضا.
  5. وضع تشطف الربط بين غطاء في لوحة التحدي. تجنب الاتصال غير الضرورية بين أوتاد وأسفل اللوحة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف بيوفيلم يؤدي إلىنتائج غير متناسقة.
  6. لوحة ختم مع فيلم البارافين وتضع في كيس من البلاستيك قابل للغلق كما هو موضح في الخطوة 1.10.
  7. احتضان لوحة دون أن تهتز لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  8. خذ الجزء السفلي من لوحة بيوفيلم بدء من 3.3. Resuspend والبكتيريا في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية وقياس OD 600 مع قارئ صفيحة مناسبة لتأكيد النمو التي تحدث في جميع الآبار ولكن الضوابط العقم في H. التوالي

4. بيوفيلم تحديد

  1. استخدام قارئ لوحة مجهزة غرفة الحضانة وقادرة على اتخاذ قراءات مضان الحركية للكشف عن ريسازورين التحويل. انشاء 24 ساعة قياس مضان الحركي باستخدام الإثارة 530 نانومتر و 590 نانومتر الانبعاثات.
  2. ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية، ويكون لوحة تقرأ كل 20 دقيقة. تعيين قارئ لوحة لقياس من الجزء السفلي من لوحة وفقا لinstruc الشركة المصنعةستعقد.
  3. إعداد لوحة غسل بإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع ماصة الأقنية إلى العقيمة 96 لوحة جيدا.
  4. إعداد بيوفيلم الانتعاش المتوسطة وذلك بإضافة 400 ميكرولتر من 0.8 ملغ / مل ريسازورين حل الأسهم إلى 20 مل من CRPMI المتوسطة إلى تركيز النهائي من 16 ميكروغرام / مل ريسازورين.
    ملاحظة: ريسازورين هو أنسجة الجلد المعروفة. استخدام معطف المختبر، نظارات البداية، والقفازات أثناء التعامل مع. وقد استخدم CRPMI باعتبارها وسائط استرداد بيوفيلم لأنه يوفر أدنى إشارة الخلفية، ولكن يمكن استبدال وسائل الاعلام مولر هينتون إذا كان ذلك مناسبا.
  5. إضافة 150 ميكرولتر من بيوفيلم المتوسطة الانتعاش مع ماصة الأقنية إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا جديدة.
  6. لوحة نقل تحد من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية وبعناية إزالة كيس من البلاستيك وختم الفيلم.
  7. إزالة الربط بين غطاء من لوحة التحدي وشطف خلايا العوالق في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 3.4. الحفاظ على الجزء السفلي من لوحة تحديا للOD لاحق 600 آناتحلل (انظر 4.10).
  8. بعد الشطف، وضع الربط بين الغطاء في الجزء السفلي لوحة تحتوي على المتوسطة انتعاش بيوفيلم.
  9. التفاف الجانب من لوحة مع فيلم البارافين، والحرص على عدم عرقلة الجزء السفلي من الآبار المحيطة. مباشرة بعد اختتام لوحة، ووضعه على قارئ لوحة وبدء القراءة الحركية على مدى فترة 24 ساعة قبل بدء التي سبق ريسازورين بروتوكول الحركية من الخطوة 4.1.
  10. لقياس نمو خلايا العوالق التي قد أو قد لا يحدث خلال التحدي، وقراءة OD 600 من كامل أسفل لوحة التحدي باستخدام قارئ لوحة الجزئي. اتبع الإرشادات الواردة في الخطوة 3.8.
    ملاحظة: و resuspend بعناية محتوى كل كذلك خلايا ينفضون بيوفيلم تميل إلى النمو في كتل في أسفل البئر. وأي فقاعات داخل البئر تتداخل بقوة مع OD 600 قراءات ويجب تجنبها أو إزالتها قبل القراءة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فحص ريسازورين حساسة بما يكفي للكشف موثوق عدد قليل جدا من خلايا قابلة للحياة قادرة على تكرار في مجال مكافحة المخدرات المتوسطة حرة بعد التحدي. في هذه المنهجية، نحدد الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على التركيز كما أدنى تركيز الذي يعتبر أي تحويل ريسازورين خلال 24 ساعة. ويعتمد الفحص ريسازورين على جزيئات الأكسدة الموجودة في خلايا نشطة عملية الأيض التي تحول لون صبغة من اللون الأزرق إلى اللون الوردي. تحويل الصبغة وبالتالي مؤشرا على نمو الخلايا، ويمكن أن يكون كم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، التي وصفناها فحص بيوفيلم المعدلة لتحديد نشاط مثبطات اختبارها على س. الأغشية الحيوية الذهبية التركيز على الدولة التمثيل الغذائي للخلايا بيوفيلم المرتبطة بها. في حين الشروع بيوفيلم وصف وإجراءات تحد توصيات الشركة معظمها تحاكي، واستخدام ريسازورين الصبغة لكشف وتحديد الخلايا المرتبطة بيوفيلم التي تعيش تحديا المانع 24 ساعة بشكل كبير على تبسيط الإجراءات الموصى بها من الانتعاش الخلية (عبر صوتنة حمام مائي) وتعداد لاحق من خلايا قابلة للحياة عن طريق فرز CFUs. ويشمل هذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر ساران كوبول على المساعدة الفنية. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01-AI104952 إلى FW. تم تقديم مزيد من الدعم من قبل مركز أبحاث الإيدز بجامعة ألاباما في برمنغهام (UAB) ، وهو برنامج ممول من المعاهد الوطنية للصحة (P30 AI027767) والذي أصبح ممكنا من قبل معاهد المعاهد الوطنية للصحة التالية: NIAID ، NIMH ، NIDA ، NICHD ، NHLDI ، NIA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  مولر-هينتون متوسطأكسبيدCM0405اتبع توصيات الشركة المصنعة
RPMI-mediumCorning 17-105-CV
CRPMIRef 9RPMI-1640 متوسط chelexed لمدة ساعة واحدة مع راتنج Chelex 100 ثم يتم استكماله بنسبة 10٪ unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 ResinBio Rad142-2822
MBEC-platesInnovotech19111
Resazurin ملح الصوديومSigmaR7017800 & micro ؛ جم / مل في ماء DI   ؛       تصفية معقمة
مايكرو لوحة اهتزاز منصة هايدولف تيتراماكس 1000
Cytation 3 قارئ لوحةBiotek
Gen5 برنامجBiotekتسجيل وتحليل تحويل ريزازورين
NeocuproineSigmaN1501 تحضير مخزون 10 ملي مولار في 100٪ إيثانول ، وتخزينها في -80 & ordm ؛ C
كبريتات النحاسAcros Organics7758-99-8إعداد محلول مخزون 100 ملي مولار في الماء ، وتخزينها في 4 & ordm ؛ C
Cu-neocuproineعصاميالصنع تم إنشاؤه عن طريق خلط مولاريات متساوية من النيوكوبروين وكبريتات النحاس. تم تخفيف المزيج في وسط CRPMI إلى التركيز المطلوب.
جنتاميسينسيجماG3632-1G

المراجع

  1. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
  2. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
  3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  4. Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19(2011).
  5. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
  6. Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).
  7. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
  8. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  9. Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
  10. Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
  12. Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854(2014).
  13. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
  14. Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53(2006).
  15. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRPMI

مقالات ذات صلة