يتم تنفيذ كافة رعاية الحيوانات والتجارب وفقا للبروتوكول الأخلاقية التي تقدمها (المعهد الكوري المتقدم للعلوم والتكنولوجيا) KAIST IRB (مجلس المراجعة المؤسسية).
1. الشريط تشكيل
- لإعداد حل TA، ضع قارورة زجاجية 4 مل الحجم على محرك مغناطيسي، وإضافة 1 مل من الماء المقطر مع شريط التحريك. إضافة 1 غرام من حمض التانيك إلى القارورة، وتذوب في الماء عن طريق التحريك لطيف في 200 دورة في الدقيقة لأكثر من 1 ساعة. عندما يذوب TA تماما، ويصبح الخليط شفافة مع اللون البني.
- يعد حل PEG بإضافة 1 غرام من مسحوق PEG (4 الأسلحة، و 10 كيلو دالتون، والخطية، 4.6 كيلو دالتون) إلى 1 مل من الماء المقطر تليها خلطها قبل vortexing لبضع ثوان لجعل الطين الأبيض. الحفاظ على هذا الطين في الحاضنة عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. حتى واحدة بيضاء يصبح واضحا تماما.
ملاحظة: نقطة انصهار PEG مع 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي حوالي 55- 60 درجة مئوية، و4 كيلو دالتون واحد هو 53-58 درجة مئوية. ذاب PEG يصبح غير قابلة للامتزاج في الماء بحيث / مل يمكن تحقيق نسبة عالية من PEG في الماء تصل إلى 1 ز كحل واضح. مرة واحدة يتم تشكيل حل PEG واضح في درجة حرارة عالية، والحل لا يزال مستقرا عند درجة حرارة الغرفة بعد التبريد. - إضافة 329 ميكرولتر من PEG (4 الأسلحة، و 10 كيلو دالتون) حل أعدت في الخطوة 1،2 حتي 671 ميكرولتر من الحل TA أعدت في الخطوة 1.1 (في حالة الربط الخطي مع 4.6 كيلو دالتون، إضافة 311 ميكرولتر من حل PEG ل 689 ميكرولتر من حل TA) في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة. مزيج بلطف اثنين من حلول لزجة والعسل مثل مع ملعقة الضيقة إلى مزجها بشكل متجانس.
تنبيه: كل الحلول هي لزجة جدا، لذلك يجب على العلماء ببطء ولكن بما فيه الكفاية سحب ما يصل ونقل الحلول مع micropipette. - تدور الخليط المعد في الخطوة 1.3 في 12300 x ج لمدة 3 دقائق في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة.
- بعناية عينياوفه أكبر قدر من طاف وقت ممكن باستخدام micropipette، وجمع المنتجات التي استقرت: هذا هو الشريط تشكيلها بالكامل. بعد تشكيل الشريط، واحفظها في الثلاجة (4-8 درجة مئوية) لمدة تصل إلى عدة أسابيع ملاحظة: الشريط يمكن تعقيمها بواسطة أشعة غاما أو الإلكترون علاج شعاع قبل استخدامها في التطبيقات الجراحية.
2. قياس قوة التصاق الشريط
- إعداد قطعتين من أنسجة الجلد الخنازير التي يبلغ قطرها 6 مم عن طريق قطع مع لكمة خزعة بعد إزالة كل الدهون في أنسجة الجلد.
ملاحظة: تم الحصول على أنسجة الجلد الخنازير من صحة الجلد الجناح الخنازير واشترت من سوق اللحوم المحلية تقع في دايجون في كوريا الجنوبية. - تطبيق الغراء cyanoacrylate التجاري إلى الجانب الخارجي من كل الأنسجة، وإرفاق الأنسجة إلى قضيب معدني.
ملاحظة: يتم استخدام قضيب معدني كمقبض التكميلي الأنسجة لذلكاعادة لم يجتاح مباشرة من قبل الجهاز. وفقا لذلك، ويمكن الاستعاضة عنها بمواد أخرى بعد تكوين الجهاز الشد. - تطبيق قطرة من الشريط (قطرة من الشريط هو حوالي 3-6 ملغ) إلى جانب واحد من الأنسجة. ثم، ونشر الشريط موحد باستخدام أنسجة أخرى بين الأنسجة اثنين على الجانبين الداخلية لذلك فإنها تعلق بها كما هو مبين في الشكل 2A.
- ثم، يدويا إرفاق و فصل الجانبين من أنسجة عدة مرات لخلط متجانس وتحقيق أقصى قدر من التفاعل بين كل الأنسجة والشريط.
- مع UTM، بعناية قبضة كل جانب من قضيب. وسيتم تحديد قوة التصاق من القوة اللازمة لفصل اثنين من الأنسجة المرفقة مع الشريط. أولا، وتطبيق قوة من 20 N لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك، مع الجهاز، وسحب كل قضيب في اتجاه معاكس بمعدل 1 مم / دقيقة. حتى يتم فصل تماما الأنسجة.
ملاحظة: سيتم منح البيانات باعتبارها مسافات قوة (FD) منحنى الكشف من قبل الحركةكل قضيب. - حساب قوة التصاق الشريط بقسمة الحد الأقصى لقوة (كيلو نيوتن) التي تظهر في منحنى FD المحرز في الخطوة 2.5 من مساحة سطح العينة، وهذا هو، 3.14 س (0.003 م) 2.
- لرصد قوة التصاق في وجود الماء، إضافة 20 ميكرولتر من الماء على منطقة منفصلة بين اثنين من الأنسجة، ونعلق على الفور. مع الجهاز، إجراء اختبار مفرزة مرة أخرى.
3. في المختبر تدهور اختبار
- خفض سقف (د = 8 مم) من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وتزن الغطاء لتعريفه W ج.
- ملء الغطاء مع 150 ملغ من الشريط، وتزن كل ذلك معا مرة أخرى لتعيينه مجموع الوزن الأولي W 0.
تنبيه: لا تفرط الشريط في الحد الأقصى. يجب أن يكون ارتفاع الشريط السفلي من الجزء العلوي من الغطاء، لأنها يمكن أن تكون حاجز مادي لتيار من العازلة في برنامج تلفزيوني الناتجة عن عملية التحريك خلال حضانة في الخطوة 3.4. - ضع الغطاء الذي يحتوي الشريط في قارورة ثقافة خلية (75 سم 2)، وإضافة 50 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني (1X، ودرجة الحموضة 7.4) إلى قارورة الثقافة الخلية بحيث يتم مغمورة الشريط في الغطاء تماما في العازلة في برنامج تلفزيوني، كما هو مبين في الشكل 3A (ن = 5).
- احتضان القارورة ثقافة خلية أعدت في الخطوة 3.3 في حاضنة تهتز المدارية عند 37 درجة مئوية، على غرار الظروف الفسيولوجية، مع طيف واثارة (50 دورة في الدقيقة).
تنبيه: الحفاظ على حالة التحريك في 50 دورة في الدقيقة. قد يسبب دورة في الدقيقة ارتفاع انهيار الشريط. - في كل نقطة زمنية، واتخاذ غطاء مع الشريط من قارورة زراعة الخلايا، ومن ثم تجفيفها التي تهب غاز النيتروجين. وزن الغطاء تحتوي المتبقية الشريط. ضبط الوزن في كل نقطة زمنية لW ر. استبدال برنامج تلفزيوني جديد مرة أخرى، والتخلص منه مرة أخرى بعد قياس دبليو تي في كل نقطة زمنية.
- حساب الوزن النسبي المتبقية (٪) المعادلة التالية.
الوزن النسبي المتبقي (٪) = (W ر - W ج) / (W 0 - W ج) × 100٪
4. مرقئ قدرة الشريط
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية وبروتوكول الأخلاقية التي قدمتها وزارة الكورية الصحة والرعاية الاجتماعية.
- لتقييم قدرة الجسم الحي في مرقئ، استعراض النموذج الكبد نزيف الماوس كما هو موضح في المرجع 24.
- تخدير خمسة عشر الفئران (عادي النواب الماوس، 6 أسابيع، 30 - 35 غرام من الذكور) مع حقن داخل الصفاق من تلييتامين-zolazepam (33،333 ملغ / كلغ) وزيلازين (7.773 ملغم / كغم) (ن = 5 في المجموعة). لتأكيد التخدير المناسبة، قرصة مخلب الحيوان برفق ومراقبة حركات مثل سحب مخلب، وما إلى ذلك لا حركة تشير إلى أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية للقيام الجراحة.
- لمنع جفاف عيون الحيوان، وتطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم للعين بما فيه الكفاية في حين ظلesthesia. فضح الكبد عن طريق شق البطن خط الوسط، ووخز الكبد مع إبرة 18 G للحث على النزيف.
- إزالة الدم التي تتدفق مع شاش معقم، ووضع 100 ميكرولتر من الشريط أو الغراء الليفين (مراقبة إيجابية) على الفور على موقع النزيف.
ملاحظة: ليس هناك حاجة إلى مزيد من خياطة بعد تطبيق الشريط نظرا لخصائص لاصقة على درجة عالية من المقاومة للدماء على أنسجة الجرح. للسيطرة سلبية، يحدث أي علاج على موقع النزيف. - في كل حالة على حدة، ووضع ورقة الترشيح مع الكتلة المعروفة تحت الكبد لجمع الدم من موقع الضرر. استبدال الورق مع واحد جديد كل 30 ثانية لمدة 4 مرات (أي.، 2 دقيقة).
- قياس كتلة الدم يمتص على كل ورقة مرشح جمعت كل 30 ثانية. بعد التجربة الحيوان، التضحية الفئران من خلال CO 2 الخنق القتل الرحيم.