مقالة منهجية

تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

DOI:

10.3791/53933

⸱

مايو 8, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة طرق تحريض وتسجيل نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، جنبا إلى جنب مع تقييم توزيع الخلايا المناعية ومستويات السيتوكين mRNA في الغدد الليمفاوية والطحال والدم والحبل الشوكي باستخدام قياس التدفق الخلوي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، على التوالي ، في مراحل مرضية مختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفترض التصلب المتعدد ليكون أحد أمراض المناعة الذاتية التهابات، والتي تتميز تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مما أدى إلى ضعف الادراك والحركية. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (بنت) هو نموذج حيواني مفيد لمرض التصلب العصبي المتعدد، لأنه يتميز أيضا تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي، إعاقة حركية ومدفوعة أيضا رد فعل المناعة الذاتية والالتهابات. هو فعل واحد من النماذج EAE مع الببتيد المستمدة من البروتين المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG) 35-55 في الفئران. الفئران EAE تطوير مسار المرض تدريجيا. وتنقسم هذه الدورة إلى ثلاث مراحل: المرحلة قبل السريرية (يوم 0-9)، وبداية ظهور أعراض المرض (يوم 10-11)، والمرحلة الحادة (يوم 12-14). وبفعل التصلب العصبي المتعدد وEAE من قبل خلايا T autoreactive أن اختراق الجهاز العصبي المركزي. هذه الخلايا T تفرز كيموكينات والسيتوكينات التي تقود إلى تجنيد مزيد من الخلايا المناعية. ولذلك، فإن توزيع الخلايا المناعية في الحبل الشوكي دأورينغ مراحل المرض الثلاثة تم التحقيق. لتسليط الضوء على نقطة زمنية من هذا المرض الذي تفعيل / انتشار / تراكم خلايا تي، الخلايا البائية وحيدات يبدأ، وجرى تقييم أيضا توزيع الخلايا المناعية في العقد اللمفاوية والطحال والدم. وعلاوة على ذلك، تم تحديد مستويات عدة السيتوكينات (IL-1β، IL-6، IL-23، TNFα، IFNγ) في مراحل المرض الثلاثة، إلى التبصر في العمليات الالتهابية للمرض. في الختام، تقدم البيانات لمحة عامة عن التعريف الوظيفي للخلايا المناعية خلال EAE علم الأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصلب المتعدد (MS) ونموذج حيواني المقابلة لها، التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت)، تظهر التغييرات neuroinflammation المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). في وقت مبكر تتميز النشطة آفات التصلب العصبي المتعدد وEAE عن وجود خلايا مناعية تسلل. مسببات مرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف، ولكن يعتبر على نطاق واسع لإشراك تدمير المايلين بوساطة خلايا T autoreactive. هذه الخلايا T autoreactive تفرز السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات التي تجذب الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا البائية، وحيدات والعدلات من التداول. حيدات تفرق في الضامة. الانترفيرون غاما (IFNγ) التي يفرزها الخلايا التائية autoreactive يستقطب الضامة في الضامة الموالية للالتهابات. الموالية للالتهابات السيتوكينات الإفراج الضامة وأنواع الاكسجين التفاعلية التي تعزز موت الخلايا المبرمج في الخلايا قليلة التغصن. وفاة قليلة التغصن يؤدي إلى إزالة الميالين. وعلاوة على ذلك، وخلايا B تفرق في صخلايا lasma والأجسام المضادة الافراج ضد غمد المايلين، مما أدى في نهاية المطاف إلى تدهور المايلين. فقدان المايلين يؤدي إلى تدهور من المحاور والخلايا العصبية وبالتالي إلى تكوين مواقع الآفة في الجهاز العصبي المركزي والتي تمثل السمة الرئيسية لمرض التصلب العصبي المتعدد 1. في محيطها، يتم تنشيط خلايا T والخلايا B في الغدد الليمفاوية، فإنها تتكاثر في الطحال والهجرة من خلال تداول في النظام العصبي المركزي. وحيدات العدلات تتكاثر في نخاع العظام وأيضا تهاجر من خلال تداول في النظام العصبي المركزي.

الكريات البيض التسرب من نخاع العظم والطحال والغدد الليمفاوية في الدم أو من مجرى الدم إلى الجهاز العصبي المركزي هو عملية متعددة الخطوات التي تعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك التفاعلات الجزيئية بين الكريات البيض والبطانة بوساطة كيموكينات ومستقبلات chemokine. إنتاج كيموكينات من مختلف أنواع الخلايا يمكن أن يتسبب خلال reactio المناعةن من السيتوكينات مثل عامل نخر الورم α (TNFα)، IFNγ وانترلوكين 6 (IL-6)، التي تجند في وقت لاحق الخلايا المناعية لموقع التهاب 2،3. الخلايا المناعية تمثل مجموعة فرعية من المستقبلات chemokine على سطحها، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا ومسار الهجرة إلى الموقع التهابات. وبالتالي، يتم التعبير عن CXCR2، CCR1 وCXCR1 على العدلات الناضجة في نخاع العظام والدم 4، وربط بروابط لها، CXCL2، CCL5 أو CXCL6، على التوالي، وينشط العدلات وتعزز التصاق على البطانة وفي وقت لاحق، وهجرة الخلايا إلى أنسجة 5-9. CCL2 وCCL20 جذب وحيدات الخلايا TH1 / Th17 10، التي تعبر عن CCR2 11 و CCR6 12، على التوالي. CCR1 وCCR5، التي عبر عنها أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك خلايا T، وحيدات الضامة 13، ربط CCL3، CCL5 وCCL7 وupregulated خلال MS 14. وأعرب عن CXCR3 على خلايا T ويربط CCL9، CCL10 وCCL11 15.

استراتيجية واحدة رئيسية في علاج مرض التصلب العصبي المتعدد هو استنزاف الخلايا المناعية أو منع تسلل الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فقد تم التحقيق في تثبيط مستقبلات chemokine محددة في EAE. العداء أو الحذف الوراثي للCCR1 16، CCR2 17، CCR7 18 أو CXCR2 19 يقلل EAE علم الأمراض، في حين أن العداء أو الحذف الوراثي للCCR1 20، لم CCR5 20 أو CXCR3 21 لا يقلل من الأمراض. وبالتالي، فإن التعبير عن مستقبلات chemokine محددة على الكريات البيض هو أمر حاسم لتسلل هذه الأخيرة في الجهاز العصبي المركزي ويملي مسار EAE.

استنزاف الخلايا المناعية هو استراتيجية فعالة لعلاج مرضى التصلب المتعدد، وذلك لأن الخلايا المناعية تسلل تطلق السيتوكينات، مثل TNFα، IL-6 و IL-1β، التي، بدورها، وتعزيز عملية التهابية أو تدهور الخلايا العصبية 22. وعلاوة على ذلك، لصناعة السياراتخلايا TH1 رد الفعل تطلق IFNγ، والذي بدوره يحفز الضامة للافراج عن TNFα، IL-1β و IL-23.

توضح هذه المخطوطة تحريض EAE، وتحديد توزيع الخلايا المناعية ومستويات خلوى (مرنا) في الأنسجة المختلفة في الفئران EAE. تم عزل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة أثناء المرض إلى تقديم لمحة عامة تعتمد على الوقت من العمليات الالتهابية التي تؤدي في النهاية إلى تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأخلاق بيان: وافقت لدينا إجراءات تجريبية لجنة الأخلاقيات في Regierungspräsidium دارمشتات (ألمانيا)، وتأكيد للوائح الأوروبية الوطنية و. تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة.

1. EAE نموذج

  1. تحريض نموذج EAE
    1. استخدام عمره 13 أسبوع-10- لأنثى 129S4 / SvJae × C57BL / 6 الفئران لتحريض EAE.
    2. إعطاء الفئران حقن تحت الجلد، في أعلى وأسفل الظهر، من MOG 35 دماغي المنشأ - 55 (المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري) الببتيد (200 ميكروغرام)، مستحلب في 200 ميكرولتر كاملة Freund`s مساعد (CFA) التي تحتوي على 400 ميكروغرام المتفطرة السلية.
      ملاحظة: ونتيجة ل، ومراقبة صورية حمل غير مرض سلبية، مساعد ناقصة فرويند تحتوي على المتفطرة السلية، في نفس الحجم ونفس الطريق، ويمكن استخدامها.
    3. ذرeafter، ومرة ​​أخرى بعد 24 ساعة، وإعطاء الفئران حقن داخل الصفاق من السم السعال الديكي (في مجموع 0.2 ميكروغرام، مخففة في 200 مخزنة المالحة الفوسفات ميكرولتر، PBS). استخدام الفئران غير المعالجة مثل السيطرة على المجموعة، لتكون قادرة على المقارنة المريضة مع الحيوانات السليمة.
      ملاحظة: من الممكن أيضا للحث على EAE مع 200-300 ميكروغرام MOG 35-55 الببتيد، 300-500 ميكروغرام من المتفطرة السلية في CFA و0،2-0،3 ميكروغرام السعال الديكي السم في حجم 0،1-0،2 مل لكل الحقن.
    4. بدأ أسبوع واحد بعد الحقن، ودراسة الفئران يوميا لأعراض سريرية (راجع الخطوة 1.2.1)
      ملاحظة: في يوم بداية ظهور أعراض المرض تختلف في تجارب مختلفة، ولكن في ظل الظروف المختبر لدينا، وهذا هو اليوم حوالي 11 وهكذا، وهنا يتم تعريف يوم 14 كما بعد 3 أيام بداية ظهور أعراض المرض. وضعت جميع الفئران في هذه الدراسة الأعراض السريرية.
  2. سجل من الفئران
    1. تصنيف الأعراض السريرية من قبل عشرات من السريرية كما يلي:0) أي علامات، 0.5) الشلل البعيدة من الذيل، 1) الشلل التام من الذيل، 1.5) ذيل يعرج وضعف خفيف من رجليه الخلفيتين، 2) ذيل يعرج وضعف شديد في رجليه الخلفيتين، 2.5) ذيل يعرج وشلل واحد الساق الخلفية، 3) ذيل يعرج والشلل من ساقيه الخلفيتين، 3.5) الشلل كل من أطرافه الخلفية وضعف الطرف الصدارة واحدة (الموت الرحيم كانت الفئران تحقيق هذه النتيجة، وذلك تمشيا مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية).

2. إعداد الخلايا واحدة لتحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: يتكون خليط الضد من 1 ميكرولتر CD45-Vioblue، 2 ميكرولتر CD8-eFluor650، 0.5 ميكرولتر CD11b-eFluor605، 0.5 ميكرولتر F4 / 80-PE-Cy7، 1 ميكرولتر CD3-PE-CF594، CD4-V500، 0.5 ميكرولتر CD11c و -AlexaFluor700، 1 ميكرولتر CD19-APC-H7 و 1 ميكرولتر Ly6G-APC-Cy7.

ملاحظة: إذا كنت تأخذ الدم، العقدة الليمفاوية والطحال والنخاع الشوكي ثم هذا الإجراء هو على النحو التالي: يتم تخدير عميق الفئران مع مزيج من isoflurane (2٪ في كربوجين في الدقيقة) والكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم). بجانب فتح القفص الصدري، وإزالة الدم مع عصا intracardial ويروي الفئران intracardially مع برنامج تلفزيوني الباردة. ثم إزالة العقد الليمفاوية تليها الطحال وأخيرا الحبل الشوكي. إذا كنت لا تحتاج إلى يروي الفئران intracardially ثم الموت ببطء الفئران تحت التخدير العميق عن طريق خلع الرقبة.

  1. عزل splenocytes
    1. تخدير الفئران مع مزيج من الأيزوفلورين (2٪ في كربوجين في الدقيقة) والكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم).
    2. منطقة شق الرطب مع 80٪ الأيزوبروبانول لتجنب أي تلوث مع الشعر وفتح القفص الصدري طوليا، دون ثقب الأنسجة العميقة، وذلك باستخدام المقص.
    3. يروي الفئران intracardially مع الباردة PBS 7.0 درجة الحموضة 23.
      ملاحظة: يقع الطحال في اليسرى رباعي البطن متفوقة تحت القفص الصدري. إلا إذا كان هو أن تدرس الطحال، قد تتم إزالة هذا الجهاز قبل نضح من أجل البيع بالتقسيطن جميع أنواع الخلايا في المصالح.
    4. إزالة الطحال وقطع ما يقرب من 1/8 وتزن عليه. تخزين العينة في برنامج تلفزيوني على الجليد.
    5. الضغط على أنسجة الطحال من خلال شبكة غربال 70 ميكرون (وضعت على أنبوب 50 مل)، وذلك باستخدام المكبس من حقنة 2 مل.
    6. غسل يتناغم مع 5 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 3 دقائق. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر الناشر الحل.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، قد يكون من الضروري لجعل خلية التفريقي إذا، في وقت لاحق، يتم استخدام طريقة تحليل FACS البديلة التي لا توظف الخرز (انظر القسم 3).
    7. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في درجة حرارة الغرفة (RT).
    8. كرر الخطوة غسل 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تجاهل طاف، resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر 0.2٪ زلال المصل البقري (BSA) / برنامج تلفزيوني، إضافة 2 ميكرولتر التيسير مستقبلات 1 (FcRI) عازلة تمنع واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    9. إضافة 13 ميكرولتر منخليط tibody، احتضان 15 دقيقة في RT في الظلام، إضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في RT. تجاهل طاف.
      ملاحظة: يوصي الإجراء تلطيخ الشركة المصنعة غسل واحد، ولكن يمكن تحقيق تخفيض إضافي لتلوين الخلفية بتكرار اختياريا الخطوة غسل واحد أو اثنين من أكثر الأوقات.
    10. Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر PBS (أو عازلة إمكانية الترشح للانفصال بروتين، وقد تصل لحد من تكتل الخلية) وتحويلها إلى التدفق الخلوي أنبوب. تبقي الخلايا على الجليد.
  2. عزل خلايا العقدة الليمفاوية
    1. تخدير الفئران مع مزيج من الأيزوفلورين (2٪ في كربوجين في الدقيقة) والكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم).
    2. منطقة شق الرطب مع 80٪ الأيزوبروبانول وفتح القفص الصدري طوليا باستخدام المقص. يروي الفئران intracardially مع الباردة PBS 7.0 درجة الحموضة 23.
    3. لعزل العقدة الليمفاوية الأربية، وإزالة بعناية الجلد في منطقة مرحباص واختيار العقدة الليمفاوية بعناية من الأنسجة الدهنية بالملقط. تزن العقدة الليمفاوية الأربية وتخزين العينة في برنامج تلفزيوني على الجليد.
      ملاحظة: استخدمنا الغدد الليمفاوية الأربية في دراستنا لO`Connor وآخرون. وجدت أن أعدادا كبيرة من وحيدات تفعيلها، الضامة، العدلات وخلايا T وكانت جميع الحاضرين في الغدد الليمفاوية الأربية بعد EAE تحريض 24.
    4. ضغط العقدة الليمفاوية من خلال 70 ميكرون شبكة غربال (وضعت على أنبوب 50 مل) باستخدام المكبس من حقنة 2 مل.
    5. غسل يتناغم مع 5 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 2400 x ج لمدة 8 دقائق. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر 0.2٪ BSA / برنامج تلفزيوني، إضافة 2 ميكرولتر FcRI عازلة تمنع واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    6. إضافة 13 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة، واحتضان 15 دقيقة في RT في الظلام، وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في RT.
    7. تجاهل طاف، resuspend الكرية الخلية في 300 ميكرولتر PBS (أو منطقة عازلة تشغيل مناسب) وتحويلهالأنبوب التدفق الخلوي.
  3. عزل خلايا الدم
    1. إضافة 50 ميكرولتر 20 ملي HEPES إلى 50 الدم ميكرولتر (استقر مع EDTA) وإضافة 500 ميكرولتر الناشر الحل. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في RT. تجاهل طاف وكرر الخطوة غسل.
    2. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر 0.2٪ BSA / برنامج تلفزيوني، إضافة 2 ميكرولتر FcRI عازلة تمنع واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    3. إضافة 13 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة، واحتضان 15 دقيقة في RT في الظلام، وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في RT. تجاهل طاف، resuspend الكرية الخلية في 300 ميكرولتر PBS وتحويلها إلى التدفق الخلوي أنبوب.
  4. عزل الخلايا في النخاع الشوكي
    1. تخدير الفئران مع مزيج من الأيزوفلورين (2٪ في كربوجين في الدقيقة) والكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم).
    2. منطقة شق الرطب مع 80٪ الأيزوبروبانول وفتح القفص الصدري طولياباستخدام المقص. يروي الفئران intracardially مع الباردة PBS 7.0 درجة الحموضة 23.
    3. الرطب منطقة شق على ظهره وجعل مرة أخرى قطع طولية مع مشرط وإزالة الجلد.
    4. قطع الجزء القطنية من العمود الفقري (الذي يعصب أطرافه الخلفية) ومسح هذا مع حقنة مليئة برنامج تلفزيوني لاستخراج النخاع الشوكي. قطع ما يقرب من 1/3 من الحبل القطني، يزن هذا وتخزين العينة في برنامج تلفزيوني على الجليد.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، إضافة 500 ميكرولتر حل الخلية المفرزة وHBSS (1: 1). إضافة 3 ملغ / مل كولاجيناز ألف و1 وحدة / مل الدناز الأول، قطع الرأس الخلايا عن طريق تكرار صعودا وهبوطا pipetting لواحتضان لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية في 400 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: إذا كان يفضل، يمكن مسح تعليق خلية من تلويث المايلين والحطام الخلوي عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي التي قد تؤدي إلى تحسين حساسية التدفق الخلوي القياس، وبالتالي، والحد من خلفية تألق ذاتي لد عدد من الأحداث التي تحتاج إلى الحصول عليها (انظر القسم 3.5).
    6. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. تجاهل طاف، resuspend الكرية في 1 مل 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) / الأساسية الدنيا والمتوسطة Dulbecco و(DMEM) وقطع الرأس الخلايا مرة أخرى عن طريق تكرار صعودا وهبوطا pipetting ل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الخطوة الغسيل.
    8. resuspend الكرية خلية في 1 مل برنامج تلفزيوني وضغط على الحبل الشوكي من خلال شبكة غربال 70 ميكرون (وضعت على أنبوب 50 مل) باستخدام المكبس من حقنة 2 مل.
    9. غسل يتناغم مع 4 مل في برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 3 دقائق على RT. تجاهل طاف، resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر 0.2٪ BSA / برنامج تلفزيوني، إضافة 2 ميكرولتر FcRI حجب كاشف واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    10. إضافة 13 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة، واحتضان 15 دقيقة في RT في الظلام، وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 650 x ج في RT.
    11. تجاهل طاف، resuspend وبيلي خليةتي في 500 ميكرولتر PBS (أو منطقة عازلة تشغيل مناسب) وتحويلها إلى التدفق الخلوي أنبوب.

3. تحليل تدفق Cytometric

  1. عاير جميع الأجسام المضادة مسبقا لتحديد تركيزات الأمثل كما وصفها Olesch وآخرون. 25.
  2. استخدام الخرز التعويض التقاط الأجسام المضادة للتعويض أحادية اللون لخلق متعددة الألوان المصفوفات التعويض وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. السيطرة على معايرة الأدوات يوميا باستخدام الخرز محددة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. مباشرة قبل التدفق الخلوي القياس، إضافة 30 ميكرولتر تدفق cytometric مستوى العد المطلق للخلايا (لعزل انظر القسم 2.1، 2.2، 2.3، 2.4) لتحديد عدد الخلايا المطلقة. بدلا من استخدام الخرز عد الخلايا يمكن عدها.
  5. تناول العينات (الخلايا من الطحال والعقد اللمفاوية والدم: 100،000 الأحداث، والحبل الشوكي: 500،000 الأحداث) في قياس التدفق الخلوي لالثانية تحليلها باستخدام برامج معينة التدفق الخلوي.
    1. فتح البرنامج التدفق الخلوي وإضافة 3.0 الملفات FCS عن طريق الضغط على زر "إضافة عينات".
    2. فتح ملف أضاف بالنقر المزدوج. ضبط قنوات لX- ومحور y. لتحديد السكان الخلية التي تهم إنشاء بوابة (انظر الشكل 4).

4. التحليل الكمي PCR

  1. عزلة من مرنا والنسخ إلى كدنا]
    1. استخراج مرنا من الحبل الشوكي القطني (1/3) والطحال (1/8) والغدد الليمفاوية الأربية من الفينول الكلوروفورم ويعجل مع الإيثانول 26.
      1. لهذا، تجانس النسيج في 1 مل guanidinium ثيوسيانات الفينول الخليط، واحتضان لمدة 10 دقيقة. إضافة 200 كلوروفورم ميكرولتر واحتضان مرة أخرى لمدة 10 دقيقة.
      2. بعد خطوة الطرد المركزي (18000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية)، وغسل المرحلة المائية العليا هو مع 500 الأيسوبروبانول ميكرولتر وأجهزة الطرد المركزي (18000 x ج لمدة 8 دقائق في 4° C).
      3. غسل بيليه مع 500 الايثانول ميكرولتر وبعد خطوة الطرد المركزي (18000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية)، تجفيف بيليه في المكثف فراغ (5 دقائق عند 30 درجة مئوية). بعد ذلك، resuspend وبيليه في 30 ميكرولتر المياه.
    2. لاستخراج مرنا من الدم، الطرد المركزي 500 ميكرولتر استقرت EDTA الدم (300 x ج 10 دقيقة 4 درجة مئوية).
      1. خذ معطف الشهباء، تحتوي على خلايا الدم البيضاء، وتمييع في 1 مل الناشر الحل (150 ملي NH 4 CL، 100 ملم NaHCO 3، 0.1 ملي نا-EDTA 7.4 درجة الحموضة).
      2. بعد 10 حضانة دقيقة في RT، الطرد المركزي الخلايا في 650 x ج لمدة 6 دقائق ويغسل بعد ذلك مرتين مع برنامج تلفزيوني.
      3. استخراج مرنا من خلايا الدم البيضاء (الكريات البيضاء) باستخدام عدة لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. أداء التوليف [كدنا استخدام عدة لتخليق [كدنا بما في ذلك hexamers عشوائي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 200 نانوغرام مرنا للكنديوالتوليف.
  2. الكمية PCR
    1. لقياس كمية مرنا محدد، استخدم 1 ميكرولتر كدنا]، 1 ميكرومتر إلى الأمام / الخلف التمهيدي والحمض النووي الفلورسنت صبغة ملزمة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 27. انظر الجدول رقم 1 لمتواليات لمجموعات التمهيدي. قياس CT-قيم IL-1β، IL-6، IL-23، IFNγ، TNFα وPPIA (ببتيديل prolyl إيزوميراز) باستخدام نظام PCR الكمي.
    2. لتحديد التعبير مرنا نسبيا استخدام المقارن طريقة CT (عتبة دورة) 27.
      1. لهذا، وتطبيع CT-قيم الجينات المستهدفة لمستويات التعبير عن PPIA بطرح متوسط ​​CT-قيمة PPIA من الجين المستهدف، كما هو موضح في الدراسات السابقة (Barthelmes وآخرون. 28، Schiffmann وآخرون. 29، Schiffmann وآخرون. 30). وفي وقت لاحق، وحساب ما يسمى ΔΔCT القيم، وذلك باستخدام والتي تطبيع القيم ΔCTمن الجينات المستهدفة من الفئران EAE إلى مستوى التعبير عن الجينات المستهدفة من الفئران غير المعالجة، ومرة ​​أخرى من خلال طرح متوسط ​​ΔCT القيمة في الفئران غير المعالجة من القيمة ΔCT في الفئران EAE.
      2. للحصول على التعبير مرنا نسبيا من الجين المستهدف، وحساب نسبة استخدام الصيغة التالية: 2 - ΔΔct.
  3. اختبار خصوصية كل التمهيدي. تحديد حجم جزء تضخيمها باستخدام الاغاروز هلام 2٪ 31. ويظهر حجم جزء في الجدول 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يعطي لمحة التخطيطي من الطرق المختلفة الموضحة في هذه المقالة. يتلقى 1) الفئران حقنة من MOG 35-55 مستضد وتتطور لديهم أعراض السريرية الأولية بعد 10.7 ± 0.3 أيام 28. ويرد مسار المرض تمثيلية من EAE الفئران في الشكل 1. 2) أنسجة مختلفة (الطحال والغدد الليمفاوية، والحبل الشوكي القطني) ويتم استخراج الدم من السيطرة وEAE الفئران عند نقاط زمنية مختلفة خلال مرحلة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقت نموذج EAE هو موضح هنا بأكبر قدر من الاهتمام كنموذج للمرض التصلب العصبي المتعدد، ويستخدم بشكل روتيني في اختبار الاستراتيجيات العلاجية لمرض التصلب العصبي المتعدد 32. المرض الماوس يسلك العديد من المظاهر السريرية والنسيجية مرض التصلب العصبي المتعدد وسببه تحريض المناعة الذاتية لمستضدات الخلايا العصبية. ويرتبط توعية لمستضدات المايلين مع الدم في الدماغ ضعف الحاجز وبالتالي، تسلل الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن الخلايا المناعية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJP هو مستشار لشركة Xellia و Leo Pharmaceuticals.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مجموعة التدريب البحثي لمؤسسة Else Kröner-Fresenius (EKFS) Translational Research Training Group - Pharma (TRIP) ومن قبل "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE) و Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" في ولاية هيسن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام الكشف عن التسلسل ABI Prism 7500  Applied Biosystems ، أوستن ، الولايات المتحدة الأمريكيةنظام PCR الكمي
AccutaseSigma Aldrich ميونيخ ، ألمانياA6964حل انفصال الخلايا
CD3-PE-CF594BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا562286
CD4-V500BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا560782
CD8-eFluor650eBioscience ، فرانكفورت ، ألمانيا95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, فرانكفورت, ألمانيا93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, هايدلبرغ, ألمانيا560583
CD19-APC-H7 BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا560143
CD45-Vioblue   ؛Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-092-910
CompBeadsBD ، هايدلبرغ ، ألمانيا552843تعويض الخرز
Collagenase ASigma Aldrich ميونيخ ، ألمانياC0130
معيار العد المطلق Cytometric   ؛Polyscience, Eppelheim, GermanyBLI-580-10
إعداد وتتبع الخرز مقياس الخلوي BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا642412
DNase ISigma Aldrich Munich ، ألمانياD5025
EAE KitHooke Laboratories ، لورانس ، الولايات المتحدة الأمريكيةEK2110
F4 / 80-PE-Cy7   ؛BioLegend ، Fell ، ألمانيا123114
First Strand cDNA-Synthesis kit   ؛Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانياK1612
Fc receptor-1 blocking buffer   ؛Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-092-575
معيار العدد المطلق لقياس التدفقالخلوي Polyscience ، Eppelheim ، ألمانيا580
برنامج FlowJo v10 & nbsp ؛Treestar ، Ashland ، الولايات المتحدة الأمريكيةبرنامج قياس التدفق
الخلوي LSRII / Fortessa   ؛BD ، هايدلبرغ ، ألمانيامقياس التدفق الخلوي
Ly6G-APC-Cy7   ؛BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا560600
محلول Lysing BD ، هايدلبرغ ، ألمانيا349202
Maxima SYBR Green & nbsp ؛Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانياK0221صبغة ربط الحمض النووي الفلورية   ؛
مجموعة RNeasy الصغيرة Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا74104طقم استخراج الحمض النووي الريبي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409(2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187(2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136(2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisMultiple Sclerosis ModelMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freunds AdjuvantPertussis Toxin InjectionLymph Node IsolationSpinal Cord DissectionSpleen Immune CellsFlow Cytometry AnalysisCytokine Expression Analysis

مقالات ذات صلة