مقالة منهجية

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم الأجنة عن طريق المناعية

DOI:

10.3791/53949

⸱

أبريل 12, 2016

 ,  ,  , 
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الخلايا العصبية الأولية هو عملية ديناميكية ومعقدة أثناء التطور الجنيني تحدد التخطيط الأولي للجهاز العصبي المركزي. خلال هذه العملية ، يخضع جزء من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز ويؤدي إلى ظهور المجموعات الأولى من الخلايا العصبية الأولية المتمايزة داخل الجهاز العصبي المركزي الناشئ. تم استخدام العديد من الكائنات الحية النموذجية للفقاريات لاستكشاف آليات تحديد مصير الخلايا العصبية والنمذجة والتمايز. من بين هذه الضفدع الأفريقي المخالب ، Xenopus ، الذي يوفر نظاما قويا للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن تكوين الخلايا العصبية الأولية بسبب تطوره السريع ويمكن الوصول إليه وسهولة التلاعب الجنيني والجزيئي. هنا ، نقدم طريقة مريحة وسريعة لمراقبة المجموعات السكانية المختلفة للخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي Xenopus. باستخدام تلطيخ الأجسام المضادة والتألق المناعي على أقسام من أجنة Xenopus ، يمكننا مراقبة مواقع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية المتمايزة أثناء تكوين الخلايا العصبية الأولي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الفقاريات، وتطوير الجهاز العصبي المركزي وتشمل عدة مراحل مميزة بعد التوالي. الخطوة الأولى هي الحث العصبي، وعندما يتم تحديد خلايا الأدمة ساذجة نحو مصير العصبي بدلا من مصير البشرة. وتشارك عدة آليات تنظيمية مترابطة خلال هذه المرحلة في القيطم وأنظمة نموذج الأخرى 1،2. ويتم تنسيق هذه العملية في المقام الأول بسبب عوامل يفرز التي تنتجها الأديم المتوسط ​​الكامنة، مثل chordin، رأس، وفوليستاتين 3-7. بعد تحريض العصبي، مجموعة فرعية من الأسلاف العصبية الخروج من دورة الخلية وتبدأ في التفريق في العملية المشار إليها الخلايا العصبية كما الابتدائي. ليس كل السلائف العصبية تفرق في هذا الوقت. تستمر الخلايا العصبية السلائف المتبقية على التكاثر، وبالتالي الحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لاستمرار نمو الجهاز العصبي المركزي في جميع أنحاء التنمية وفي مرحلة البلوغ.

هذه العلاقات العامةoliferating الخلايا العصبية السلائف تتميز التعبير عنها من SRY (الجنس تحديد المنطقة Y) -box 3 (sox3) الجين 8-11. يتم تحديد سكانية أخرى من الخلايا، التي الخروج من دورة الخلية والالتزام مصير متباينة، من خلال التعبير عن علامات التمايز الجيني، تويولين، بيتا 2B الدرجة بنك الاستثمار الدولي (tubb2b، N-الحوض) والمايلين عامل النسخ 1 (myt1) 12-14. هذه الخلايا العصبية متباينة في نهاية المطاف تؤدي إلى فئات مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والسيارات، المشترك بين، والخلايا العصبية الحسية المتمركزة في مناطق متميزة داخل الأنبوب العصبي 15-17.

في حين تم بذل جهود كبيرة لكشف الآليات التنظيمية التي تحكم الزخرفة ومصير تحديد الأحداث في الأديم الظاهر العصبي الأمامي، أحرز اهتماما أقل على التحقيق في الأحداث العصبية التي تحدث بعدمرحلة الزخرفة الأولية. في الواقع، نقل الإشارة واللوائح النسخي، وكذلك التعديلات بعد متعدية وجميع المشاركين في هذه المرحلة في وقت لاحق، والسيطرة على كل من توقيت والنسب مواصفات خلال تكوين الخلايا العصبية 18-20. وتتطلب المزيد من التحقيقات في هذه الآليات وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتصور بسهولة وتميز مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية. N-الحوض المذكور أعلاه علامات العصبية، بما في ذلك، Sox3، Myt1، و، يمكن أن توفر وسيلة للتعرف على هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا، وبالتالي توفير الأسس اللازمة للكشف عن الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا العصبية 21-23.

وعلى الرغم من تظاهر العلامات التفاضلية للسكان الخلية العصبية في الكائنات نموذج أخرى، استغل عدد قليل نسبيا من الدراسات النظام القيطم على أكمل وجه في هذا الصدد. ويرجع ذلك أساسا إلى قلة من الأجسام المضادة متوافقة التي تحدد موثوق neur مختلفالسكان الخلية اونال في الأنبوب العصبي. هنا، نحن تصف طريقة لتصور تمايز الخلايا العصبية في الأجنة القيطم في وقت مبكر عن طريق المناعية، التي توفر نهجا قويا ومريحة للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم. هذا البروتوكول يجب أن تعطي توجيهات كافية للباحثين المهتمين في التنمية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي القيطم بين مرحلة ومرحلة 26 45.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع التجارب على الحيوانات من جامعة مركز رعاية الحيوان مانشستر وكانت مغطاة من قبل الترخيص المملكة المتحدة وزارة الداخلية مشروع.

1. جمع وتثبيت للالقيطم الأجنة

  1. تحضير الكواشف والمواد اللازمة للتجارب.
    1. إعداد 10X مارك في التعديل قارعو الأجراس (MMR) عن طريق إذابة 56.5 غرام من كلوريد الصوديوم في الماء عالى النقاء حوالي 800 مل وإضافة حلول الأوراق المالية من 1 م بوكل، 1 م MgSO 4، 1 م CaCl 2، و 1 M HEPES 7.4 درجة الحموضة لتحقيق تركيز النهائي من 20 ملي بوكل، 10 ملي MgSO 4 و 20 ملي CaCl 2، 50 ملي HEPES. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بنسبة 10 M هيدروكسيد الصوديوم ثم ضبط الحجم النهائي إلى 1 L.
    2. تعقيم حل 10X MMR قبل التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة على دورة السائل. على استخدام، وتمييع مع ده 2 O إلى 0.1X التركيز النهائي وإضافة 20 ملغم / لتر الجنتاميسين لمنع نمو الجراثيم.
    3. جعل 10X حل TBS عن طريق خلط 24 جم تريس، حمض الهيدروكلوريك، 5.6 غرام تريس ببورصة عمان، 88 غ كلوريد الصوديوم وحل في حوالي 900 مل من الماء عالى النقاء. والحل النهائي لها قيمة الرقم الهيدروجيني حوالي 7.6. ضبط مع إما 10 M هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك المركز لتحقيق درجة الحموضة النهائية من 7.6 والحجم النهائي إلى 1 L.
    4. على استخدام، وجعل TBS 1X عن طريق تمييع 1 جزء من 10X حل TBS مع 9 أجزاء من الماء عالى النقاء.
    5. جعل 10X MEM الملح عن طريق إذابة 209،2 ز اجتماعات الأطراف في حوالي 800 مل من الماء عالى النقاء واضاف الحلول الأسهم من 0.5 M EGTA و1M MgSO 4 لتحقيق تركيز النهائي من 20 ملي EGTA، 10 ملي MgSO 4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بنسبة 10 M هيدروكسيد الصوديوم ثم ضبط الحجم النهائي إلى 1 L.
    6. تعقيم الحل MEM الملح قبل التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة على دورة السائلة (الحل قد تتحول الصفراء من قبل بضعة أشهر من التخزين في درجة حرارة الغرفة أو بعد أن تم تعقيمها ذلك، ولكن هذا التغيير في اللون لا يؤثر استخدامه ). ومع ذلك، لا تستخدم الحل بعد التخزين لفترات طويلة (أكثر من 6 أشهر).
    7. جعل 1X MEMالاتحاد الانجليزي حل عن طريق تمييع 1 جزء من MEM أملاح، جزء 1 من 37٪ الفورمالديهايد مع 8 أجزاء من النقاوة المياه (ت / ت، مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع على الأقل).
    8. إعداد بارافورمالدهيد 4٪ في TBS (لتلطيخ لاحقة تشمل phalloidin) عن طريق إذابة 4 غرام من مسحوق امتصاص العرق في 100 مل من محلول 1X TBS الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من 10 M هيدروكسيد الصوديوم لمساعدة حل. قسامة في 5-10 حجم مل وتجميد في -20 درجة مئوية. عدم إعادة تجميد إذابة مرة واحدة.
      تنبيه: لامتصاص العرق مسحوق هو مصدر إزعاج وسام في حالة استنشاقه، وبالتالي يجب أن يتم تنفيذ الخطوة وزنها في غطاء الدخان.
    9. تسمية العديد من قوارير الزجاج 4 مل مع قبعات المسمار قبل جمع العينات.
    10. إعداد 15٪ الجيلاتين / 15٪ سكروز بصب 20 مل من 40٪ الجيلاتين الأسماك (قبل الحرارة في 50 ° C حمام الماء) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 8 غرام من السكروز وملء الأنبوب إلى خط 50 مل مع 1X TBS.
    11. وضع أنبوب الجيلاتين في خلاط دوارة أو سرير المتداولخلط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. هذا الحل الجيلاتين مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. لا تستخدم حل منتهية الصلاحية ولا تجميد ذوبان الجليد.
  2. إعداد وإصلاح اكس. المورق أو اكس. مداري أجنة مثقف لمراحل المرغوب.
    1. ثقافة اكس المخصبة المورق أو اكس. مداري الأجنة في MMR 0.1X مع الجنتاميسين حتى المراحل المطلوبة.
      ملاحظة: عموما، وجمع الأجنة بين المراحل 23 و 40. جمع في وقت لاحق من الأجنة بعد مرحلة 40 ممكنة، وخاصة عند مراقبة نمو محور عصبي من الحبل الشوكي، ولكن نأخذ في الاعتبار أن قتا إضافيا اختراق الجيلاتين قد يكون مطلوبا. الأجنة قد يكون من النوع البري، المعدلة وراثيا، متحولة، المانع المعالجة، Morpholino (MO) -injected، أو electroporated 23،24.
    2. جمع 20-50 الأجنة في كل قارورة زجاجية 4 مل، وإزالة الكثير من المتوسطة ممكن واستبدالها مع MEMFA.
      ملاحظة: إذا كان ينطوي على تلطيخ لاحقة phalloidin، استخدم 4٪ امتصاص العرقبدلا من MEMFA منذ حلول الفورمالديهايد زودت التجارية عادة ما تحتوي على ما يصل إلى 10٪ الميثانول باعتبارها عامل استقرار من شأنها أن تتداخل مع تلطيخ phalloidin.
    3. إصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، أو إذا كان في حاجة ملحة، في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على خلاط دوارة. سوف الأجنة تكون مستقرة في حل التثبيت لا يقل عن 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
    4. بعد التثبيت، وغسل الأجنة 3 مرات لمدة 20 دقيقة باستخدام 1X TBS مع 0.05٪ تريتون X-100. بعد غسل النهائي، وإزالة الكثير من TBS-تريتون ممكن، وإضافة 3 مل من 15٪ الجيلاتين / 15٪ سكروز في كل قارورة.
    5. ضع قارورة على الأسطوانة السرير بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. لالأجنة التي يزيد عمرها عن المرحلة 40، واستخدام لا يقل عن 24 ساعة من وقت الاختراق. بعد الاختراق، والشروع فورا في القسم 2.2 في اليوم التالي.

2. تركيب وCryosectioning من القيطم الأجنة

  1. تحضير الكواشف والمواد اللازمة للتجارب.
    1. خذ مربع واحد من القائم إيجابياإد الشرائح، يتم فتحها بشكل مثالي.
      ملاحظة: إذا فتحت، والحفاظ على الشرائح في حالة الجافة (مثل مربع الجافة) واستخدام في غضون شهر 1 لضمان الحفاظ على التهمة ثابتة على الشرائح. لا تستخدم شرائح منتهية الصلاحية منذ عينات سوف تسقط خلال المناعية.
    2. قبل البرد الغرفة ناظم البرد إلى -30 درجة مئوية. تعيين المعلمات الصك -35 درجة مئوية لمدة مشراح و 12 ميكرون سمك الباب. تثبيت لوحة غطاء زجاجي سميك على خشبة المسرح، والسماح للناظم البرد تتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل أن يبدأ القسم.
    3. إعداد فرش الرسم لنقل قسم شرائط، والحفاظ على داخل الغرفة ناظم البرد.
    4. إعداد أقلام للكتابة على الشرائح، ووضعها في درجة حرارة الغرفة.
    5. ارتداء القفازات أثناء cryosection. لا تستخدم بأيديهم العارية.
  2. تصاعد القيطم الأجنة
    1. نضح بعناية 5-10 الأجنة من قارورة زجاجية باستخدام البلاستيك أو الزجاج ماصة دون إدخال فقاعات الهواء. نقل الأجنة فيإلى غرفة التركيب و مراقبة تحت المجسام. تملأ الغرفة مع تصاعد حل الجيلاتين لضمان صلابة من قسم كتلة.
    2. ترتيب الأجنة كما في الشكل 1 باستخدام زوج من ملقط غرامة طرف. بمناسبة توجه رؤساء عن طريق رسم السهم على حافة الغرفة باستخدام علامة التجميد المتوافقة. لمجموعات متعددة من الأجنة، كتابة وصف كل مجموعة على حافة الغرفة المقابلة كذلك.
    3. وضع بعناية غرفة أفقيا في مربع رغوة تملأ نصف مع الثلج الجاف وإغلاق الغطاء. نلاحظ تصاعد تجميد الغرفة في 5-10 دقيقة. معالجة كل غرفة بشكل متسلسل (أي وضع الغرفة السابقة على الثلج الجاف قبل الانتقال إلى المرحلة التالية) حيث سيؤدي ذلك إلى ترك وقت كاف لكل غرفة تجميد ومنع مربع الجليد الجاف لتصبح مكتظة.
      ملاحظة: المجمدة غرف تصاعد لا تحتاج إلى الوقوف أفقيا ويمكن أن تكون مكدسة حتى داخل منطقة الجزاء.
    4. المضي قدما cryosectioning أو، إذا لزم الأمر، والحفاظ على العينات المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة 1-2 ما لا يقل عن أسبوع دون أن تفقد المناعية.
  3. Cryosection من الأجنة القيطم الخيالة
    1. إزالة كتلة العينة المجمدة من الغرفة عن طريق الضغط على الجزء السفلي من الغرفة باستخدام عصا حادة (مثل قلم رصاص).
    2. إضافة عدة قطرات من متوسطة تجميد الأنسجة، (أ البولي ايثيلين جلايكول والبولي فينيل التي تحتوي على الكحول المتوسطة) على القرص عقد العينة وجبل كتلة العينة مع نهاية الأمامي من الأجنة يشير يصل (الشكل 2). السماح للكتلة mounted- يقف داخل غرفة ناظم البرد لحوالي 1 دقيقة أو حتى المتوسطة تجميد الأنسجة حتى تصبح مبهمة.
    3. على الفور تثبيت القرص عقد العينة على مشراح مع الجانب السفلي من كتلة العينة مواجهة. تقليم قبالة جزء من كتلة العينة باستخدام شفرة عندما كتلة العينة لا يزال "لينة" نسبيا للحد من طول كل قسم(اذا رغب). ترك القرص عقد العينة على مشراح لمدة 5 دقائق على الأقل للسماح درجة حرارته لتصل إلى التوازن.
    4. تدريجيا خفض كتلة العينة لأسفل حتى رؤساء الضفادع الصغيرة مرئية من خلال الجيلاتين شفافة. لزيادة سرعة وتقليم، وتطبيق أعلى (سمكا) تحديد سمك الباب (على سبيل المثال 20-25 ميكرومتر) في هذه المرحلة (مثل تمكين خيار "تقليم") ولكن ليس سميكة جدا لكتلة عينة يمكن أن تسقط من القرص عقد عينة . مراقبة أداء ناظم البرد، مثل الحدة وزاوية النصل في هذه المرحلة لضمان جيل من شريط طويل من الأقسام التالية.
    5. مرة واحدة يصبح رؤساء الشرغوف مرئية، وضبط إعدادات ناظم البرد إلى وضعها الطبيعي (على سبيل المثال 10-12 ميكرومتر) ونظيفة كل من مشراح والمرحلة باستخدام فرشاة الطلاء. جعل بلطف 2-3 أقسام على سبيل التجربة باستخدام الإعداد عجلة اليد (لا تستخدم إعداد الآلية) للتأكد من أن شرائح النهائية يمكن أن تشكل شارعIPS، لا تداخل أو التمسك النصل.
    6. تواصل تقليم حتى يتعرض لها رؤساء الضفادع تقريبا (وهذا قد تحتاج الى بعض الخبرة ولكن يمكن تحقيقه). فرشاة قبالة أي الأجزاء المتبقية على المسرح وجمع أقسام عينة سوف تبدأ.
    7. جعل حوالي 10-15 أقسام والسماح لهم بتشكيل شريط طويل.
    8. اقلب لوحة غطاء زجاجي سميك إلى الجانب وإزالة بلطف الشريط من شفرة باستخدام فرشاة الطلاء غرامة طرف وترتيب ذلك على المسرح مع محور مواز طويلا لنصل.
    9. اختيار شريحة واحدة موجبة في درجة حرارة الغرفة، تسميته مع قلم رصاص (والذي لن يتم غسلها خلال العلاجات تلطيخ لاحقة)، اضغط عليه بسرعة ولكن بثبات على الشريط مع الجانب التسمية أسفل وإزالة الشريحة من الغرفة ناظم البرد. إذا فعلت بشكل صحيح، ينبغي للقطاع عصا على الفور إلى الشريحة موجبة الشحنة (الشكل 3A).
    10. كرر هذه الخطوة لدينا 20-30 شرائح على كل انزلقه ومرتبة في الموازي (الشكل 3B). وهذا يكفي لتغطية منطقة في الدماغ كامل اكس الأجنة مداري ومعظم من الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط ​​مناطق اكس. المورق الأجنة.
    11. الهواء الجاف الشرائح لمدة 10 دقيقة، والمضي قدما على الفور، أو تخزين الشرائح في مربع الشرائح في -80 درجة مئوية لمدة 3-6 أشهر على الأقل دون أن تفقد المناعية.

3. المناعية من مقطوع القيطم الأجنة

  1. تحضير الكواشف والمواد اللازمة للتجارب.
    1. إعداد 0.05٪ TBS-تريتون X-100 بإضافة تريتون X-100 إلى 1X TBS لتحقيق تركيز النهائي من 0.05٪. هذا الحل هو مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام. لا تستخدم حل منتهية الصلاحية.
    2. إعداد 5٪ الحرارة المعطل مصل الماعز أو 5٪ BSA في TBST كما عازلة تمنع. أولا، حرارة تعطيل مصل الماعز / الحمل عن طريق وضع ما يقرب من 20-30 مل من الدم في 65 ° C حمام الماء لمدة 30-60 دقيقة. قسامة إلى 1.5 مل الطرد المركزيأنابيب وتجميد في -20 درجة مئوية. لا يلزم إعادة تعطيل عليها باستخدام.
    3. تمييع الدم الحرارة المعطل أو BSA في TBST لتحقيق تركيز النهائي من 5٪ قبل الاستخدام.
    4. إعداد الأجسام المضادة الأولية المناسبة وفقا لالتخفيفات في عرقلة العازلة (على سبيل المثال 1: تويولين 250 المضادة للMyt1 26 / مكافحة الأسيتيل: 500 المضادة للSox3 10،25 / 1). استخدام ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة على كل شريحة.
    5. إعداد الأجسام المضادة الفلورسنت المناسبة (مثل مكافحة فأر / أرنب أحمر فلوري صبغ مترافق الأجسام المضادة) في عرقلة العازلة (عادة 1: 500).
    6. (اختياري) إضافة أحمر فلوري صبغ مترافق Phalloidin (1: 500) إلى مزيج الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن شبكة الأكتين.
    7. (اختياري) إضافة دابي (0.5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) إلى مزيج الأجسام المضادة الثانوية لتصور توطين النووية.
    8. خذ المتوسطة المتزايدة مكافحة تتلاشى من الفريزر وذوبان الجليد في حمام ماء درجة حرارة الغرفة.
  2. المناعية
    1. إزالة الشرائح المجمدة من -80 درجة مئوية ووضعها على قطعة من الورق منشفة داخل غطاء التهوية لا يقل عن 1 ساعة للقضاء على أي قطرات الماء المختصرة، ثم خبز الشرائح المجففة على 85-90 ° C كتلة الحرارة مع شرائح مواجهة لمدة 15 دقيقة لتفعيل آلية التصاق. وأخيرا، اسمحوا الشرائح يبرد إلى درجة حرارة الغرفة (10 دقيقة على الأقل).
    2. ملء جرة تلطيخ مع الأسيتون النقي واحتضان الشرائح في الأسيتون لمدة 10 دقيقة لإزالة الجيلاتين الأسماك. إذا عدة شرائح هي في أن يعامل، ترتيبها على رف تلطيخ. الهواء الجاف إلى شرائح المعالجة لمدة 15 دقيقة في غطاء التهوية. لا إعادة استخدام الأسيتون.
    3. بعناية رسم حلقة حول عينات على الشريحة باستخدام القلم PAP دون لمس العينات. تأكد من أن الخاتم هو المغلقة نفسها بنفسها، وإلا حل الأجسام المضادة سوف تتدفق من خلال تلطيخ. تجف تماما حلقة PAP القلم.
    4. ملء جرة آخر تلطيخ مع 1X TBS دون تريتون X-100. Inserر-الشرائح المجففة في جرة تلطيخ وتسمح الإماهة لا يقل عن 1 ساعة. في غضون ذلك، وإعداد عازلة تمنع عن طريق تمييع إما الحرارة المعطل مصل الماعز أو BSA إلى التركيز النهائي 5٪ باستخدام 1X TBS مع 0.05٪ تريتون X-100.
    5. جعل مربع الرطب عن طريق وضع 1-2 6 لوحات جيدة داخل صندوق الغذاء النقر قفل وملء الآبار في منتصف الطريق مع الماء عالى النقاء. إزالة الشرائح ممهى من جرة تلطيخ ووضعها أفقيا على 6 لوحات جيدا (بدون غطاء لوحة).
    6. بعناية إضافة 300-600 ميكرولتر من عرقلة العازلة داخل الحلبة PAP. اغلاق مربع الرطب عن طريق تأمين الغطاء في مكانه ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
    7. تمييع الأجسام المضادة الأولية المناسبة في عرقلة العازلة. عموما، تستخدم 100-150 ميكرولتر المخفف حل الأجسام المضادة لكل شريحة. إذا تتم معالجة عدة شرائح، رفع مستوى حجم متناسب.
    8. بعد حظر، وإزالة بعناية عازلة تمنع من الشرائح التي كتبها طموح وبسرعة إضافة صrimary حل الأجسام المضادة لمنع الجفاف التدريجي، ثم ختم مربع الرطب واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    9. في اليوم التالي، وإزالة حل الأجسام المضادة الأولية من الشرائح بواسطة الطموح. تغسل الشرائح عن طريق إدراج في الجرار تلطيخ مليئة 1X TBS مع 0.05٪ تريتون X-100، و 3 مرات، كل 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه، يخفف من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة مع عازلة تمنع (مع أو بدون دابي أو phalloidin).
    10. بعناية إضافة 100-150 ميكرولتر من حل الضد الثانوية على الشرائح. ضع الشرائح داخل منطقة الجزاء الرطب وختم غطاء. احتضان الشرائح لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    11. تغسل الشرائح في تلطيخ الجرار مليئة 1X TBS مع 0.05٪ تريتون X-100، و 3 مرات، كل 15 دقيقة. في غسل النهائي، ذوبان الجليد وسيلة لمكافحة تتلاشى تركيب في 50 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة في حال تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تهدئة المتوسطة المتزايدة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    12. إضافة حوالي 20 ميكرولتر (قطرة واحدة) من المتوسطة المتزايدة علىالشريحة وتطبيق زلة غطاء كبير (لا يقل عن 22 ملم × 64 ملم) على عينات. مراقبة باستخدام الفلورسنت أو المجهر متحد البؤر في غضون 6 ساعة بعد التركيب.
      1. إذا لا يمكن أن يتم التصوير في نفس اليوم، وختم الشرائح باستخدام طلاء الأظافر ووضعها داخل منطقة الجزاء الرطب في 4 درجات مئوية خلال الليل.
        ملاحظة: سيتم المتوسطة مكافحة تتلاشى تصاعد تدريجيا الحصول على أكسدة بعد بضعة أيام (ويتحول اللون البني) لذلك فمن المستحسن أن تأخذ الصور في أقرب وقت ممكن.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر نتائج ممثلة المقاطع العرضية من المرحلة 30 الأجنة القيطم على مختلف المستويات، وهي مقدمة الدماغ، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي، ملطخة الأجسام المضادة المختلفة (الشكل 4). كما ذكرنا، Sox3 المسمى يقع العصبية السكان خلية سلفية في المناطق القريبة من تجويف الأنبوب العصبي، في حين MyT1 المسمى الخلايا العصبية الأولية متباينة تهاجر إلى الخارج وتحديد موقع بالقرب من طبقة هامشية (الصفيحة القاعدية) في الأنبوب العصبي. مكافحة أسيتيل تويولين تسميات المحاور في الخلايا العصبية متباينة، والتي يمكن ملاحظتها داخل الأنبوب العصبي بأكمله.

الجانب محددة إسقاط الموروثة أو overexpression هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم ما إذا تحوير التعبير عن جين معين (ق) يعطل نمو وتمايز الخلايا العصبية. في مثل هذه الحالات، إما Morpholinos (موس) أو بناء الحمض النووي (ق) يحمل الموالية يتم حقن الجينات يحركها moter (ق) في واحدة من اثنين عن Blastomeres في مرحلة الخلية اثنين 23. بدلا من ذلك، فإنها يمكن حقنها في البطين الدماغ تليها Electroporation لل، الأمر الذي سيؤدي إلى ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن الجين المطلوب (ق) 27. في كلتا الحالتين، سوف تقتصر آثار على جانب واحد من الجنين، مما يجعل الجانب الآخر من الجنين كما الرقابة الداخلية غير المعالجة.

بعد التثبيت، باجتزاء، والمناعية، وكميا آثار ضربة قاضية الجينات / الإفراط في التعبير عن طريق العد ومقارنة أعداد الخلايا من مختلف قطاعات السكان في كلا الجانبين من الجنين. من خلال تجميع هذه البيانات من عدة أجنة، لا يمكن أن يؤديها التحليل الإحصائي. في نتائج تمثيلية لدينا، لم يحرز أي اضطراب في الأجنة. أمثلة من اضطراب الجينات وتأثيراتها على مختلف السكان الخلية العصبية ويمكن الاطلاع في المراجع 20،23.

ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> figure-results-1
الشكل 1: ترتيب الأجنة وتوجيهه في قسم العفن (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية متزايدة، لاحظ وقد وصفت علبة مع التاريخ، والمسرح، والتوجه للأجنة. (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي للجمعية المتزايدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توجه وموقف كتلة الجيلاتين على القرص عينة عقد (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية قسم كتلة، لاحظ أن الأجنة في موقف "يرأس" وكتلة الجيلاتين ورسخت سn لقرص عقد عينة من متوسطة تجميد الأنسجة في القاعدة (انظر الشكل 2B). (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي من كتلة التجمع القسم، لاحظ تراكم المتوسطة تجميد الأنسجة بين كتلة الجيلاتين والقرص عينة القابضة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 3: باجتزاء المستمر (A) نموذج لقسم الدائرة. يجب أن تكون استدارة القرص عقد العينة وثابتة على موقف الجانب الجنين يكون مواجها لها. بعد بضع (6-10) أقسام، يتم فصل شريط طويل من البلاط قسم المستمرة بلطف من شفرة (الأزرق) باستخدام فرشاة دقيقة، ثم تحول 90 درجة على لوحة القابضة. ثم اتهم غرفة درجة الحرارة بشكل إيجابي الشريحةضغطت بقوة على الباب شريط أسفل ورفعت فورا إلى شرائح النهائية التي تم جمعها. (ب) عادة، كل شريحة يمكن أن تستوعب 2 خطوط متوازية من الشرائط، كما هو مبين. تذكر لجعل سجل مفصل على التسمية الشريحة باستخدام قلم رصاص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: المقطع العرضي للمرحلة 30 اكس. المورق الضفادع الصغيرة وتلطيخ في الأنسجة العصبية، 20X. (A) الخطط التي تشير إلى مناصب النسبية (الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي) من قسم الطائرات على الضفادع الصغيرة القيطم. (ب) المقابلة المقاطع العرضية ملطخة مكافحة Sox3 (الأحمر)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (GREEn)، ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية للحمامات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك neurofilaments داخل الأنبوب العصبي. (C) الموافق المقاطع العرضية ملطخة مكافحة MyT1 (الأحمر) ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية من الخلايا العصبية الأولية المتباينة داخل الأنبوب العصبي. شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا لشرح طريقة مريحة وفعالة لتصور الخلايا العصبية الأولية في أجنة القيطم. يسمح هذا الأسلوب تقييم أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية متباينة باستخدام خلية علامات نوع محدد.

بروتوكول قوي عموما مع مستوى عال جدا من التكاثر. للأجنة التي هي في مراحل الفقس مسبقا (أي ما يصل لمرحلة 28)، ونحن نوصي إزالة الغشاء المحي قبل تثبيت يدويا كما يسمح هذا الأجنة إلى سدل بالكامل قبل التثبيت. هذا مهم بشكل خاص عند جمع الأجنة في مراحل مبكرة نسبيا (قبل الفقس)، منذ الأجنة عازمة صعبة للغاية لترتيب في الاتجاه المطلوب داخل غرفة في تصاعد مستمر. لم نشهد فقدان المناعة بعد MEMFA أو PFA تثبيت بالتالي إضافية خطوة استرجاع مستضد ليس من الضروري لهذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذايمكن أن يتم إجراء المناعية في عينات من مولد اللون / الفلورية في الموقع التهجين. في هذا السيناريو، فمن المستحسن لتخطي البروتيني K خطوة العلاج خلال الموقع في بروتوكول التهجين. بعد مولد اللون / الفلورسنت رد فعل الركيزة، والعينات ويمكن غسلها مع TBS وجزءا لا يتجزأ من حل الجيلاتين الأسماك بطريقة مشابهة لMEMFA / PFA عينات ثابتة. قارورة العينة يمكن أن تكون محمية من الضوء من خلال التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم إذا كان سيتم تصويرها الفلورية في الموقع التهجين مع تلوين مناعي في وقت لاحق.

في بعض الحالات، قد الأجنة يتقلص بشكل مفرط بعد اختراق الجيلاتين. وعلى الأرجح سبب ذلك إما غير كافية أو غير كافية تثبيت استخراج TBS-تريتون. ضمان أن الأجنة قد تم علاجها في PFA / MEMFA لمدة 2-3 على الأقل ساعة أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا استمرت المشكلة، وزيادة وقت غسل TBS-تريتون إلى 3 لمدة 1 ساعة.

أثناء البرد التقطيعةنينغ، جمود كتلة عينة قد تختلف دفعات مختلفة اعتبارا من الجيلاتين الأسماك لها خصائص مختلفة. هذه المشكلة يمكن تعويضه جزئيا عن طريق ضبط درجة حرارة مشراح. وهناك انخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى "صعوبة" كتلة عينة لكن تحت درجة حرارة منخفضة المفرطة يصبح كتلة العينة هش ويصعب القسم. بعض صقل أو ممارسة (باستخدام كتل عينة وهمية دون الأجنة) قبل كل باجتزاء قد يكون من المفيد قبل استخدامها على عينات قيمة خاصة.

وهناك مشكلة تصادفها أثناء باجتزاء هي الشرائح الرقيقة تميل أحيانا إلى عصا على لوحة زجاجية سميكة بدلا من البقاء شقة في مرحلة الصلب. هذا يمكن أن يكون لا سيما تعطيل لأنه يقطع باستمرار عملية باجتزاء مستمرة. وعادة ما تسبب هذه الحالات من جانب واحد من سببين: غرفة الباب و (خصوصا) لوحة زجاجية سميكة لا يجري الباردة بما فيه الكفاية، أو الإفراط في تهمة ثابتة على الجهاز وسperator، خصوصا في الطقس الجاف. الأول يمكن حلها من خلال رفض درجة حرارة الجزء الغرفة وترك لوحة من الزجاج داخل لوقت اضافي (ربما بين عشية وضحاها). وهذا الأخير من خلال زرع جذور ناظم البرد بشكل صحيح. يمكن ربط السطح المعدني للناظم البرد إلى الاستفادة من المعدن أو نظام أنابيب المياه مماثلة مصنوعة من المعدن يكون وسيلة بديلة للافراج عن رسوم ثابتة. بعد كل استخدام، يجب غسلها لوحة زجاجية سميكة بشكل جيد مع المنظفات غير قابلة للتآكل (مثل سوائل غسل الاطباق)، تشطف بماء عالى النقاء، رش مع الإيثانول النقي، وملفوفة في منشفة ورقية لحماية سطح وحواف من الاضرار.

الأجسام المضادة المدرجة في بروتوكول محددة عموما، ونحن نادرا ما تصادف الامتزاز غير محددة أو عالية إشارة الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالة استخدام الحرارة المعطل الماعز / لحم الضأن مصل كما منع وكيل، والإفراط في الحرارة تعطيل (كما تصور من قبل تشكيل مرسب رقيق في المصل) يجبينبغي تجنبها لأن هذا مرسب جذابة للغاية لالأجسام المضادة الثانوية ويمكن أن تسهم في مصدر خلفية عالية.

ومن الممكن، والمطلوب في بعض الأحيان، لأداء مزدوج تلطيخ لتصور مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في وقت واحد. هذا المزدوج تلطيخ هو ممكن، ويعطي نتائج مرضية مع المجموعات التالية بشكل عام: Sox3 / N-الحوض أو / N-حوض Myt1. ومع ذلك، معقد المزدوج تلطيخ Sox3 وMyt1 من حقيقة أن الأجسام المضادة هما كلا من أصل أرنب. اختبرناها عدة مجموعات العلامات المباشرة الأجسام المضادة، ولكن لم يلاحظ أي نتائج مرضية (مستوى منخفض إشارة إلى الضوضاء)، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود تضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية. كان أحد النهج الممكنة للتحايل على هذه المشكلة يكون لرفع خطوط المعدلة وراثيا في القيطم، كما هو مبين أدناه.

واحدة من القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه، في حين أن هذا البروتوكول يمكن فيه الكفاية ديstinguish حوضين رئيسيين من الخلايا العصبية، وهي تجمع الخلايا الجذعية العصبية، معربا عن Sox3 وMyt1، معربا عن الخلايا العصبية متباينة، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على الكشف عن مختلف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة. هؤلاء السكان من الباطن، والتي بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الخلايا العصبية الحركية الأساسية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية، وعادة ما تتميز الجينات علامة، وأعرب تفاضلي من 28-30. وكما ذكر أعلاه، التطورات الحديثة في تطوير متعدد الألوان في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع طريقة كشف المناعي القائم على الأجسام المضادة في الأجنة القيطم قد ملء الفجوة لكشف هؤلاء السكان من الباطن من الخلايا العصبية متباينة للتحقيق المحتملين 31. بدلا من ذلك، كما ثبت في نموذج الفئران، كما سيتم المطلوبة لرفع مجموعة أشمل من خلايا الأجسام المضادة من نوع معين لتمييز هؤلاء السكان خلية مختلفة في القيطم.

أنهكما تجدر الإشارة إلى أن، كإضافة إلى هذا الأسلوب، التطورات الحديثة في التصوير الضوئي وتحليل الصور، مثل المجهر multiphoton والتعمير 3D، وتجزئة، ويمكن أيضا أن تطبق بعد التقديرات الأولية لتحقيق الملاحظات أشمل من البويضات القيطم وكذلك الأجنة المبكرة، لا سيما في ظل يعيش وضع 32،33. لذلك، لتتبع انتشار، والتمايز، وحركة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية، فإن المستوى المطلوب لإنشاء واحد أو أكثر من خطوط المعدلة وراثيا التي تأوي البروتينات الفلورية يقودها نوع محدد خلية المروج للسماح للمراقبة حية لهؤلاء السكان الخلية في وقت مبكر القيطم الأجنة. إنشاء اكس. وقد وفرت خط المورق مع العصبية محدد β تويولين المروج القيادة tauGFP وتطبيقاته على سبيل المثال لطيفة 23،34. مع تسلسل المروج الكاملة للsox3 وmyt1 تتميز في الفقاريات 35-37، فمن شولد يكون من السهل نسبيا لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا إضافية في القيطم التي ينبغي أن تساهم على نطاق واسع في كل من المجتمع القيطم ومجال أكثر العام للبحوث الخلايا العصبية الابتدائية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر البروفيسور مايكل Klymkowsky في جامعة كولورادو في بولدر والبروفيسور نانسي Papalopulu في جامعة مانشستر لتوفير يرجى مكافحة Sox3 ومكافحة Myt1 الأجسام المضادة، على التوالي. نشكر أعضاء المختبر Papalopulu للحصول على اقتراحات الثاقبة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من شفاء دراسية مؤسسة لSZ وJL، منحتين المشروع من مؤسسة شفاء لSZ / EA وJL / EA على التوالي، منحة برنامج واحد من ويلكوم ترست لEA (WT082450MA)، واحد منحة الدعم المؤسسي الاستراتيجية من ويلكوم ترست [097820 / Z / 11 / Z].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جنتاميسين سيجما ألدريتشG1397
تريس-حمض الهيدروكلوريك  سيجما ألدريتشT3253
تريس قاعدةسيجما ألدريتشT1503
كلوريد الصوديوم   ؛سيجما ألدريتشS7653
KClسيجما ألدريتش746436
MgSO4سيجما ألدريتش746452
CaCl2 سيجماألدريتش793639
هيبسسيجما ألدريتشH3375
MOPSسيجما ألدريتشRDD003
EGTAسيجما ألدريتشE3889
37٪ فورمالديهايد  Sigma-AldrichF8775
الجيلاتين من جلد السمك في الماء الباردSigma-AldrichG7765
السكروزSigma-AldrichS7903
قالب قاعدة يمكن التخلص منه 15 مم × 15 مم × 5 مم SimportVWREMB-200-015A
قالب قاعدة يمكن التخلص منه 7 مم × 7 مم × 5 مم SimportVWREMB-200-010K
Superfrost PlusشرائحThermoFisher12-550-15
وسط تجميد الأنسجة (OCT)Leica 14020108926
CryostatLeica CM3050
قفازات
الثلج
Triton X-100   ؛سيجما ألدريتشX100
  ؛ 85-90 درجة ؛ C كتلة
قلم PAPSigma-AldrichZ377821
الأسيتون ، درجة
تحليلية جرة تلطيخ مع رفوف
صندوق طعام بحجم مناسب (لديه القدرة على استيعاب 1-2 6 آبار من الداخل)
التوبولين المضاد للأستيلاتSigma-AldrichT7451
مكافحة الماوس IgG (H+L), F(ab')2  جزء (Alexa Fluor®   488 مترافقة)إشارات الخلية4408
IgG المضادة للأرانب (H + L) ، F (ab') 2   ؛ جزء (Alexa Fluor®   555 مترافقة)إشارات الخلية4413
Alexa Fluor & reg ؛ 647إشارات خلية8940
إشارات خليةDAPI4083
تقنيات عمر التثبيت المضاد للتلاشي الذهبيP36930
الجافحراريةمنزلقة الفالودين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
  2. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
  3. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
  4. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
  5. Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
  6. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
  7. Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
  8. Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
  9. Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
  10. Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
  11. Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
  12. Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
  13. Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
  14. Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
  15. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
  16. Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
  17. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  18. Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
  19. Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
  20. Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
  21. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
  22. Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
  23. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469(2013).
  25. Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
  26. Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
  27. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107(2007).
  28. Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
  29. Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
  30. Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
  31. Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
  32. Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
  33. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  34. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
  35. Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
  36. Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
  37. Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sox 3 Tubulin MyT1 DAPI

مقالات ذات صلة