يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل

10.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53964

⸱

مارس 2, 2016

 ,  , 
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

نعرض إجراء التلقيح داخل القصبة الهوائية للمستدمية النزلية في الجهاز التنفسي السفلي للفئران. هذه أداة مفيدة للغاية لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم التهاب مجرى الهواء في نماذج الفئران.

الملخص

هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية لكفاءة وتسليم مباشرة المستدمية النزلية في المجاري التنفسية السفلى من الفئران. ونحن لشرح إجراءات إعداد ه. النزلية اللقاح، تقطير داخل القصبة الهوائية من H. النزلية في الرئة، وجمع السائل النزلة السنخ غسيل (BALF)، وتحليل الخلايا المناعية في BALF، وعزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني المغاير. هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة استجابة الرئة الالتهابية إلى أي بكتيريا، أو فيروس الفطريات. ويفضل القصبة الهوائية تقطير المباشر في الغالب على إجراءات الأنف أو استنشاق الهباء الجوي لأنها توفر أكثر كفاءة اللقاح البكتيري في الجهاز التنفسي السفلي مع أقل الغموض.

المقدمة

التهاب هو الآلية المناعية الأساسية للدفاع ضد العوامل المعدية. وهي تشجع القضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. كما أنها تسهل عملية الانتعاش إلى حالة صحية طبيعية 1. ومع ذلك، والتهاب dysregulated غالبا ما يؤدي إلى الأمراض الالتهابية المزمنة 2. التهاب الشعب الهوائية هو السبب المبدئي للأمراض الرئوية مختلفة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الربو وتليف رئوي 3.

ويرتبط عدم typeable (unencapsulated) المستدمية النزلية (NTHi) مع الأمراض الالتهابية العلوية والسفلية الرئة المزمنة 4،5. ومن الأنواع السائدة معزولة عن الشعب الهوائية أقل من الأطفال والبالغين الذين يعانون من الانسداد 4،6،7 أمراض الرئة المزمنة. وتتميز الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة NTHi قبل upregulation من السيتوكينات proinflammatory (مثل TNF و IL-1β)، وتوسط ذلك بذ mitogen البروتين كيناز تفعيلها (MAPK) والنووي عامل كيلوبايت (NF كيلوبايت) من خلال مستقبلات تول مثل (TLRs) 8.

نماذج الماوس أدوات مفيدة جدا لتحليل الأمراض الكامنة وراء مرض التهاب الرئة بسبب توافر خطوط الجينات ناقصة مختلفة. وقد استخدمت عدة طرق لتطعيم البكتيريا الحية / الموهن والمنتجات البكتيرية، بما في ذلك تقطير الأنف ورذاذ 9،10 الاستنشاق. هنا، علينا أن نظهر داخل القصبة الهوائية تقطير. على الرغم من أن أقل استخداما، وهذا النهج هو أكثر كفاءة وتكرار للغاية نظرا للتسليم المباشر من اللقاح في الجهاز التنفسي السفلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من معهد بحوث بايلور.

1. التثقيف غير typeable المستدمية النزلية (NTHi) وإعداد اللقاح

  1. لوحة NTHi على لوحة أجار الشوكولاته والحفاظ على لوحة رأسا على عقب في ترطيب CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. اليوم، ثقافة التالية البكتيريا في مرق الدماغ القلب ضخ. ثم، إضافة 1 مل من مرق في أنبوب 1.5 مل العقيمة.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  3. نقل 100 ميكرولتر من إعادة علقت الحل في 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X وقياس الامتصاصية للثقافة المخفف في 600 نانومتر الطول الموجي في معمل.
  4. تحديد وحدة سلامة وتشكيل مستعمرةالصورة (CFUs) من اللقاح عن طريق زراعة 01:10 التخفيفات المسلسل على لوحات الشوكولاته أجار وتفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. وبناء على جدوى وCFUs تحديد من الخطوة السابقة، وضبط اللقاح إلى تركيز النهائي من 20 × 10 6 خلية / مل.

2. الناشبة داخل القصبة الهوائية (عليه) تقطير

  1. حقن فأر داخل الصفاق (IP) مع 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم من الفأر مع 150 ملغ / مل الكيتامين + 20 ملغ / مل حل زيلازين. وينبغي أن يتم هذا الإجراء في غطاء محرك السيارة مع مصدر الضوء للحفاظ على الحارة الحيوان.
  2. قرصة الفضاء بين الأصابع من الفأرة للتحقق من أن الفأر هو تخدير كاف.
  3. ضع الماوس على ظهرها. حلاقة المنطقة البطنية من الرقبة وتعقيم مع الكلورهيكسيدين و 70٪ الكحول الإيثيلي.
  4. رفع الجلد من الجزء البطني العلوي من الرقبة باستخدام ملقط الأسنان الفئران. إجراء شق صغير (0،5-1،0 سم) فوق الغدة الصعترية باستخدام مشرطوتشريح بعناية العضلات لفضح القصبة الهوائية.
    1. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 27 G، وضخ ببطء 0.05 مل الهواء، تليها 0.05 مل NTHi تم الحصول عليها من القسم 1 أو المالحة كعنصر تحكم، تليها جوية أخرى 0.05 مل. إبقاء الحيوانات الرأسي لحوالي 1 دقيقة.
  5. إغلاق شق مع الغراء الجراحية. الحفاظ على الماوس راقد أفقيا ودافئة لمدة 10 دقيقة.

3. BALF مجموعة

  1. التضحية الماوس عن طريق عنق الرحم التفكك 24 ساعة بعد الإصابة.
  2. فتح تجويف البطن من الفأرة مع مقص التشريحية وقطع الشريان الأورطي البطني ينزف. كشف الجزء البطني من الرئة.
  3. فضح القصبة الهوائية وتدخله مع قسطرة قياس 20. غرس 0.8 مل من العازلة BALF (برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ سكر العنب، 10 U / مل الهيبارين) وجمع غسيل من قبل التطلع لطيف. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
  4. عد العدد الكلي للخلايا في 100 ميكرولتر من تعليق BALF باستخدام hemocytoمتر تحت التكبير 10X مع تلطيخ التريبان الأزرق.
  5. إعداد الشرائح لتعديل تلطيخ بالغيمزا. قسامة 100 ميكرولتر من BALF في الآبار الملائمة للcytospin وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح لمدة 10 دقيقة وصمة عار على الخلايا باستخدام تعديل بالغيمزا صمة عار وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
  6. استخدام الخلايا المتبقية لتحليلها لاحقا، مثل تنوير خلية تنشيط الفرز (FACS)، الفحص المجهري متحد البؤر، التعبير الجيني وصمة عار الغربية 11-13.

4. إعداد التشريح المرضي

  1. لتحليل أمراض الأنسجة، ويصيب الفئران مع NTHi كما هو موضح في الخطوة 2.4. بعد 24 ساعة من العدوى، والتضحية الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم. خفض فتح التجويف الصدري مع مقص التشريحية لفضح الرئتين والقصبة الهوائية كما ذكر من قبل. ثم، تضاف قسطرة قياس 20 إلى القصبة الهوائية.
  2. ملء الرئة مع 2٪ محلول الاغاروز دافئ أعد في 4٪ من الفورمالين. مرة واحدة فيوتضخم الرئتين تماما، مكان الثلج على قمة الرئتين لترسيخ الحل الاغاروز.
  3. ثم، وإزالة بعناية المكونات الصدري ووضعها في محلول 50 مل من 4٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني 1X حتى تتم معالجتها لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) أقسام.

5. FACS تلطيخ الخلايا في BALF

  1. وضع 1 × 10 5 خلايا من السائل BALF في 96-جيدا لوحة عيار الصغيرة-V السفلي.
  2. غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X وتدور في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. وصمة عار على الخلايا مع حل الخلية وصمة عار في 100 1X ميكرولتر PBS (1: 1000 تمييع) والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. إبقاء الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS غسل [غسل العازلة (برنامج تلفزيوني 1X، 2٪ FBS، 1 ملم EDTA، 0.1٪ أزيد الصوديوم] التي تحتوي على 1: 100 المخفف FC-بلوك لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. خلايا الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 3 دقائق وتجاهل سوبernatant.
  7. خلايا وصمة عار مع 100 ميكرولتر تلطيخ السطح كوكتيل (1: 100 تمييع) في غسل العازلة FACS لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. غسل خلايا ثلاث مرات مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. إصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. غسل الخلايا مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية واعادة تعليق في 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS.
  11. جعل الضوابط تلطيخ أحادية اللون باستخدام التدفق الخلوي الخرز.
    1. إضافة قطرة واحدة من الخرز في 96-جيدا لوحة ميكروليتر-V القاع، ويغسل مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة تلطيخ إلى 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X والخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. تغسل حبات مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
  12. تحليل الضوابط واحدة الملطخة والخلايا عن طريق التدفق الخلوي 14.

6. التجانس من أنسجة الرئة لعزل الحمض النووي الريبي

  1. بعد الإصابة، وجمع قطعة صغيرة من الرئة (20-40 ملغ) وابقائه في الحمض النووي الريبي استقرار الكاشف في 4 درجات مئوية خلال الليل. ثم، واحفظها في -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
  2. غسل الأنسجة الرئوية في البرد برنامج تلفزيوني 1X للتخلص من كاشف استقرار الحمض النووي الريبي.
  3. وضع الأنسجة في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تحلل العازلة (1 مل تحلل عازلة + 10 ميكرولتر β-المركابتويثانول).
  4. ختم الأنسجة الى قطع صغيرة باستخدام مقص وأشار والتجانس باستخدام اللاسلكية مدقة بيليه السيارات ل20-40 ثانية.
  5. إبقاء المحللة على الجليد لمدة 5 دقائق والمضي قدما في الخطوة 7.1.

7. عزل الحمض النووي الريبي من الرئة

  1. الطرد المركزي المحللة في 18000 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف قبل pipetting ونقل بعناية لأنبوب 1.5 مل جديد.
  2. إضافة إلى حجم 1 من 70٪ من الإيثانول لالمحللة. مزيج فورا من قبل pipetting والانتظار لمدة 2-4 دقيقة.
  3. نقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من المحللة لعمود الدوران وضعتفي أنبوب جمع 2 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية، وتجاهل التدفق من خلال.
  5. إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  6. إضافة 80 ميكرولتر الدناز أنا مباشرة لغشاء عمود الدوران والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة لعمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  8. إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  9. إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وتدور في 9600 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  10. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  11. إضافة 30-50 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر مباشرة إلى عمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
  12. لتحليل RNAseq 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أدى تقطير داخل القصبة الهوائية في العدد المتزايد بشكل ملحوظ من الكريات البيض في BALF (الشكل 1A، غادر لوحة) من تركيب بمحلول ملحي. أظهر تحليل العد التفريقي لكريات الدم البيضاء وبوضوح زيادة تسلل العدلات (الشكل 1، اللوحة اليمنى). تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا في BALF أكد كذلك زيادة عدد العدلات (الشكل 1B). التحليل النسيجي للأقسام H & E الملون في أنسجة الرئة أظهرت زيادة التهاب الشعب ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نحن تصف الإجراء الفريد والغازية الحد الأدنى لتطعيم الرئتين من الفئران مع العوامل المسببة للأمراض الرئة البكتيري. علينا أن نظهر أن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لدراسة وظيفة الجينات المختلفة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص في الجينات من مسارات الإشارات التهابات. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات الالتهابية للعدوى الرئة الفيروسية والفطرية. و(1) في هذا الإجراء، يتم غرس مزايا هذا الإجراء عبر وسائل أخرى مثل الأنف أو استنشاق الهباء الجوي اللقاح المسببة للأم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور كارسون هارود على القراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر السيد مينغوي تسنغ والدكتورين ماهيش كاثانيا وبراشانت كهاري على مساهماتهم. تم دعم هذا العمل من خلال منح من جمعية السرطان الأمريكية (منحة الباحث ، 122713-RSG-12-260-01-LIB) ومركز سامونز للسرطان (منحة المشروع التجريبي) إلى K. Venuprasad.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة أجار الشوكولاتهفيشر ScientificCAS50-99-7
سكر العنب اللامائيThemo ScientificR01300
HeparinHospira، IncRL-3010
الحل السريع الماهرSigmaGS500-500ML
إبرة حقنة 20/26G & nbsp ؛دينار بحريني(REF305115/175)
حقنة ImlBDREF 309602
قسطرة 20GABDREF
مقص تشريح ، مستقيم ، بطول 10 سمملقط كينت ساينتسايكلINS600393
القزحية ، مسنن ، بطول 10 سمملاقط INS650915
# 5 ستانلس ستيل ، بطول 11 سمkentscientificINS600095
10٪ فورمالينفيشر ScientificCAS 67-56-1
Agarosepeqlab35-1020
5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع BDREF 352058
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LightLabsA-7001-R
Reasy Mini   kit  Qiagen74104
بيليه المحرك الحشري (مجانس الأنسجة)SigmaZ359971-1EA
96 بئر لوحات microtiter V أسفلThermo2605
1X PBSGibco10010-023
OneComp eBeadseBioscience01-1111-42
CD45.2-APCeBioscience17-0454-81العمل 1:100
Ly-6G-eFlor 450eBioscience48-5931-82تخفيف العمل 1:100
BSAHyCloneSH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X)Biolegend420301
/ Dead قابلة للإصلاح طقم بقع الخلايا الميتة المائيةInvitrogenL-34957
EDTA (0.5M)lifetechnologies15575-020
CD16 / CD32 FcBlockBD553142
Facs أنابيب البوليسترين أنبوب القاع المستديرBD352052
الفورمالديهايدPolyscience4018
381433 kentscientific تخفيف Live

المراجع

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA
الإدارة داخل القصبة الهوائية لل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.