الهدف من هذا البروتوكول هو تزويد المستخدمين بمجموعة من الطرق لفك المركبات عالية الإنتاجية لأجنة Lymnaea stagnalis واليرقات استعدادا للتهجين الكامل في الموقع ، وللعلاجات اللاحقة قبل وبعد التهجين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) هي تقنية تسمح للقرار المكاني للجزيئات الحمض النووي (في كثير من الأحيان من mRNAs) ضمن إعداد الأنسجة "جبل بأكمله، أو مرحلة النمو (مثل الجنين أو يرقة) من الفائدة. WMISH هي قوية للغاية لأنها يمكن أن تساهم بشكل كبير في توصيف وظيفي من الجينوم metazoan معقدة، وهو التحدي الذي أصبح أكثر من عنق الزجاجة مع طوفان من البيانات تسلسل الجيل القادم. على الرغم من بساطة المفاهيمية للتقنية وغالبا ما يحتاج الكثير من الوقت لتحسين مختلف المعايير المتأصلة في تجارب WMISH لنظم نموذج الجديدة؛ يعني الفروق الدقيقة في خصائص الخلوية والكيمياء الحيوية بين أنواع الأنسجة والمراحل التطويرية التي أسلوب WMISH واحد قد لا يكون مناسبا لجميع الحالات. لقد قمنا بتطوير مجموعة من الأساليب WMISH لعاودت الظهور نموذج البطني المنقعية الراكدة التي تولد يتفق وإشارات WMISH واضحة لمجموعة من الجينات، وعبر جميع مراحل النمو. وتشمل هذه الأساليب احالة يرقات العمر الزمني غير معروف إلى نافذة التخلق، وإزالة فعالة للأجنة ويرقات من كبسولات البيض، وتطبيق العلاج بروتين-K المناسبة لكل نافذة التخلق، والتهجين، بعد التهجين ومناعي خطوات. وتوفر هذه الأساليب على الأساس الذي الإشارة الناتجة عن نسخة RNA معينة يمكن أن يكون مزيد من الصقل مع تعديلات محددة التحقيق (التحقيق في المقام الأول التركيز ودرجة الحرارة التهجين).
المقدمة
الرخويات هي مجموعة من الحيوانات التي تحمل الفائدة من تنوع واسع من التخصصات العلمية. وعلى الرغم من تنوع الصرفي من 1، ثراء الأنواع (في المرتبة الثانية بعد المفصليات من حيث عدد الأنواع 2) وصلة إلى مجموعة واسعة من التجارية 3، 4 الطبية والعلمية القضايا 5-8، هناك عدد قليل نسبيا من الأنواع الرخويات التي يمكن أن تدعي ل يكون كلا النموذجين علمية مجهزة تجهيزا جيدا وسهلة للحفاظ في بيئة معملية. واحد الرخويات التي تستخدم كثيرا من قبل التخصصات مثل علم الأعصاب 9، والسمية الإيكولوجية 10 وأكثر في الآونة الأخيرة البيولوجيا التطورية 11،12، هو المنقعية الراك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: الخطوات التالية توضح طريقة لدينا لإجراء التجربة في الموقعي على المراحل الجنينية واليرقات من L. الراكدة. أين ينطوي على خطوة استخدام المواد الكيميائية الخطرة ويدل على ذلك كلمة "تنبيه" وجميع إجراءات السلامة المناسبة التي ينبغي اعتمادها. وتقدم وصلات إلى أوراق MSDS التمثيلية للمواد الكيميائية الخطرة في الملف التكميلي 1. وتقدم وصفات لجميع الكواشف في الملف التكميلي 2.
الجمعية 1. من نزع المحفظة جهاز
- للقيام بذلك، قم بتوص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء أنماط تلطيخ WMISH ممثل هو مبين في الشكل (3) باستخدام تقنية الموضحة أعلاه، وتعكس مجموعة متنوعة من أنماط التعبير المكاني للجينات لها دور في مجموعة من العمليات الجزيئية بدءا من تشكيل قذيفة (الجينات رواية 1 و 2 و 3 و 4)، إلى إشارات الخلية خلية (النيابة العامة) لتنظيم النسخ (براتشيوري) عبر مجموعة من المراحل التنموية. في حين أننا لم كميا مستويات التعبير عن هذه الجينات نتوقع أن لو كانوا أيضا تت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموصوفة هنا يسمح التصور الفعال للنسخ الرنا مع فرضا متفاوتة مستويات التعبير في جميع مراحل تطور المنقعية الراكدة. لإزالة الأجنة واليرقات من كبسولات بهم ونحن محاكمتهم مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية، صدمة التناضحي والمعالجات الفيزيائية وذكرت لencapsulated- الآخر تطوير الكائنات النموذج. ومع ذلك، في أيدينا طريقة وصفنا هنا هو تقنية عالية الإنتاجية الوحيدة التي تزيل غشاء المحفظة صعبة دون الإضرار الأجنة واليرقات. وبعد نزع المحفظة، إما أن المواد يمكن تخزينها، أو تعامل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من خلال تمويل لDJJ من خلال مشروع DFG # JA2108 / 2-1.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط وزن الريشة | Ehlert & أمبير شريك | # 4181119 | |
| أنابيب السيليكون | Glasger & auml ؛ tebau OCHS GmbH | 760070 | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 طبقا لزراعة الأنسجة الآئية | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37٪ الفورمالديهايد | Carl Roth | P733.1 | تحذير - قد يسبب السرطان. سام عن طريق الاستنشاق ، عند ملامسته للجلد وفي حالة ابتلاعه. سامة: خطر حدوث آثار خطيرة للغاية لا رجعة فيها من خلال الاستنشاق والتلامس مع الجلد وفي حالة ابتلاعها. |
| حمض الإيثيلين ديامين الرباعي الأسيتيك | كارل روث | CN06.3 | الحذر - يسبب تهيج العين. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي والجلد. تجنب استنشاق الغبار. تجنب ملامسة العينين والجلد والملابس. استخدم فقط مع التهوية الكافية |
| كلوريد المغنيسيوم | كارل روث | 2189.1 | |
| توين -20 | كارل روث | 9127.1 | تحذير - قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. قد يكون ضارا إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد. قد يسبب تهيج الجلد. قد يسبب تهيج العين. قد يكون ضارا إذا ابتلع. |
| كلوريد الصوديوم | كارل روث | 3957.1 | |
| فيكول نوع 400 | كارل روث | CN90.1 | |
| بولي فينيل بيروليدون K30 (ميغاواط 40)كارل | روث | 4607.1 | تحذير - قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. قد يكون ضارا إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد. قد يسبب تهيج الجلد. قد يسبب تهيج العين. قد يكون ضارا إذا ابتلع. |
| نوكليز خالي من الألبومين في مصل الأبقار | كارل روث | 8895.1 | |
| السلمون المنوية | كارل روث | 5434.2 | |
| الهيبارين | كارل روث | 7692.1 | تحذير - تشمل الآثار الضارة النزيف والتهيج الموضعي. رد فعل تحسسي محتمل إذا تم استنشاقه أو تناوله / ملامسه. مهيج للعيون / الجلد / الجهاز التنفسي. فرط الحساسية المحتمل. أثناء الحمل تم الإبلاغ عن زيادة خطر ولادة جنين ميت |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| فورماميد منزوع الأيونات | Carl Roth | P040.1 | تحذير - تهيج العينين والجلد. قد يكون ضارا بالاستنشاق أو ملامسة الجلد وفي حالة ابتلاعه. قد يسبب ضررا للجنين. استرطابي. |
| فورموميد قياسي | كارل روث | 6749.3 | تحذير - مهيج للعينين والجلد. قد يكون ضارا بالاستنشاق أو ملامسة الجلد وفي حالة ابتلاعه. قد يسبب ضررا للجنين. استرطابي. |
| ثلاثي إيثانول أمين | كارل روث | 6300.1 | تنبيه - تجنب استنشاق البخار أو الضباب. تجنب ملامسة العينين. تجنب ملامسة الجلد لفترات طويلة أو متكررة. يغسل جيدا بعد المناولة. |
| أنهيدريد الخليك | كارل روث | 4483.1 | تحذير - يسبب حروقا شديدة في الجلد والعين. يتفاعل بعنف مع الماء. ضار إذا ابتلع. بخار مزعج للعيون والجهاز التنفسي |
| حمض الماليك | كارل روث | K304.2 | تحذير - خطير جدا في حالة ملامسة العين (مهيج) ، الابتلاع ، . خطير في حالة ملامسة الجلد (مهيج) ، الاستنشاق (مهيج للرئة). خطير قليلا في حالة ملامسة الجلد (المخترق). تآكل للعينين والجلد. |
| بنزوات البنزيل | سيجما | B6630-250ML | تحذير - قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. قد يكون ضارا إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد. قد يسبب تهيج الجلد. قد يسبب تهيج العين. ضار إذا ابتلع. |
| كحول البنزيل | سيجما | 10،800-6 | تحذير - ضار إذا ابتلع. ضار إذا تم استنشاقه. يسبب تهيجا خطيرا للعين. |
| الجلسرين | كارل روث | 3783.1 | |
| مسحوق الحجب | Roche | 11096176001 | |
| شظايا Anti DIG Fab AP المترافقة | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro Blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - قد يتسبب في ضرر للطفل الذي لم يولد بعد. ضار عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. مزعج للعينين. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | تحذير - يحتمل أن يكون ضارا إذا تم تناوله. لا تلامس على الجلد أو العينين أو الملابس. الجلد المحتمل ومهيج العين. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - قد يسبب تهيج العين والجلد. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي. لم يتم التحقيق بشكل كامل في الخصائص السمية لهذه المواد. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | تحذير - قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. قد يكون ضارا إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد. قد يسبب تهيج الجلد. قد يسبب تهيج العين. قد يكون ضارا إذا ابتلع. |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | كارل روث | CN30.3 | تحذير - ضار إذا ابتلع. سام عند ملامسته للجلد. يسبب تهيج الجلد. يسبب تلفا خطيرا في العين. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. |
| كلوريد البوتاسيوم | كارل روث | 6781.1 | |
| ثنائي الصوديوم ثنائي فوسفات الهيدروجين ثنائي الهيدرات (Na2HPO4&# 8226; 2H2O) | كارل روث | 4984.1 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4) Carl | Roth | 3904.1 | |
| ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات (C6H5Na3O7• 2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | تحذير - قد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. لم يتم التحقيق بشكل كامل في الخصائص السمية لهذه المواد. |
| الزيوت المعدنية | كارل روث | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | إنتافيس | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
المراجع
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the Uni....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
