يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

11.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53985

⸱

يوليو 3, 2016

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Arizona, Tucson

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول جاهز لمشاركة طريقتنا في عزل الخلايا البطانية التاجية للفأر لغرض التصوير أو لإجراء تجارب بيولوجية جزيئية.

الملخص

الخلايا البطانية خط الجدار الداخلي للأوعية الدموية، وتلعب دورا هاما في تنظيم لهجة الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. تورط خلل الخلايا البطانية في تطور وتقدم العديد من أمراض القلب والشرايين بما في ذلك مرض نقص تروية القلب. لدراسة وظيفة وتوصيف الخلايا البطانية التاجية، والعزلة الخلية هي الخطوة الأولى ويتطلب عالية النقاء وكمية لإجراء تجارب لاحقة. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لعزل الماوس الكبار الخلايا البطانية التاجية. يتم تشريح قلب فأر والمفروم إلى قطع صغيرة. بعد هضم القلب باستخدام dispase وكولاجيناز الثاني، يتم غسلها الخلايا وحضنت مع حبات مغناطيسية والتي مترافق مع الأجسام المضادة لمكافحة CD31. حبات مع الخلايا البطانية يتم غسلها عدة مرات ونحن على استعداد لاستخدامها في مختلف التطبيقات، بما في ذلك التصوير وexperime البيولوجي الجزيئياليلة. العزلة الفعالة ينتج ما يقرب من 10 4 خلايا في قلب واحد مع أكثر من 90٪ النقاء.

المقدمة

نماذج الماوس من مختلف الأمراض القلبية الوعائية واضطرابات التمثيل الغذائي تحمل التغيرات الفسيولوجية والجزيئية التي هي مماثلة لتلك التي وجدت في المرضى. وعلاوة على ذلك، والتعديلات الجينية من الفئران هو أداة قوية تسمح لنا للتحقيق في دور الممرضة من جينات معينة في تطور وتقدم في جميع الأمراض. في الوقت الحاضر، خلية من نوع معين الجينات تدق في أو تتولد الفئران-خارجا بسهولة في العديد من المختبرات وقياس مرنا ومستويات البروتين في أنواع معينة من الخلايا هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كانت الفئران كانت حقا المعدلة وراثيا.

البطانة هي طبقة واحدة رقيقة من الخلايا البطانية (ECS) أن خطوط جدار الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا البطانية تلعب دورا حاسما في تنظيم توتر الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة 1،2. الخلايا البطانية هو السمة المميزة للعديد من الحالات المرضية والتغيرات في وظيفة بطانة الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى السيارة المختلفةالأمراض diovascular 3،4. ومن ثم كبيرا لدراسة وظيفة الخلايا البطانية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.

هناك عدة طرق لعزل ECS 5-8 وأسلوب العزل يجب أن يكون الأمثل اعتمادا على الأنسجة والأنواع سوف تستخدم. وذلك لأن ECS من الأنسجة المختلفة عرض على مستوى عال من عدم التجانس فيما يتعلق علامات سطحها والتعبير البروتين 9. العزلة الناجحة من الخلايا البطانية وغالبا ما تكون صعبة وتتطلب قدرا من التدريب والممارسة. وبمجرد تحقيقه، وطريقة العزل المقترحة في هذا البروتوكول يبرهن على أن تكون مستقرة وفعالة.

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على الماوس التاجي ECS (MCECs) ذات جودة عالية وكمية. على الرغم من أن كمية الخلايا التي تم جمعها من قلب أقل من الخلايا التي تم جمعها من الأنسجة الأخرى باستخدام تقنيات أخرى، فإن هذا الأسلوب لا يزال يوفر الرهانجودة ثالثا. نقاء من الخلايا البطانية في عدد السكان الناتج أكبر من 90٪. وبالتالي، فإن هذه التقنية سيكون مثاليا للتطبيقات التي تعتمد على الخلايا البطانية معزولة بحتة مثل التصوير الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة على الأبحاث على الفئران عن طريق لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة أريزونا وأجريت وفقا للمعهد الوطني للصحة (NIH) المبادئ التوجيهية.

ملاحظة: أقسام 1، ينبغي أن يتم 2 و 3 من هذا اليوم قبل التجربة كما الإعداد.

1. حلول إعداد

  1. عازلة CD31 (50 مل)
    1. إضافة 50 مل 1 × الفوسفات مخزن المالحة (PBS) إلى أنبوب 50 مل. تزن 0.05 غرام الأبقار مصل الزلال (BSA) و0.037 غرام ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) وإضافة إلى أنبوب 50 مل ووضع أنبوب لتدوير لمدة 1 ساعة حتى يذوب المسحوق. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، تصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب 50 مل الجديد، وتخزينها في 4 مئوية حتى الاستخدام.
  2. هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) مع HEPES (500 مل)
    1. إضافة 1.1915 غرام من HEPES لجعل 10 ملي HEPES في حل HBSS وتخلط جيدا. قياس درجة الحموضة والتكيف مع 7.4. تصفية وتخزينها في 4ج.
  3. حل 1X كريب (1 لتر)
    1. إضافة 100 مل من محلول 10 × كريب [الجدول 1] لمضاعفة الماء المقطر في قارورة 1 لتر. تزن 2.1 غرام بيكربونات الصوديوم و 2 ز D-الجلوكوز وإضافة إلى القارورة. خلط وضبط الحجم الإجمالي إلى 1 L.
    2. الحل فقاعة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 الغاز لمدة 30 دقيقة ومرشح حل داخل غطاء محرك السيارة. تخزين في 4 ج والحفاظ على الجليد أثناء التجربة.

2. إعداد الخرز المغناطيسي

  1. إضافة 1 مل العازلة CD31 في كل أنبوب 1.5 مل (أنبوب واحد لكل عينة). مزيج من الأغنام لمكافحة الفئران الخرز مفتش وإضافة كمية مناسبة لكل عينة [الجدول 1]. تهز أنابيب بقوة 30 مرات ووضعها في لوحة المغناطيسي لمدة 1 دقيقة من اهتزاز. فتح أنابيب بينما كان في لوحة وتفريغ الحلول في دلو.
  2. إضافة 1 مل العازلة CD31 في كل أنبوب. إضافة 2 ميكرولتر الفئران لمكافحة فأر CD31 المضادةالجسم إلى كل أنبوب وتدوير أنابيب O / N عند 4 درجات مئوية.

3. التعقيم

  1. الأوتوكلاف جميع أدوات الجراحة ونصائح ماصة. قطع نهايات نصائح ماصة بحيث هناك نصائح مع 4 بأقطار مختلفة، من أوسع إلى أضيق. بأقطار التقريبية للالنصائح 3 ملم، 2.5 ملم، 2 ملم، و 1.5 ملم على التوالي. قطع النصائح وتعقيم قبل يوم واحد مع 30 دقيقة من التعقيم عند درجة حرارة 121 درجة مئوية.
    ملاحظة: 4 أقسام - 11 ينبغي الاضطلاع بها في يوم من التجربة.

4. حلول إعداد

  1. إعداد غسل العازلة التي تحتوي على 2٪ الحديد المحصنة العجل المصل (المحفل) في M199. للتصوير، وإعداد 30 مل / الماوس.
  2. يعد حل انزيم (10 مل / العينة). تزن 0.6 وحدة / مل من Dispase و 1 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني في أنبوب 50 مل. إضافة M199 وتدوير الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تصفية من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر في أنبوب 50 مل الجديد insidالبريد غطاء محرك السيارة والحفاظ على 4 مئوية حتى الاستخدام.
  3. إعداد HBSS / HEPES مع الهيبارين. إضافة 10 مل من HBSS مع 10 ملي HEPES في 15 مل أنبوب. إضافة 100 ميكرولتر من الهيبارين إلى الأنبوب والحفاظ على 4 مئوية حتى الاستخدام.

5. غسل الخرز

  1. اخراج الأنابيب مع حبات من محور دوار عند 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى غطاء محرك السيارة. وضع أنابيب في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تفريغ حل وإضافة عازلة CD31 1 مل في كل أنبوب.
  2. اتخاذ أنابيب للخروج من لوحة مغناطيسية ويهز بقوة 30 مرة. وضع الأنابيب مرة أخرى في لوحة مغناطيسية وتكرار لما مجموعه 3 يغسل. بعد الانتهاء، ووضع الأنابيب إلى 4C والحفاظ على الدورية حتى الاستخدام.

6. تشريح

  1. حقن الفئران داخل الصفاق مع 0.1 مل من الهيبارين لمنع تخثر الدم. انتظر لمدة 10 دقيقة، ثم تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من 0.01 مل بنتوباربيتال. تحقق مما إذا كان الماوس هو شعور الألم عن طريق معسر القدم.
  2. ضع الماوس على لوحة البوليسترين مع رئيس المتابعة وعقد تسلح مع الدبابيس. استخدام ملقط وصعبة قطع مقص لقطع الجلد في منطقة الصدر العلوية يصل إلى الحلق.
  3. اجراء خفض في وسط القفص الصدري فقط فوق الحجاب الحاجز. قطع العظام جانبية وصعودا نحو الحلق لجعل مثلث تعريض القلب والرئتين. قطع الشريان الأبهر فوق الحجاب الحاجز.
  4. عقد الغدة الصعترية مع ملقط دون سحب واستخدام المقص لقطع أي نوع من الأنسجة الضامة بعناية لإزالة الرئتين والقلب معا. مكان الأنسجة في كوب مع 1 × وكريب، يهز مع ملقط ونقل إلى 6 سم الطبق مع 1 × كريب.
  5. إزالة فصوص الرئة باستخدام مقص وملقط. ادخال قسطرة معقمة 20 G في الشريان الأورطي. تدفق الدم في الدورة الدموية التاجية مع HBSS / الهيبارين. جعل قطع صغير في البطين، يهز القلب ونقل إلى أنبوب عينة من M199. إبقاء الأنابيب على الجليد.

الطبقة = "jove_title"> 7. الأنسجة الهضم

  1. نقل قلب لطبق 6 سم مليئة 10 مل من محلول أنزيم واللحم المفروم إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. ضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تستنهض الهمم المواد هضمها من قبل pipetting صعودا وهبوطا 30 مرة خلال قمة مع نهاية قطع للسماح الأنسجة بالمرور أسهل.
  2. وضعه مرة أخرى في درجة مئوية حاضنة 37 لمدة 15 دقيقة أخرى. كرر التحريض ثلاث مرات، في كل مرة باستخدام ماصة نصائح من أكبر الفتحات إلى أضيق و 15 حضانة دقيقة بين كل منها.
  3. بعد 15 دقيقة الماضية الحضانة، وأخذ عينات من وإلى غطاء محرك السيارة. حل الماصة صعودا وهبوطا 30 مرات باستخدام الماصة غيض مع أضيق افتتاح ويمر عبر مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل الجديد.
  4. غسل الطبق مع غسل العازلة 10 مل باستخدام ماصة 10 مل ونقل على مصفاة الخلية. وضع 50 مل أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 400 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
itle "> 8. الغسل والإقتران مع الخرز

  1. إزالة طاف دون الإخلال بيليه. غسل الخلايا مع غسل العازلة 5 مل مرتين.
  2. الحصول على واحد من قبل إعداد 1.5 مل أنابيب مع الخرز والعمل على أنبوب واحد في وقت واحد. وضع واحد أنبوب 1.5 مل في لوحة المغناطيسية، يهز 3 مرات وفتحه.
  3. بعد الطرد المركزي الماضي، وإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن دون الإخلال بيليه. تنأى كتل الخلايا التي يسددها بقوة.
  4. إضافة غسل العازلة 1 مل إلى 50 مل أنبوب ومزيج الخلايا مع ماصة 1 مل. تفريغ الحل من أنبوب 1.5 مل وإضافة 1 مل من تعليق خلية من الأنبوب 50 مل إلى الخرز. نفض الغبار الأنابيب 30 مرات ثم تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

9. إعداد للثقافة خلية / التصوير

  1. إعداد غرف لخلايا الطلاء. إضافة محلول الجيلاتين (5٪ ث / ت، 300 ميكرولتر) إلى غرفة البئر إلى معطف السطح واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وعينيالجيلاتين اوفه وجافة السطح.
  2. اخراج الأنابيب مع الخرز / الخلايا بعد 30 دقيقة من دوران وضعت في لوحة المغناطيسية داخل غطاء محرك السيارة. يهز لمدة 2 دقيقة، تفريغ وإضافة غسل العازلة 1 مل.
  3. تتخذ أنابيب من لوحة، ويهز بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. وضعها من جديد في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تكرار 4 مرات ليصبح المجموع 5 يغسل، ولكن مع 1 دقيقة تهتز على لوحة.
  4. بعد غسل الماضي، واخراج أنبوب واحد والعمل على كل أنبوب واحد في وقت واحد. يهز 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. وضعه على لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تفريغ وإضافة 1 مل 20٪ المحفل EC وسائل الإعلام (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية).
  5. هزة بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. ضبط الماصة 500 ميكرولتر والماصة صعودا وهبوطا 10 مرات. نقل 500 ميكرولتر لكل غرفة.
  6. وضع في 37 درجة مئوية الحاضنة وترك O / N. وفي اليوم التالي، وغسل الخلايا مع 10٪ سائل الإعلام FBS EC.

10. إعداد لغرب وصمة عار (WB) عينات

  1. تاكالبريد من الأنابيب مع الخرز / الخلايا بعد 1 ساعة من التناوب. وضعها في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 2 دقيقة. تفريغ طاف وإضافة 1 مل الباردة HBSS. هزة بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. كرر مرتين لمدة 3 يغسل، ولكن مع 1 دقيقة تهتز على لوحة.
  2. بعد غسل الماضي، ووضع أنابيب على لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. إزالة العازلة باستخدام ماصة وليز الخلايا لمدة WB باستخدام الطريقة الموصوفة سابقا 11،12. عادة ما تحتوي على المحللة جمعوا حوالي 30 ميكروغرام من البروتين.

11. التصوير

  1. غسل الخلايا 3 مرات مع وسائل الإعلام، مع الحجم النهائي من 250 ميكرولتر للغرفة. إضافة 1.5 ميكرولتر من دل-acLDL إلى الخلايا. من هذه النقطة، والحفاظ على الخلايا في الظلام.
  2. احتضان لمدة 3.5 ساعة عند 37 مئوية. إضافة 1.5 ميكرولتر من هويشت، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 خلايا ˚C.Wash مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4٪ لامتصاص العرق (PFA) لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 5٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 30 ميلن في RT. يغسل مرتين مع 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني. تمييع BS-كتين-FITC باستخدام 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني إلى تركيز من 2 ميكروغرام / مل وإضافة 300 ميكرولتر لكل غرفة.
  4. وضعت غرفة على شاكر المداري في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات.
  5. تصور الخلايا تحت المجهر الفلورسنت مع مرور الوقت تعرض 200 ميللي ثانية لFITC (تلطيخ كتين، علامة EC، الإثارة / انبعاث 488 نانومتر / 519 نانومتر)، 30 ميللي ثانية للدابي (هويشت، والتلوين، والإثارة / الانبعاث النووي في 358 نانومتر / 461 نانومتر)، و 300 ميللي ثانية لTRITC (acLDL تلطيخ، علامة EC، الإثارة / الانبعاثات في 557 نانومتر / 576 نانومتر). الحصول على صور باستخدام 20X عدسة الهدف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العزلة الناجحة من الخلايا البطانية التاجية من قلب فأر عادة ينتج حوالي 10 4 الخلايا مع أكثر من 90٪ النقاء مع شكل حصاة كبيرة. بالنسبة لعدد السكان نقية من خلايا بطانة الأوعية الدموية، وينبغي اتخاذ الحذر في جميع أنحاء بروتوكول لضمان بيئة معقمة خالية من أي تلوث. ظهور الخلايا ممدود أو خلايا الموسع بين السكان يشير تلوث مع أنواع أخرى من الخلايا، وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. يتم تنفيذ البطانية اختبار خلية نقاء من تلطيخ الخلايا مع علام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخلايا البطانية الأكثر استخداما على نطاق واسع في مجال البحوث والوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) بسبب الراحة وسهولة زراعة. ومع ذلك، هناك الكثير من الأبحاث يتطلب توافر نموذج الفسيولوجية التي حققتها عزل الخلايا البطانية من أجهزة محددة أخرى 10. الخلايا البطانية تشكل السكان طفيفة جدا من الخلايا في أنسجة القلب. عزلتهم وزراعة يمكن أن يكون صعبا للغاية.

هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (HL115578 لألف ماكينو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BSASigmaA3311-10G
EDTAFisherBP120-500
HBSSFisherSH3026801
HepesSigma-AldrichH4034-500G
بيكربونات الصوديوم   ؛سيجماS5761
D- (+) -جلوكوز  SigmaG7021-1KG
DynaBeads عموم ماوس IgG الخرز Thermo Fisher Scientific11035
الأجسام المضادة للفئران CD31Biosciences550274
IFCS  فيشرSH30072.04
M199فيشرMT10060-CV
Dispase (بروتياز محايد)Worthington Biochemical Corp. / FisherLS02109
Collagenase Type II  شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية / فيشرLS004176
الجلسرين  فيشرBP381-1
IgepalSigmaI3021-50 مل
كوكتيل مثبط الفوسفاتيزSigmaP0044-1ml
كوكتيل مثبط البروتيازSigmaP8340-1 مل
الهيبارين & nbsp ؛سيجماH3149-100KU
FBS فيشر / ميدياتكMT35010CV
D-ValineSigmaV1255-5G
EGSكورنينج356006
البنسلين / الستربتومايسينفيشر / MediatechMT-30-002-CI
BD

المراجع

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Anti CD31
عزل خلايا الفأر التاجي غشائي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.