يؤدي التليف المستمر مع ترسب بروتينات المصفوفة خارج الخلية المفرطة إلى تليف الكبد. يعد تعاطي الكحول أحد الأسباب الرئيسية لأمراض الكبد الحادة. أنشأنا نموذجا للكبد الليفي الناجم عن الإيثانول لدراسة آليات واستراتيجيات تعزيز تجديد خلايا الكبد عند الإصابة الناجمة عن الكحول.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يؤدي تليف الكبد المستمر مع استمرار تراكم بروتين المصفوفة خارج الخلية (ECM) إلى فقدان الكفاءة الخلوية للكبد ، مما يؤدي إلى تليف الكبد مع خلل في الخلايا الكبدية. من بين الإهانات الكبدية المتعددة ، يمكن أن يؤدي تعاطي الكحول إلى مشاكل صحية كبيرة بما في ذلك فشل الكبد وسرطان الخلايا الكبدية. ومع ذلك ، لم يتم التحقيق بشكل صحيح في هوية المصادر الخلوية الذاتية التي تجدد خلايا الكبد استجابة للكحول. علاوة على ذلك ، قامت دراسات قليلة بنمذجة تجديد خلايا الكبد بشكل فعال على أساس الإصابة الناجمة عن الكحول. لقد أبلغنا مؤخرا عن إنشاء نموذج كبد ليفي ناتج عن الإيثانول (EtOH) في أسماك الزرد حيث أدت الخلايا السلفية الكبدية (HPCs) إلى ظهور خلايا الكبد عند فقدان خلايا الكبد شبه الكاملة في وجود محفزات ليفية. علاوة على ذلك ، من خلال الشاشات الكيميائية باستخدام هذا النموذج ، حددنا العديد من الجزيئات الصغيرة التي تعزز تجديد خلايا الكبد. نصف هنا بالتفصيل إجراءات تطوير نموذج الكبد الليفي الناجم عن EtOH وإجراء الشاشات الكيميائية باستخدام هذا النموذج في أسماك الزرد. سيكون هذا البروتوكول أداة حاسمة لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية لكيفية تجديد خلايا الكبد في الكبد الليفي. علاوة على ذلك ، ستسهل هذه الأساليب الاكتشاف المحتمل لاستراتيجيات علاجية جديدة لأمراض الكبد المزمنة في الجسم الحي.
المقدمة
وعلى الرغم من قدرة تجديد رائعة من خلايا الكبد 1، والتي هي كبرى نوع من الخلايا متني من الكبد، فشل الكبد المزمن يضعف هذه القدرة، مما يؤدي إلى خلية سلفية الكبدية (HPC) تجديد معتمد على 2.
ويستمد تلف الكبد المزمن بشكل رئيسي من تعاطي الكحول، التهاب الكبد الوبائي المزمن فيروس (HCV) إصابة 3 و غير الكحولية مرض الكبد الدهني (NAFLD) 4. أنه يؤدي إلى تليف الكبد المستمر، الذي يرتبط مع تراكم البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). استمرار تراكم ECM يشوه بنية الكبد سليمة من خلال تشكيل ندبة الأنسجة الليفية 5، مما أدى لاحقا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأثيرت الزرد ولدت باستخدام بروتوكول قياسي يحقق المعايير من المعاهد الوطنية للصحة والتي وافق عليها معهد جورجيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
1. إعداد حلول
- إعداد 20 لتر ماء بيضة (تستخدم بالتبادل مع "المتوسطة الجنين ') للحفاظ على الجنين الزرد / اليرقات. حل 1.5 غرام كبريتات 4 و 6 ز المحيط حظة ملح البحر في 250 مل من الماء المقطر. تصب في الدامجانة زجاجة مليئة 20 L الماء المقطر وتستنهض الهمم.
- إعداد 1 L (PTU) محل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل (1) وتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد اليرقات. لتحسين بروتوكول لتعريض اليرقات الزرد إلى ETOH، علينا أولا تقييم ETOH سمية. في مرحلة ما بعد الإخصاب أيام تعرضت 2.5 (DPF) يرقات إلى تركيز ETOH 1٪، 1.5٪، أو 2٪ لمدة 24 ساعة تليها 24 ساعة ETOH العلاج / MTZ المتزامنة. التعرض إلى 2٪ ETOH نفوق عالية، في حين أن كل ما يقرب من اليرقات يتعرض إلى 1٪ أو أقل ETOH أظهر التغييرات التليف الحد الأدنى مع ترسب نادر من البروتينا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لاحظنا بوساطة HPC الكبدية تجديد في كبد ETOH / MTZ المعاملة يتعافى، مما يشير إلى أنه حتى في وجود كمية كبيرة من البروتينات ECM بما في ذلك نوع ييفي أنا الكولاجين، وHPCS تحتفظ كفاءتهم لتجديد خلايا الكبد كما. وقال إن MTZ فقط المعالجة لا تزيد ترسب البروتينات ECM بشكل ملحوظ، في حين أن ETOH الوحيدة المعالجة لم تتسبب في تنشيط HPC 15. من خلال الاستفادة من العلاج ETOH / MTZ جنبا إلى جنب، وكنا قادرين على تحقيق تجديد يحركها HPC في الكبد متليفة. كما القضاء شبه التام على خلايا الكبد ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من GTEC (2731336 و 1411318)، والمعاهد الوطنية للصحة (K01DK081351)، وجبهة الخلاص الوطني (1354837) لكلية العلوم الصحية نشكر عالم جيورجيس للقراءة نقدية للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيميهيدرات كبريتات الكالسيوم (CaSO4< / sub>) Acros | AC385355000 | ||
| كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>) | EMD | MX0075 | |
| 1،4-Piperazinediethanesfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)- N,N,N′,N′,N′ < / م > - حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) | سيجما ألدريتش | E3889 | |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | E7023 | 200 دليل |
| على الفورمالديهايد | فيشر Scientific | F79-500 | |
| ميترونيدازول (MTZ) | سيجما ألدريتش | M3761 | |
| 1-فينيل -2-ثيوريا (PTU) | سيجما ألدريتش | P7629 | |
| 3-أمينو حمض البنزويك إيثيل إستر (التريكايين) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قرص | Amresco | E404 | قم بإذابة قرص واحد مع 100 مل ماء مقطر |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| ألبومين مصل الأبقار | فيشر Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| ذوبان منخفض agarose | Amresco | BP165 | |
| مكتبة مركب إشارات الخلايا الجذعية | Selleck Chemicals | L2100 | 10 & nbsp; مخزون mM في مكتبة DMSO |
| ActiProbe-1K | Timtec | ActiProbe-1K | 10 مخزون mM في DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | يذوب مع DMSO إلى 10 ؛ mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | تذوب مع DMSO إلى 10 ؛ mM |
| المضاد للكولاجين I الجسم المضاد | Abcam | ab23730 | يستخدم في الساعة 1:100 للتلوين المناعي ، يتفاعل مع الأسماك |
| AlexaFluor 647 الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) | المجسات الجزيئية | A31573 | استخدم في الساعة 1:200 للتلطيخ |
| المناعي وسائط التركيب (Vectorshield) | مختبرات ناقلات | H-1400 | |
| 100 مم طبق بتري | VWR | 25384-088 | |
| 24 بئر لوحة | VWR | 10062-896 | |
| ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11255-20 | Dumont # 55 |
| شريحة زجاجية | VWR | 48312-003 | 75x25 مم |
| غطاء زجاجي | VWR | 48366-045 | 18 مم |
| غلاف بلاستيكي | فيشر ساينتفيك | 22305654 | |
| رقائق الألومنيوم | فيشر Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| مجهر ستيريو | Leica | M80 | |
| مجهر Epifluoresence | Leica | M205 FA | |
| مجهر Confocol | Zeiss | LSM700 |
المراجع
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
