Method Article

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث تقنيات المقاصة البصرية ثورة في طريقة تصور الأنسجة. في هذا التقرير ، نصف تعديلات على بروتوكول الأنسجة الأصلي المتوافق مع التصوير الصلب (CLARITY) المتوافق مع التصوير الصلب المتبادل بالدهون الشفافة والذي ينتج عنه نتائج أكثر اتساقا وأقل تكلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقليديا ، يتطلب تصور الأنسجة أن يتم تقسيم الأنسجة المعنية وتصويرها بشكل متسلسل ، مما يعرض كل قسم من أقسام الأنسجة لتشوهات غير خطية فريدة ، مما يعيق بشكل كبير قدرة الفرد على تقييم التشكل الخلوي والتوزيع والاتصال في الجهاز العصبي المركزي (CNS). ومع ذلك ، فإن تقنيات المقاصة البصرية تغير طريقة تصور الأنسجة. تسمح هذه الأساليب للمرء بالتحقيق بعمق في مستحضرات الأعضاء السليمة ، مما يوفر نظرة ثاقبة هائلة للتنظيم الهيكلي للأنسجة في الصحة والمرض. تحقق تقنيات مثل الأنسجة المتوافقة مع التصوير الصلب المتبادلة بالدهون الشفافة (CLARITY) هذا الهدف من خلال توفير مصفوفة تربط الجزيئات الحيوية المهمة مع السماح للدهون المشتتة بالضوء بالانتشار بحرية. إزالة الدهون ، متبوعا بمطابقة معامل الانكسار ، تجعل الأنسجة شفافة ويتم تصويرها بسهولة في 3 أبعاد (3D). ومع ذلك ، فإن إزالة الأنسجة الكهربية (ETC) المستخدمة في بروتوكول CLARITY الأصلي يمكن أن يكون من الصعب تنفيذها بنجاح ، كما أن استخدام حل مطابقة مؤشر الانكسار الخاص يجعل استخدام هذه التقنية بشكل روتيني مكلفا. يوضح هذا التقرير تنفيذ بروتوكول مقاصة بصري بسيط وغير مكلف يجمع بين الوضوح السلبي لتحسين سلامة الأنسجة و 2،2′-thiodiethanol (TDE) ، وهو حل مطابقة معامل الانكسار الموصوف سابقا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد القدرة على تصوير الهياكل التشريحية العصبية الكاملة ذات قيمة كبيرة لفهم الدماغ في الصحة والمرض. تقليديا ، يتطلب التصوير ثلاثي الأبعاد تقطيع الأنسجة لتوفير الدقة المحورية وتصور الهياكل التشريحية العميقة. يمكن أن ينتج هذا النهج مجموعات بيانات عالية الدقة ، ولكنه يتطلب تقنيات متطورة لإعادة بناء الصور ويتطلب عمالة مكثفة للغاية. نتيجة لذلك ، اقتصر على تصوير كميات صغيرة من الأنسجة1-3. من ناحية أخرى ، فإن التقسيم البصري مناسب تماما لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للأنسجة المصنفة بالفلورسنت. نظرا لأن التقسيم البصري ثلاثي الأبعاد بطبيعته ، فإنه لا يتطلب حسابا مكثفا لإنتاج حجم صورة ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن تشتت الضوء وعتامة الأنسجة تحد من العمق الذي يمكن أن يتم فيه تقسيم الأنسجة بصريا. يقتصر عمق التصوير على حوالي 150 ميكرومتر في الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر وأقل من 800 ميكرومتر باستخدام الفحص المجهري للإثارة ثنائية الفوتون4-8.

من أجل التغلب على هذه القيود ، تم تطوير العديد من تقنيات المقاصة البصرية مؤخرا ثم تم تحسينها بشكل أكبر للسماح بالتصوير المجهري العميق للأنسجة السليمة. كان استخدام كحول البنزيل وبنزوات البنزيل (BABB) لجعل الأنسجة الثابتة شفافة من بين أقدم الأساليب9. ومع ذلك ، كان هذا النهج محدودا بسبب تبريد التألق في العينات والتطهير غير المكتمل للهياكل شديدة النخاع10. أدت تحسينات هذه التقنية ، مثل التصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء المطهرة بالمذيبات (3DISCO) ، إلى تطهير الأنسجة بسرعة وكاملة للغاية ، ولكنها لا تزال تعاني من فقدان سريع لإشارات الفلورسنت ، وخاصة بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) 10. تحافظ حلول المقاصة القائمة على الماء ، مثل Sca / e11 و SeeDB12 ، على إشارات الفلورسنت ، ولكنها لا تزيل تماما الأنسجة عالية النخاع. كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق والتحليل الحسابي (CUBIC) هي تقنية مقاصة بصرية جديدة واعدة يبدو أنها تتغلب على قيود حلول المقاصة القائمة على الماء المطورةمسبقا 13. على النقيض من تقنيات المقاصة البصرية الأخرى ، فإن الأنسجة المتوافقة مع التصوير الصلب المتوافق مع التصوير الصلب (CLARITY) المتبادلة بالدهون الشفافة 14 تدمج الدماغ في مصفوفة مسامية توفر السلامة الهيكلية للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة ، مع ترك الدهون غير مرتبطة. ثم تتم إزالة الدهون كهربائيا ، وتبلغ ذروتها في دماغ تم تطهيره بصريا يمكن تصوره بسهولة وفحصه بسهولة باستخدام التقنيات المتاحة بشكل شائع.

يتم استخدام إزالة الأنسجة الكهربية (ETC) لإزالة الدهون من الأنسجة المضمنة في الهيدروجيل في CLARITY ، ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ ETC باستمرار ويمكن أن تظهر الأنسجة المعرضة للرحلان الكهربائي تشوها في الأنسجة ، وتحميرها ، وفقدان التألق وتفاعل الأجسام المضادة. تتجنب إزالة الدهون السلبية هذه القيود ، ولكنها تتطلب زيادة أوقات المقاصةمن 15 إلى 17. يسمح التخليص السلبي أيضا بإزالة أعداد كبيرة من العينات بالتوازي ، لأنه لا يقتصر على عدد أجهزة ETC المتاحة. أدى تقليل تركيز بارافورمالدهيد واستبعاد ثنائي أكريلاميد من الهيدروجيل إلى زيادات كبيرة في سرعة التطهير على حساب توسيع أكبر للأنسجة16. تم تطوير بدائل أقل تكلفة لمحلول مطابقة معامل الانكسار المستخدم في تقنية CLARITY الأصلية17-19. 2،2'-ثيوديثانول (TDE) هو عامل تطهير الدماغ غير المكلف والسريع الذي يعكس بعض تمدد الأنسجة الذي يحدث أثناء إزالة الدهون18. يتضمن هذا التقرير التنظيف السلبي للأنسجة المدمجة في الهيدروجيل واستخدام TDE كحل مطابق لمعامل الانكسار لتقنية CLARITY الأصلية لإنتاج بروتوكول قابل للتكرار وغير مكلف للغاية للتصفية البصرية للجهاز العصبي المركزي للفأر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام (IACUC). استخدمت THY1-YFP، حزب العمال التقدمي-EGFP وPV-TdTomato الفئران لهذه التجارب، ولكن أي الفئران معربا عن البروتينات الفلورية يمكن مسح بنجاح وتصويرها.

1. نسيج التحضير

تحذير: لامتصاص العرق (PFA) ومادة الأكريلاميد هي مواد سامة والمهيجات. إجراء تجارب استخدام هذه الكواشف في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).

  1. التضحية الحيوانية في غرفة القتل الرحيم مع ~ 1 مل من الأيزوفلورين حتى يتوقف التنفس (~ 2-3 دقيقة).
  2. استخدام مضخة تحوي مجموعة إلى ~ 5 مل / دقيقة ليروي intracardially الماوس مع نضح حل (الجدول 1) في 4 درجات مئوية حتى يتم مسح الدم من الأنسجة (5-10 دقيقة).
  3. تغيير الإرواء إلى حل تثبيتي (الجدول 1)في 4 درجات مئوية حتى العنق والذيل وتشديد كبير (5-10 دقيقة).
  4. إنهاء نضح وقطع رأس الحيوان. تشريح بعناية الدماغ من الجمجمة عن طريق إزالة أول الأنسجة الضامة المحيطة الجمجمة ومن ثم إزالة العظام من السطح البطني من الجمجمة ورفع الدماغ من (الشكل 1A)، كما هو موضح في 20.
    ملاحظة: إعطاء عناية خاصة لإزالة العظام المحيطة بها فصوص الندفي العقيدي من المخيخ وبصيلات الشم.
    1. تشريح الحبل الشوكي من العمود الفقري عن طريق إدراج بلطف غيض من، مقص حاد رفيع بين النخاع الشوكي والعمود الفقري وقطع شرائح الفردية العمود الفقري بعيدا، كما هو موضح في 21.
  5. Hemisect الدماغ عن طريق وضعها في بلاستيكية مصفوفة دماغ الفأر وقطع على طول خط الوسط بشفرة المصفوفة.
  6. إضافة كل نصف الكرة والحبل الشوكي لفصل 50 مل حوض أجهزة الطرد المركزيوفاق مع ~ 40 مل من محلول هيدروجيل (الجدول 1). من هذه النقطة الغطاء الأمامي الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores خلال جميع الخطوات اللاحقة.
  7. احتضان الأنبوب الذي يحتوي على العينة في هيدروجيل في 4 درجات مئوية مع طيف والهز (~ 30 دورة في الدقيقة) لمدة 7 أيام.

2. البلمرة

  1. تجاهل ~ 25 مل من هيدروجيل، والحفاظ على عينة و~ 25 مل من هيدروجيل في أنبوب الطرد المركزي.
  2. ينزع الأكسجين العينة عن طريق إزالة الغطاء ووضع أنبوب الطرد المركزي في جرة المجفف وتوصيل جرة إلى فراغ. تطبيق فراغ لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح الغازات الذائبة للخروج من الحل وشكل فقاعات. يهز بلطف لطرد الفقاعات.
  3. استبدال فراغ في جرة مجفف مع غاز النيتروجين بنسبة 100٪ خلال 2-3 دقائق. مرة واحدة equalizes الضغط (مرة واحدة الجزء العلوي من جرة مجفف يمكن فتح)، بسرعة غطاء الأنبوب لمنع إعادة الأوكسجين.
  4. البوليمرإيزي هيدروجيل عن طريق وضع أنبوب مع عينة في 37 ° C حمام الماء لمدة 3 ساعات حتى البلمرة كاملة. سوف هيدروجيل بلمرة تأخذ على مثل هلام الاتساق (الشكل 1B). ملاحظة: هناك كمية صغيرة من هيدروجيل unpolymerized في الجزء العلوي هو مقبول.
  5. استخدام ملعقة لإزالة عينة بلمرة من أنبوب الطرد المركزي، ثم قطع هيدروجيل الزائدة من العينة.
  6. إزالة هيدروجيل المتبقية عن طريق وضع عينة على الوبر مسح مجانا وفرك بلطف والمتداول الأنسجة عليه، تاركا وراءه سوى طبقة رقيقة من هيدروجيل بلمرة على العينة.

3. إزالة الدهون

ملاحظة: الأنسجة مسح الدهن هشة، التعامل معها بحذر. استخدام مصفاة الخلية عندما استنزاف أنبوب لتجنب فقدان العينة. أيضا، فإن عينة تضخم في جميع مراحل عملية المقاصة، ومع ذلك، يمكن عكسها خلال عملية مؤشر مطابقة الانكسار تورم.

تحذير: سودىأم كبريتات دوديسيل (SDS) وحمض البوريك هي المهيجات. إجراء تجارب الاستفادة منها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات وحماية العين).

  1. نقل عينة بلمرة لأنبوب الطرد المركزي 50 مل نظيف وإضافة 45 مل من تطهير عازلة (الجدول 1). احتضان عند 45 درجة مئوية مع الهز لطيف (~ 30 دورة في الدقيقة). تغيير المخزن المؤقت يوميا لمدة 7 أيام الأولية التي تتدفق خارج المنطقة العازلة المقاصة المستخدمة في النفايات الكيميائية وإضافة ~ 45 مل من العازلة المقاصة الطازجة. الحفاظ على أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات من تغطيتها في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores.
  2. بعد 7 أيام الأولى، واحتضان العينة في C وتبادل المقاصة عازلة 40 درجة كل 2-3 أيام. تواصل المقاصة حتى كل الدهون هي بالفاعلات والأنسجة يصل الشفافية (الشكل 1C). وستكون هذه 4-6 أسابيع لنصف الكرة دماغ الفأر و2-4 أسابيع لالحبل الشوكي.
  3. مرة واحدة يتم مسح الأنسجة، ونقلالعينة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة وتغسل 4 مرات في PBST (الجدول 1) عند 40 درجة مئوية مع طيف والهز (~ 30 دورة في الدقيقة) على مدى 24 ساعة لإزالة بقايا SDS.

4. الجزيئية تلطيخ

تحذير: 4، 6 Diamidino-2-Phenylindole هيدروكلوريد (دابي) هو مصدر إزعاج وأي تجارب الاستفادة من ذلك يجب أن يؤديها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).

  1. نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل نظيفة وملء مع 1 ميكروغرام / مل دابي في 1X PBST، ودرجة الحموضة 7.5. يحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة. الحفاظ على أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات من تغطيتها في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores.
  2. تغسل 3 مرات في PBST على RT لمدة لا تقل عن 6 ساعة / غسل.

مطابقة 5. مؤشر الانكسار

تحذير: 2،2'-Thiodiethanol (تد) هو مصدر إزعاج وأي تجارب الاستفادة من ذلك شولد أن يؤديها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).

  1. نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل نظيفة وملء مع 30٪ (ت / ت) تد في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.5. احتضان عند 40 درجة مئوية مع الهز لطيف (~ 30 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة.
  2. صرف 30٪ تد مع 63٪ (V / V) تد في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.5. احتضان عند 40 درجة مئوية مع طيف تهتز لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: سوف العينة يتقلص إلى الحجم الأصلي تقريبا.
  3. على سطح مستو ونظيف لفة قطعة من مادة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام في اسطوانة مع قطر موحدة فقط أكبر قليلا من سمك العينة.
  4. وضع اسطوانة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام في دائرة مفتوحة (~ قطرها 25 مم الداخلي مع فتحة صغيرة في الأعلى) على 40 ملم الزجاج طبق أسفل. إذا تحتاج إلى إجراء التصويبات، وإزالة اسطوانة من الزجاج وقطع بشفرة حلاقة.
  5. استخدام تلميح P1000 ماصة لإنشاء ختم بين لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام والزجاج من قبلالمتداول حول الحافة الخارجية من الاسطوانة.
  6. مكان ~ 100 ميكرولتر 63٪ تد على طبق زجاج وتنتشر في جميع أنحاء لتغطية سطح الزجاج ضمن دائرة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام.
  7. باستخدام ملعقة، وضع بعناية العينة في منتصف الدائرة، مع الحرص على عدم تشكيل فقاعات.
  8. ماصة 100 ميكرولتر أخرى من 63٪ تد مباشرة على العينة، ثم وضع على الفور 40 ملم دائري غطاء زجاجي على لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام.
  9. استخدام الفهرس، والمتوسطة، والبنصر من كلتا اليدين، اضغط بعناية حول محيط الدائرة إلى أن يصدر الغطاء الزجاجي اتصال مع العينة.
  10. جلب ببطء الطبق أسفل الزجاج لوضع رأسي يستريح على سطح، ثم إضافة 63٪ تد مع ماصة حتى يصل إلى حل فتحة صغيرة في الأعلى. استخدام الوبر مسح مجانا لتجف قبالة الطرف ماصة بحيث الحل لا بالتنقيط على الزجاج. لتجنب الفقاعات في الغرفة، أبدا إفراغ ماصة على طول الطريق.
  11. إلىفتحة صغيرة، إضافة المطاط الصناعي السيليكون لإحاطة الدائرة وإنشاء غرفة مغلقة. انتظر 5 دقائق حتى يجف قبل التصوير.

6. المجهري

تحذير: إن أشعة الليزر المستخدمة في متحد البؤر، والإضاءة طائرة واحدة وضوء المجهر ورقة هي قوية جدا ويمكن أن يسبب العمى. يجب أن يتم تنفيذ أي تجارب باستخدام أشعة الليزر بعد تدريب مكثف وبحذر شديد وحماية العين المناسبة.

  1. وضع غرفة التصوير مع عينة داخل على مرحلة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
  2. فتح برامج التصوير (انظر الجدول المواد). لتشغيل الليزر الأرجون الإثارة، انقر فوق علامة التبويب التكوين في الجزء العلوي من البرنامج ثم رمز الليزر. ضع علامة في المربع بجانب الأرجون لتشغيل الليزر ونقل على نطاق والشرائح إلى 30٪. مراقبة مؤشر الحارة ببطء إلى الموضع المحدد.
    1. عودة إلى علامة التبويب اكتساب في الأعلى. في المربع الكبير "إعدادات مسار الشعاع و# 34؛ الذهاب إلى تحميل / حفظ مربع تحديد واختيار القائمة المنسدلة لتحديد قناة الطول الموجي المناسبة لصورة YFP (527 نانومتر).
  3. تحديد الأهداف المناسبة للتصوير من خلال تحديد موقع الارتباط التشعبي الأحمر المسمى "الهدف: الكائن الحالي" ضمن المربع إعدادات القناة. النقر على علامة التبويب يفتح جميع الأهداف المتاحة، وسوف مجموعة مختارة تلقائيا تدوير البرج.
    1. أهداف الاستخدام (على سبيل المثال، 10X) مع مسافة عمل كبير (أكبر من سمك الأنسجة ليمكن تصوير، على سبيل المثال، 11 مم)، والفتحة العددية الكبيرة (على سبيل المثال، 0.3) لتعظيم دقة وضوح الصورة في الطائرة وتقليل بصري سمك الباب.
  4. في العمود الأيسر من القوائم المنسدلة، وفتح "XY: قرار" نافذة لوضع مصفوفة الاستحواذ، ودعا "تنسيق"، إلى 1024 X 1024 أو القيمة المناسبة للحد قرار الجانبي للهدف. تعيين عامل التكبير عند أدنى مستوى ممكن (على سبيل المثال، 10.7).
  5. في نفس الإطار، تعيين 8 المتوسط ​​خط و1 إطار متوسط ​​المعلمات من خلال إسقاط أسفل القوائم وصفت بشكل فردي وفقا لذلك. استخدام قيم كبيرة لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء وقيم صغيرة لاقتناء السريع.
    ملاحظة: 8 المتوسطات خط و1 متوسط ​​إطار الحصول على صور عالية الجودة من نصف الكرة مخ الفأر في ما يقرب من 4 ساعات.
  6. تحديد العينة باستخدام عناصر التحكم المرحلة. مرة واحدة في المجال التمثيلي مرئيا، تعيين الربح وتعويض.
    ملاحظة: الربح وتعويض سوف تختلف إلى حد كبير بناء على نوع الأنسجة، fluorophores، و / أو ميزة التشريحية التي يجري تصويرها. لYFP، تعيين قيم 760-780 لتحقيق مكاسب ومن -1.0 إلى -1.5 للتعويض.
  7. اختر "مسح البلاط" وتحديد حدود المنطقة من اهتمام. تعيين الحدود العليا والدنيا للض المكدس التي سيتم اكتسابها. تعيين سماكة المقطع البصرية على أساس الحد القسم قرار بصري الهدف ل.
    ملاحظة: إن الهدف منوتعرف بصري الحد القسم قرار المقام الأول عن طريق الفتحة التي العددية. معظم برامج التحكم المجهر سيحسب تلقائيا مناسبا قيمة للهدف المستخدمة. من أجل هدف 10X مع الفتحة العددية 0.3 من شأنه أن يكون حوالي 11 ميكرون.
  8. بدء عملية الاستحواذ.
    ملاحظة: هذا قد يستغرق ساعات عدة.
  9. جمع الصور عالية الدقة باستخدام الأهداف التكبير أعلى من مناطق معينة من الفائدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور التنظيم الهيكلي للدماغ أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية التشكل والاتصال تؤثر على وظيفة الدماغ في الصحة والمرض. تقنيات المقاصة البصرية تجعل من الممكن لسكان الخلية الصورة في 3D في الأنسجة سليمة، مما يسمح لنا لدراسة مورفولوجية والربط متماسك.

الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية يقودها المروجين محددة لسكان شبه الخلايا تسمح واحد لندف بصرف النظر عن ن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقاصة سلبية من هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة (وضوح السلبي) هي طريقة بسيطة وغير مكلفة لإزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة. لا يتطلب هذا النهج معدات مخصصة، ويمكن بسهولة أن يؤديها في شاكر التحكم في درجة حرارته. على مدى غضون بضعة أسابيع، حتى الكبيرة، والأنسجة العصبي للغاية، مثل المخ بأكمله أو الحبل الشوكي، وسوف تصبح شفافة ومناسبة للفحص المجهري. على الرغم من أن هذا التقرير قد ركز على تطهير أنسجة الجهاز العصبي المركزي، ويمكن تطبيقها وضوح السلبي إلى أي نوع من الأنسجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل بسخاء من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) منحة 1R01NS086981 ومؤسسة كونراد هيلتون. نشكر الدكتور لوران Bentolila والدكتور ماثيو Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع المجهر متحد البؤر. نشكر تلك التي ساهمت في المنتدى ضوح (http://forum.claritytechniques.org). نخص بالشكر الدكتور كارل Deisseroth لفتح مختبره لتعليم هذه التقنية الرائعة. الكتاب ممتنون للدعم السخي من منظمة الدماغ رسم الخرائط الأبحاث الطبية، ومؤسسة الدماغ رسم الخرائط دعم، بيرسون-افليس مؤسسة، مؤسسة Ahmanson، مجموعة شركات رأس المال للأعمال الخيرية، ويليام م وليندا صندوق الخيرية Dietel R.، وصندوق نورث ستار . تم البحث عنها في هذا المنشور أيضا بدعم جزئي من قبل المركز الوطني للبحوث الموارد ومكتب المدير الأمةآل معاهد الصحة تحت أرقام جائزة C06RR012169، C06RR015431، وS10OD011939. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)مخازنفيشرBP399-1
32٪ بارافورمالدهيد (PFA)علومالمجهر الإلكتروني15714-5التروية والهيدروجيل
2،2'-ثيوديثانول (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gمحلول مطابقة معامل الانكسار
40٪ أكريلاميدBio-Rad161-0140هيدروجيل
2٪ مكرر أكريلاميدBio-Rad161-0142هيدروجيل
VA-044 بادئواكو بيور للصناعات الكيماوية المحدودة.VA044هيدروجيل
حمض البوريكSigma-AldrichB7901مقاصة عازلة مقاصة
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)فيشرBP166-5مقاصة عازلة
هيدروكسيد الصوديومفيشر55255-1مخازن
مؤقتة أزيد الصوديومسيجما-ألدريتش52002-100Gمادة حافظة
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100-500Gالمخازن المؤقتة
هيبارينسيجما ألدريتشH3393-50KUنتروية
نترات الصوديومفيشرBP360-500التروية
المجسات الجزيئيةDAPID1306وصمة عار نووية
99.9٪ إيزوفلورانفينيكس57319-559-06مخدر
حمض الهيدروكولوريكفيشرA1445-500المخازن المؤقتة
طبق زجاجيسفلي WillcoHBSB-5040أطباق Willco
لاصقة قابلة لإعادة الاستخدامBostick371351Blu-Tack
مطاط مطاط صناعي من السيليكونWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast Kwik-Cast
Kimberly-Clark34120KimWipe
Mouse مصفوفة الدماغRobozSA-2175قسم الأنسجة
شفرات المصفوفةRobozRS-9887الأنسجة
المضخة التمعجيةCole-Parmer77122-24pefusion
مجهر متحد البؤر المسح بالليزرLeicaSP5المجهر
برنامج التصويرLeicaLAS AFالمجهر المجهري
Leica SP5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
  3. MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
  4. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  5. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
  7. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  8. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
  9. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  12. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  15. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
  16. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  17. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  18. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808(2015).
  19. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  20. Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848(2012).
  21. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580(2015).
  22. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
  23. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles