Method Article

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث تقنيات المقاصة البصرية ثورة في طريقة تصور الأنسجة. في هذا التقرير ، نصف تعديلات على بروتوكول الأنسجة الأصلي المتوافق مع التصوير الصلب (CLARITY) المتوافق مع التصوير الصلب المتبادل بالدهون الشفافة والذي ينتج عنه نتائج أكثر اتساقا وأقل تكلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقليديا ، يتطلب تصور الأنسجة أن يتم تقسيم الأنسجة المعنية وتصويرها بشكل متسلسل ، مما يعرض كل قسم من أقسام الأنسجة لتشوهات غير خطية فريدة ، مما يعيق بشكل كبير قدرة الفرد على تقييم التشكل الخلوي والتوزيع والاتصال في الجهاز العصبي المركزي (CNS). ومع ذلك ، فإن تقنيات المقاصة البصرية تغير طريقة تصور الأنسجة. تسمح هذه الأساليب للمرء بالتحقيق بعمق في مستحضرات الأعضاء السليمة ، مما يوفر نظرة ثاقبة هائلة للتنظيم الهيكلي للأنسجة في الصحة والمرض. تحقق تقنيات مثل الأنسجة المتوافقة مع التصوير الصلب المتبادلة بالدهون الشفافة (CLARITY) هذا الهدف من خلال توفير مصفوفة تربط الجزيئات الحيوية المهمة مع السماح للدهون المشتتة بالضوء بالانتشار بحرية. إزالة الدهون ، متبوعا بمطابقة معامل الانكسار ، تجعل الأنسجة شفافة ويتم تصويرها بسهولة في 3 أبعاد (3D). ومع ذلك ، فإن إزالة الأنسجة الكهربية (ETC) المستخدمة في بروتوكول CLARITY الأصلي يمكن أن يكون من الصعب تنفيذها بنجاح ، كما أن استخدام حل مطابقة مؤشر الانكسار الخاص يجعل استخدام هذه التقنية بشكل روتيني مكلفا. يوضح هذا التقرير تنفيذ بروتوكول مقاصة بصري بسيط وغير مكلف يجمع بين الوضوح السلبي لتحسين سلامة الأنسجة و 2،2′-thiodiethanol (TDE) ، وهو حل مطابقة معامل الانكسار الموصوف سابقا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد القدرة على تصوير الهياكل التشريحية العصبية الكاملة ذات قيمة كبيرة لفهم الدماغ في الصحة والمرض. تقليديا ، يتطلب التصوير ثلاثي الأبعاد تقطيع الأنسجة لتوفير الدقة المحورية وتصور الهياكل التشريحية العميقة. يمكن أن ينتج هذا النهج مجموعات بيانات عالية الدقة ، ولكنه يتطلب تقنيات متطورة لإعادة بناء الصور ويتطلب عمالة مكثفة للغاية. نتيجة لذلك ، اقتصر على تصوير كميات صغيرة من الأنسجة1-3. من ناحية أخرى ، فإن التقسيم البصري مناسب تماما لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للأنسجة المصنفة بالفلورسنت. نظرا لأن التقسيم البصري ثلاثي الأبعاد بطبيعته ، فإنه لا يتطلب حسابا مكثفا لإنتاج حجم صورة ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن تشتت الضوء وعتامة الأنسجة تحد من العمق الذي ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام (IACUC). استخدمت THY1-YFP، حزب العمال التقدمي-EGFP وPV-TdTomato الفئران لهذه التجارب، ولكن أي الفئران معربا عن البروتينات الفلورية يمكن مسح بنجاح وتصويرها.

1. نسيج التحضير

تحذير: لامتصاص العرق (PFA) ومادة الأكريلاميد هي مواد سامة والمهيجات. إجراء تجارب استخدام هذه الكواشف في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).

    <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور التنظيم الهيكلي للدماغ أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية التشكل والاتصال تؤثر على وظيفة الدماغ في الصحة والمرض. تقنيات المقاصة البصرية تجعل من الممكن لسكان الخلية الصورة في 3D في الأنسجة سليمة، مما يسمح لنا لدراسة مورفولوجية والربط متماسك.

الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية يقودها المروجين محددة لسكان شبه الخلايا تسمح واحد لندف بصرف النظر عن ن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقاصة سلبية من هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة (وضوح السلبي) هي طريقة بسيطة وغير مكلفة لإزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة. لا يتطلب هذا النهج معدات مخصصة، ويمكن بسهولة أن يؤديها في شاكر التحكم في درجة حرارته. على مدى غضون بضعة أسابيع، حتى الكبيرة، والأنسجة العصبي للغاية، مثل المخ بأكمله أو الحبل الشوكي، وسوف تصبح شفافة ومناسبة للفحص المجهري. على الرغم من أن هذا التقرير قد ركز على تطهير أنسجة الجهاز العصبي المركزي، ويمكن تطبيقها وضوح السلبي إلى أي نوع من الأنسجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل بسخاء من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) منحة 1R01NS086981 ومؤسسة كونراد هيلتون. نشكر الدكتور لوران Bentolila والدكتور ماثيو Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع المجهر متحد البؤر. نشكر تلك التي ساهمت في المنتدى ضوح (http://forum.claritytechniques.org). نخص بالشكر الدكتور كارل Deisseroth لفتح مختبره لتعليم هذه التقنية الرائعة. الكتاب ممتنون للدعم السخي من منظمة الدماغ رسم الخرائط الأبحاث الطبية، ومؤسسة الدماغ رسم الخرائط دعم، بيرسون-افليس مؤسسة، مؤسسة Ahmanson، مجموعة شركات رأس المال للأعمال الخيرية، ويليام م وليندا صندوق الخيرية Dietel R.، وصندوق نورث ستار....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)مخازنفيشرBP399-1
32٪ بارافورمالدهيد (PFA)علومالمجهر الإلكتروني15714-5التروية والهيدروجيل
2،2'-ثيوديثانول (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gمحلول مطابقة معامل الانكسار
40٪ أكريلاميدBio-Rad161-0140هيدروجيل
2٪ مكرر أكريلاميدBio-Rad161-0142هيدروجيل
VA-044 بادئواكو بيور للصناعات الكيماوية المحدودة.VA044هيدروجيل
حمض البوريكSigma-AldrichB7901مقاصة عازلة مقاصة
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)فيشرBP166-5مقاصة عازلة
هيدروكسيد الصوديومفيشر55255-1مخازن
مؤقتة أزيد الصوديومسيجما-ألدريتش52002-100Gمادة حافظة
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100-500Gالمخازن المؤقتة
هيبارينسيجما ألدريتشH3393-50KUنتروية
نترات الصوديومفيشرBP360-500التروية
المجسات الجزيئيةDAPID1306وصمة عار نووية
99.9٪ إيزوفلورانفينيكس57319-559-06مخدر
حمض الهيدروكولوريكفيشرA1445-500المخازن المؤقتة
طبق زجاجيسفلي WillcoHBSB-5040أطباق Willco
لاصقة قابلة لإعادة الاستخدامBostick371351Blu-Tack
مطاط مطاط صناعي من السيليكونWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast Kwik-Cast
Kimberly-Clark34120KimWipe
Mouse مصفوفة الدماغRobozSA-2175قسم الأنسجة
شفرات المصفوفةRobozRS-9887الأنسجة
المضخة التمعجيةCole-Parmer77122-24pefusion
مجهر متحد البؤر المسح بالليزرLeicaSP5المجهر
برنامج التصويرLeicaLAS AFالمجهر المجهري
Leica SP5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles