يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54026

⸱

يونيو 9, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

يمكن تصغير الطعوم الغريبة المشتقة من المريض من الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال إلى أورام دقيقة حية باستخدام نظام ثقافة بيوجيل بشري ثلاثي الأبعاد. هذا الاختبار ثلاثي الأبعاد الشبيه بالجسم الحي مناسب لاختبار الاستجابة للأدوية والتنميط الجزيئي ، بما في ذلك التحليل الحركي.

الملخص

إن استخدام الطعوم الغريبة المشتقة من المريض لنمذجة السرطانات قد قدم نظرة ثاقبة مهمة لبيولوجيا السرطان والاستجابة للأدوية. ومع ذلك ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وتتطلب عمالة مكثفة. للتغلب على هذه العقبات ، تحولت العديد من المجموعات البحثية إلى الثقافات الكروية للخلايا السرطانية. على الرغم من أنها مفيدة ، إلا أن كرويات الورم أو المجاميع لا تكرر تفاعلات مصفوفة الخلية كما هو موجود في الجسم الحي. على هذا النحو ، توفر مناهج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) التي تستخدم سقالة مصفوفة خارج الخلية نظاما نموذجيا أكثر واقعية للتحقيق. بدءا من الطعوم الغريبة تحت الجلد أو داخل الجمجمة ، يتم فصل أنسجة الورم إلى معلق خلية واحدة يشبه المجالات العصبية للخلايا الجذعية السرطانية. ثم يتم دمج هذه الخلايا في مصفوفة خارج الخلية مشتقة من الإنسان ، 3D biogel البشري ، لتوليد عدد كبير من الأورام الدقيقة. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن زراعة الأورام الدقيقة لمدة شهر تقريبا مع قابلية عالية للحياة ويمكن استخدامها لاختبار الاستجابة للأدوية باستخدام فحوصات السمية الخلوية القياسية مثل 3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) وتصوير الخلايا الحية باستخدام Calcein-AM. علاوة على ذلك ، يمكن تحليلها عبر الكيمياء النسيجية المناعية أو حصادها للتنميط الجزيئي ، مثل التنميط الحركي عالي الإنتاجية القائم على المصفوفة ، والذي تم تفصيله هنا أيضا. وبالتالي ، فإن الأورام الدقيقة ثلاثية الأبعاد تمثل نظاما نموذجيا متعدد الاستخدامات عالي الإنتاجية يمكنه التكرار بشكل وثيق في بيولوجيا الورم في الجسم الحي أكثر من الأساليب التقليدية.

المقدمة

وداخل الجمجمة أورام المخ الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا هي الصف الثالث astrocytomas والصف الرابع ورم أرومي الأشكال (ورم أرومي أو GBM). هذه الأورام تقدم التكهنات الفقيرة مع متوسط ​​البقاء على قيد الحياة لمدة عام بين 12-15 شهرا مع العلاجات الحالية للGBM في 1-3 الولايات المتحدة. وتشمل العلاجات Multimodality الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي بما في ذلك temozolomide (TMZ) وكلاء المستهدفة كيناز. وكثيرا ما dysregulated إشارات كيناز في الخليج للحاسبات الآلية، بما في ذلك مجموعات فرعية من الأورام مع التضخيم أو الطفرات تفعيل في البشرة عامل النمو مستقبلات (EGFR)، ويزيد في صفائح الدم المستمدة عامل النمو مستقبلات (PDGFR) يشير، وزيادة الفوسفاتيديل-اينوزيتول 3 كيناز (PI3K) و ورم دعم إشارات عائية من خلال الأوعية الدموية غشائي عامل نمو مستقبلات (VEGFR) فضلا عن غيرها من كيناز مدفوعة مسارات 4-6. الحالي في التجارب المختبرية والنماذج الحية تفقد كثيرا هذه التعديلات النيابية <سوب> 7. بالإضافة إلى ذلك، لم تقدم التنميط الجيني الفوائد المتوقعة التي قد تعكس حقيقة أن التغيرات الجينية وجينية لا يتوقع دائما التغيرات في مستوى نشاط البروتين، حيث معظم كيناز تستهدف وكلاء تعمل مباشرة، وحيث العلاجات مع آليات أخرى للعمل قد تعمل بشكل غير مباشر.

وكان خط الخلية خلد التقليدية التي يمكن passaged لا نهاية لفترة طويلة معيارا لاختبار المخدرات نظرا لسهولة الصيانة والتكاثر. ومع ذلك، هذا النموذج يعاني من بيئة نمو عالية من المغذيات (و الاصطناعي) أن يختار لسريعة النمو الخلايا التي تختلف اختلافا كبيرا عن الورم الأصلي. على هذا النحو، كان هناك اهتمام كبير في تطوير نظم نموذج أكثر واقعية تعكس نظام بيولوجي الورم أكثر تعقيدا كما هي موجودة في المريض. xenografts الورم وضعت مباشرة من الورم الرئيسي نمت في الفئران ( "xenoline،" طعم أجنبي المستمدة من المريض أو PDX). نحن نتعاملدي نظام نموذجي أكثر تعبيرا، وخاصة في تحديد علاجات السرطان، كما انهم شعروا التنبؤ بشكل موثوق النجاح السريري. 8 وعلى الرغم من علم الأحياء أكثر تعبيرا، وهذه النماذج هي مكلفة وصعبة لإنشاء وصيانة. وعلاوة على ذلك، فهي ليست قابلة للدراسات عالية الإنتاجية. الحاجة إلى تطوير أفضل النماذج البيولوجية التي تعكس بشكل أدق التغيرات الجزيئية في الأورام الأولية، والبيانات الشخصية واختبار هذه النماذج باستخدام تدابير مباشرة النشاط كيناز، لا بديل علامات وراثية، هو واضح.

ومن المعروف جيدا أن خلاف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات أحادي الطبقة، 3D أو نماذج الفحص المتعددة الخلايا يمكن أن توفر أكثر من الناحية الفسيولوجية النهاية ذات الصلة 9-11. نهج ثقافة 3D مشتركة تشمل ناقل دقيق المغلفة المصفوفة وتشكيل خلية كروي. يمكن أن تتولد الكروية الورم عن طريق تجميع الخلوي باستخدام قارورة الدوار، لوحة pHEMA ومعلقة تقنيات الهبوط. القيود لروتشمل النهج ذات المناظر: عدم قدرة بعض الخلايا لتشكيل الأجسام الشبه الكروية مستقرة، وتقلب في النمو والتحديات مع أنواع الخلايا المختلطة. بدلا من ذلك، فإن العديد من الاصطناعية (هيدروجيل البوليمر) والحيوانات تستمد Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) مصفوفة من الأورام اللحمية الماوس، والكولاجين البقري) تم وضع مصفوفات للثقافة 3D يدرس 12-14. يستخدم الماوس الصحة والسلامة مصفوفة على نطاق واسع ولكن المعروف لتعزيز نمو الخلايا والتمايز في المختبر والمجراة 15.

من أجل تكرار بيولوجية الورم 3D، تم وضع نظام بايوماتريكس الإنسان الدكتور راج سينغ وآخرون. 16. والطبيعي، والنمو خالية من عامل biogel البشري يسمح السقالات الثقافة 3D (الخرز، وأقراص)، والتي تدعم زراعة طويل الأجل من أنواع خلايا متعددة. وتنشأ سلسلة من 3D التصاميم الثقافة biogel البشري لدراسة نمو الورم، التصاق، الأوعية الدموية والغزو خصائص. مزايا وخصائص biogel البشري بالمقارنة مع شيوعا وتتلخص المواد الهلامية الماوس الصحة والسلامة في الجدول 1 والجدول 2.

مصدر: Amnions الإنسان (الأنسجة المجمعة)
خالية من مسببات الأمراض، الاتحاد الدولي للرجبي معفاة / وافق
طبيعة ECM: غير التشويه والتحريف Biogel (GLP-الإنتاج)
مفتاح
المكونات: 		العقيد-I (38٪)، Laminin (22٪)، العقيد-IV (20٪)، العقيد-III (7٪)، Entactin وHSPG (<3٪)
خالية من GF: غير قابل للكشف EGF، جمعية جيل المستقبل، TGF، VEGF، PDGF (غير للعائية، غير سامة)

الجدول 1: خصائص Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة.

Biogel البشري المواد الهلامية الصحة والسلامة
مصفوفة الإنسان الطبيعية إعادة تشكيل مصفوفة الماوس
نمو الخلايا التي تسيطر عليها والتمايز يمكن أن تعزز نمو الخلايا والتمايز
التعبير الجيني فيزيولوجي التعبير الجيني متغير
نموذج الثقافة مثل الأنسجة 3D نموذج الثقافة القائمة على لوحة
TH-next.within صفحة = "دائما">

الجدول 2: مزايا Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم إنجاز جميع التقييمات العلاج طعم أجنبي باستخدام نموذج ورم مثلي لورم أرومي على بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. عزل خلايا GBM طعم أجنبي المستمدة من المريض

  1. إعداد الكواشف
    1. إعادة تشكل كولاجيناز-I في الماء المعقم إلى تركيز 5 ملغ / مل مرشح ومعقمة. متجر في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية (التركيز النهائي هو 50 ميكروغرام / مل في 100 مل من محلول أنزيم).
    2. حل 100 ميكروغرام البشرة عامل النمو (EGF) في 2 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن في 100 ميكرولتر (5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل.
    3. حل 100 ميكروغرام جمعية جيل المستقبل-β في 2 مل العقيمة برنامج تلفزيوني. مخزن في 100 ميكرولتر (5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل.
    4. إضافة زجاجة التالية إلى 500 واحد مل من Neurobasal ميدالجيش العراقي (مصرف مولدوفا الوطني) لإعداد كامل NBM: 10 مل B-27 ملحق بدون فيتامين A، 5 مل ملحق N2، 100 ميكرولتر EGF، 100 ميكرولتر الخلايا الليفية عامل النمو (جمعية جيل المستقبل) -Basic، 5 مل الأمفوتريسين B، 0.5 مل الجنتاميسين، 5 مل لام الجلوتامين.
    5. يعد حل انزيم جديدة من خلال الجمع بين: 98.5 مل PBS، 1 مل كولاجيناز-1، و 0.5 مل 10X التربسين / EDTA وتعقيم عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرون فلتر المسام.
    6. إعداد أو الحصول على وحدة تخزين صغيرة العقيمة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) / F12 زراعة الخلايا المتوسطة مع 7٪ مصل بقري جنيني (FBS) وبرنامج تلفزيوني 1X بدون الكالسيوم أو المغنسيوم.
  2. ورم تبويب
    ملاحظة: Athymic الماوس نو / نو حقن سابقا مع الخلايا السرطانية في الجهة اليمنى وسمح لمن كتلة الورم واضح هو ضروري لهذا الإجراء. في الأمثلة المعروضة هنا، كنا طعم أجنبي خلايا GBM المشتقة من المريض، JX10 وJX12 17.
    1. تعقيم منطقة العمل عن طريق الرش 2٪ بالكلورهيكسيدين واقامة منطقة عمل خفة دمح الأدوات اللازمة / لوازم بما في ذلك تشاك القابل للتصرف، ملقط، مشرط، والزجاج طبق بيتري، حل الانزيم، في برنامج تلفزيوني، والكلورهيكسيدين (انظر الشكل 2A).
    2. الموت ببطء الماوس / الفئران إيواء ورم الجناح. تهدف لمعدل 20٪ النزوح / دقيقة من CO 2 باستخدام 30٪ CO 2. بعد يظهر الماوس توقف التنفس، والحفاظ على CO 2 تدفق لمدة 1 دقيقة (عادة 3 دقائق المجموع). تتم إزالة الفئران من الغرفة ويتم تنفيذ خلع عنق الرحم تأكيدا القتل الرحيم الثانوي. رش الحيوان مع 3٪ بالكلورهيكسيدين لتطهير الجلد.
    3. في حين عقد الماوس ثابتة، وجعل شبه دائري شق الجلد ~ 1.5 سم من كتلة الورم (الجناح زرع الورم) باستخدام مشرط القابل للتصرف العقيمة مع # 11 شفرة بداية الجمجمة لكتلة الورم وعمل قطع نحو بطن الماوس وحولها إلى نهاية الذيلية.
    4. تعكس الجلد فوق كتلة الورم باستخدام الأصابع مع الجر لطيف على نهاية الذيلية من شق ومن ثم دفع على الجلدالسطح من أجل رفع الورم لديهم أفضل الوصول دون لمس الورم (انظر الشكل 2B).
    5. استخدام تشريح حادة مع ملقط لبلطف حرة كتلة الورم من جدار البريتوني ومن الجلد (انظر الشكل 2C).
    6. نقل كتلة الورم مع ملقط لزجاجي معقم طبق بتري (لا تستخدم أطباق بلاستيكية لمنع كسر أثناء تنميق) وصحيح تجاهل الذبيحة وتضع هذه الصكوك جانبا.
    7. استخدام مجموعة جديدة من الأدوات المعقمة (مشرط مع # 11 شفرة، ملقط شبه المنحنية) لينضر أنسجة الورم من الأنسجة الميتة والمضيف غشائي النسيج الضام الذي يغطي الورم.
    8. وضع حل 15 مل الانزيم في العقيمة تنفيس trypsinizing قارورة بقضيب وتبدأ اثارة ببطء في غطاء محرك السيارة.
    9. في كوب طبق بتري معقمة، وغسل الأورام حصادها 3-5 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة الدم الزائد (قد صب أو استخدام حقنة لشطف لهم مع PBS). إمالة بلطف طبق والماصة أو نضح المواد غسل. اللحم المفروم وinely باستخدام اثنين من ريش # 11 مشرط (انظر الشكل 2D).
    10. إضافة 14 مل من محلول أنزيم إلى ورم المفروم والماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات. قارورة نقل الخليط لtrypsinizing تنفيس ويحرك ببطء لمدة 20 دقيقة. إعداد 5 50 أنابيب مخروطية مل بإضافة 1.5 مل FBS إلى كل من أجل تحييد التربسين في الخطوة 1.2.11.
    11. بعد 20 دقيقة، وجمع 14 مل من محلول خلية من trypsinizing قارورة وإضافة إلى أنبوب واحد مع FBS. إضافة محلول أنزيم 14 مل جديدة لقارورة ويستمر التحريك.
    12. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في 150 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. إضافة 45 مل من اكتمال NBM لبيليه، مزيج بلطف، وتكرار الطرد المركزي لشطف من المصل. اعادة تعليق بيليه في 5ML NBM كاملة وعقد على الجليد.
    13. خطوات الحصاد خلية كرر ما مجموعه 5 مواسم الحصاد، والجمع بين كل الخلايا التي تحصد في أنبوب مخروطي الشكل واحد على الجليد.
    14. وضع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على رأس 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. الإعدادية رانه الخلية مصفاة عن طريق تمرير 10 مل من DMEM / F12 + 7٪ FBS من خلال وثم غسل مع 10 مل برنامج تلفزيوني.
    15. ببطء إضافة تعليق الخلية إلى مصفاة، والسماح لها بالتنقيط من خلال (انظر الشكل 2M). رفع بلطف فوق علامة التبويب للمصفاة الخلية في بين كل إضافة جديدة لكسر أي فراغ وتسمح للخلايا مع وقف التنفيذ لتمرير بحرية (انظر الشكل 2N).
    16. الطرد المركزي تعليق خلية تصفيتها على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق في 10 مل الكامل NBM والعد لتحديد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام 0.04٪ التريبان الأزرق وعدادة الكريات. عقد الخلايا على الجليد حتى الجيل microtumor.

2. الأنسجة البديلة بروتوكول تبويب

  1. الآلية dissociator الأنسجة ونظام تصنيف.
    1. وضع أنبوب التفصيل في dissociator الخلوي، حدد البرنامج "ورم _02_02" ثم اضغط على بدء وتشغيل لمدة 32 ثانية. أنبوب نقل إلى الدوار، ومكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    2. الطرد المركزي الخلايا مع وقف التنفيذ في 150 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. في حين الطرد المركزي الخلايا، وإنشاء الكواشف لمعالجة تعليق الخلية. إضافة 10 مل NBM خالية من المصل وتعليق يسحن بلطف.
    3. بعد الطرد المركزي، والحصول على بيليه الخلية التي تحتوي ~ 10-30 × 10 6 خلايا قابلة للحياة (~ 0.3 مل). إعادة تعليق بيليه في 10 مل مصل خالية NBM (انظر الشكل 2O). تحديد خلايا قابلة للحياة عن طريق فحص استبعاد (انظر الخطوة 3.2.2).

3. الجيل Microtumor

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد كامل NBM كما هو الحال في 1.1.4 وإعداد تحييد biogel عالية الكثافة البشرية (HuBiogel) (HDHG في 3 ملغ / مل) في بروتوكول الداخلي. المصفوفات biogel مماثلة يمكن أن تستخدم أيضا.
  2. Microtumor إنتاج والثقافة
    1. الحصول على خلايا PDX فصلها حديثا كما تعليق خلية واحدة في كامل NBM، على الجليد.
    2. مزيج الخلية سوspension مع حجم مساو من حل التريبان الأزرق (0.4٪ في برنامج تلفزيوني) وتحليلها باستخدام عدادة الكريات لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق 18. إزالة حجم الضروري لتوليد 50000 خلية / microtumor حيث حجم = (50000 خلية / ورم * # الأورام) / (خلية قابلة للحياة عد / 1 مل)، ووضع في أنبوب مخروطي جديدة.
    3. تركز الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 150 x ج، لمدة 8 دقائق، في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف و resuspend بيليه الخلية مع حل HDHG المثلج في نسبة النهائية من 1 خلايا جزء في FBS و 4 أجزاء HDHG.
    4. استخدام ماصة الأقنية الإلكترونية للاستغناء 10 ميكرولتر في دبوس خلية HDHG الخليط على طبق من ذهب الصلب 96-دبوس (مع طلاء مسعور) لتوليد microtumors (2 مم حبات تحتوي كل منها على 50000 الخلايا).
    5. ضع حبات الورم 3D داخل نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، مرطب) لمدة 15 دقيقة ليهلم الخرز.
    6. بعد دبق، ونقل microtumors (10 μ؛ ل) إلى غرفة الثقافة تعليق العرف (50 مل) أو طبق ثقافة حجم كبير (10 سم) التي تحتوي على كامل NBM باستخدام الإلكترونية ماصة متعدد القنوات والعرف دبوس الجهاز.
    7. بعد 1-2 أيام في الأنسجة حاضنة الثقافة، ونقل microtumors لوحات ثقافة 96-جيدا تحتوي على / جيد باستخدام الفم واسعة الاستغناء ماصة وأداء مختلف فحص وتحليل البروتوكولات 50 ميكرولتر NBM.
  3. علاج المخدرات وصيانة microtumors
    1. تحديد تركيزات النهائي لاختبار المخدرات.
      ملاحظة: إذا كانت المخدرات التي عرفها فعالية في ثقافة 2D، حدد 2X جيم 50 كما تركيز الجرعة الأوسط وحدد 3 أضعاف التخفيفات المسلسل أعلاه وأدناه للحصول على ما مجموعه 5 مستويات الجرعة. على سبيل المثال، إذا كان IC 50 هو 9 ميكرومتر للدواء في ثقافة 2D، حدد 2 ميكرومتر، 6 ميكرومتر، 18 ميكرومتر، 54 ميكرومتر، و 162 ميكرومتر كما التركيز النهائي للاختبار المخدرات.
    2. إعداد 2X حل الجرعات المخدرات في كامل NBM من sulfoxi ثنائي ميثيلدي (DMSO) الأسهم. تمييع الحل الجرعات في 1٪ المتوسطة DMSO لإعداد 5 جرعة، التخفيف المتسلسل 3 أضعاف.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من حل الجرعات إلى microtumor تحتوي على 50 ميكرولتر في لوحات فحص لتحقيق تركيز DMSO النهائي من 0.5٪. كرر كل تكرار (على سبيل المثال، 4) في كل جرعة الدواء المحددة في 3.3.1.
    4. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، ترطيب الأنسجة ثقافة حاضنة ل1-14 أيام. الثقافات تغذية مرتين أسبوعيا عن طريق تحديث وسائل الإعلام وحل المخدرات على النحو الوارد أعلاه.

4. المورفولوجية وتحليل المظهري من Microtumors

  1. تحديد شكل الخلية في microtumors باستخدام معيار تلطيخ الخلية الحية.
    1. إعداد 1 الأسهم ملي من Calcein-AM في DMSO. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
    2. على فترات الثقافة المطلوبة (1 و 7 و 14 يوما)، إضافة Calcein-AM حل أعدت في برنامج تلفزيوني (بدون كا / ملغ) لوحة 96-جيدا ل1 ميكرومتر تركيز النهائي.
    3. احتضان20 دقيقة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، حاضنة ترطيب، وصورة باستخدام مجهر مضان في 2X، 4X، و10X (الإثارة: 450-490 نانومتر الفرقة المرور الانبعاثات: 515 تمريرة طويلة نانومتر، مزدوج اللون 500 نانومتر) .
  2. Microtumor النمو / انتشار الفحص
    1. حل مسحوق الإنتقالي العسكري في برنامج تلفزيوني (بدون كا / ملغ) لإعداد 12 ملي الأسهم. تصفية العقيمة، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. على فترات المطلوب الثقافة (1 و 7 و 14 يوما)، إضافة 20 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري لوحة 96-جيدا لكل 100 حجم ثقافة ميكرولتر. احتضان 2 ساعة في نسيج الثقافة الحاضنة.
    3. يعد حل تحلل جديدة من 10٪ SDS في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك وإضافة مبلغ مساو لحجم الثقافة لوحات. احتضان لوحات مغلقة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    4. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام قارئ متعدد لوحة.
  3. إعداد Microtumor لتحليل Kinomic
    1. إعداد العازلة تحلل من قبل تقشعر لها الأبدان إلى 4 درجة مئوية ثم إضافة نسبة 1: 100 كل من 100X بروبروتين الفوسفاتيز المانع (PPI) و100X بروتين مثبط البروتياز (PI). تخلط جيدا والحفاظ على الجليد.
    2. نقل 2 microtumors إلى كل من الثلاثة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إزالة طاف وإضافة 40 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على مؤشر أسعار المنتجين وPI إلى كل أنبوب وليز لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. عينات ماصة بقوة لكسر حبات الورم. أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات عينات C ومخزن في -80 درجة مئوية حتى التحليل kinomic.

5. Kinomic من التنميط Microtumors

  1. بروتين التيروزين كيناز (PTK) التنميط
    1. الكواشف ذوبان الجليد (10X البروتين كيناز (PK) العازلة و 2٪ زلال المصل البقري (BSA)) إلى 4 درجات عازلة C تحميل PK (300 ميكرولتر 10X PK المخزونات الاحتياطية في 2.7 مل درهم 2 O) في حقنة في الموقف رقم 2 على التنميط منصة.
    2. فتح برنامج حاسوبي كيناز فحص وتحميل ملف بروتوكول PTK واضغط على "ستارت"، يحشي العينات في غضون تحديثات برامج المزودهي البرنامج بعد رقائق المسح. وضع رقائق على منصة التنميط وتحميل 25 ميكرولتر من 2٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في مجموعة وثم اضغط LOAD لبدء البروتوكول التي تسيطر عليها البرنامج عرقلة الخطوة.
    3. تمييع 6 ميكرومتر من 100 ملي الأسهم ATP مع 54 ميكرولتر درهم 2 O لجعل 10 ملي أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). عندما يبدأ البرنامج في الثالث 3، وخطوة غسل النهائية (مرئية على الشاشة) جلب 15 ميكروغرام من المحللة جلبت تصل إلى 28 ميكرولتر مع DH 2 O، ومزيج إضافة إلى مجموعة.
    4. تحضير مزيج PTK الرئيسي (MM) (لمدة تصل إلى 12 عينة). إضافة 32.6 ميكرولتر درهم 2 O لإعادة dithiothreitol (DTT) وإضافة 6 ميكرولتر DTT، و 60 ميكرولتر 10X PK حل لأنبوب PTK-MM1 (تحتوي بالفعل على 60 ميكرولتر 10X BSA).
    5. انتظر حتى موجه 'تحميل' في البرنامج كيناز فحص يبدو ثم إضافة 126 ميكرولتر من PTK-MM1، 60 ميكرولتر PTK المضافة، و 60 ميكرولتر 10 ملي اعبي التنس المحترفين لMM2 (يحتوي aliquoted سابقا 4.5 ميكرولتر PY20 FITC الأجسام المضادة) وتخلط.إضافة 16 ميكرولتر من هذا المزيج سيد PTK إلى كل أنبوب المحللة عينة ومزيج ماصة 5 مرات.
    6. ضمان غطاء زجاجي نظيف ثم إضافة 35 ميكرولتر المحللة / مزيج الرئيسي لكل مجموعة، بالقرب غطاء دائري، واضغط على زر التحميل.
  2. سيرين / ثريونين كيناز (STK) التنميط:
    1. الكواشف ذوبان الجليد (10X العازلة PK، 10X STK العازلة، و 2٪ BSA) إلى 4 درجات مئوية. عازلة تحميل PK (300 ميكرولتر في 2.7 مل درهم 2 0) في موقف حقنة # 1، 1:10 و عازلة STK (300 ميكرولتر في 2.7 مل درهم 2 0) في حقنة موقف # 2.
    2. فتح كيناز فحص البرنامج برامج الكمبيوتر وتحميل ملف بروتوكول STK ثم اضغط على ستارت، يحشي العينات في غضون البرنامج بعد رقائق المسح. وضع رقائق على منصة التنميط وتحميل 25 ميكرولتر من 2٪ BSA لكل مجموعة، ثم اضغط LOAD لبدء بروتوكول منع الخطوة التي تسيطر عليها البرنامج.
    3. تمييع 6 ميكرومتر من 100 ملي اعبي التنس المحترفين مع 54 ميكرولتر درهم 2 O. خلال (3 الثالثة) مزيج الخطوة غسل النهائي2 ميكروغرام من المحللة وتقديم ما يصل الى 32.6 ميكرولتر مع DH 2 O، ومزيج إضافة إلى مجموعة.
    4. جعل STK مزيج الرئيسي: إضافة 70 ميكرولتر 10X PK لأنبوب STK-MM1 (يحتوي على 7 ميكرولتر 100X BSA)، ثم قم بإضافة 42 ميكرولتر درهم 2 O لأنبوب STK-MM1.
    5. انتظر حتى موجه "تحميل" في برنامج فحص كيناز ثم: إضافة 18 ميكرولتر 10 ملي اعبي التنس المحترفين لSTK-MM1، وإضافة 9 ميكرولتر MM1 لكل المحللة عينة. اخلط جيدا.
    6. ضمان غطاء زجاجي نظيف وإضافة 35 ميكرولتر المحللة / مزيج الرئيسي لكل مجموعة، بالقرب غطاء دائري، ثم اضغط على LOAD.
    7. خلال النهائية (3 الثالثة) غسل الخطوة إضافة الجسم المضاد الثانوي 1.05 ميكرولتر STK-FITC إلى أنبوب DMAB (يحتوي على 3.03 ميكرولتر STK مزيج الأجسام المضادة الأولية)، إضافة 39.6 ميكرولتر AB العازلة لDMAB، إضافة 356.0 ميكرولتر درهم 2 O لDMAB، إضافة 30 ميكرولتر إلى DMAB إلى كل مجموعة، ثم اضغط على LOAD .
  3. تحليل Kinomic بيانات 19،20
    1. برامج التحليل مفتوحة وتحميل صورة تحليل التطبيقات. سيlect مجلد الصور التي تحتوي على barcoded وختمها الوقت صور مجموعة كاملة من البيانات PTK أو STK، مطابقة عدد اختر المادة ملف تخطيط مجموعة (86312 لPTK و87102 لSTK)، وتحميل ولدت من قبل مجموعة الشرح الملف.
    2. تحقق gridding الصحيح لجميع الصور، وتشغيل التعرض الوقت توسيع نطاق التطبيقات. مقارنة إحصائية التعرض / منحدر log2 تحولت القيم، والتحقق من صحة مع prewash منحنيات الحركية 19-21.
    3. تشغيل المنبع التنبؤ برامج كيناز الاستعلام الشخصية kinomic المتغيرة بين شروط تحركات المنبع 22،23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد أثبتنا أن نظام الثقافة biogel 3D يدعم النمو على المدى الطويل وظيفة من أنواع خلايا متعددة. في هذا المشروع التعاوني، وتستخدم xenolines GBM المشتقة من المريض (PDX) لإنتاج مئات microtumors. كانت جزءا لا يتجزأ من الخرز biogel (2 مم) وبعد دبق سريع أنهم مثقف في مفاعل حيوي مخصصة NB-وسائل الإعلام ليس صحيحا - تنفصل الخلايا (3 × 10 5) أو neurospheres (50 40). تم تحديد الجدوى الخلوية (Calcein-AM)، لمحة النمو (الإنتقالي العسكري)، وتحليل kinomic أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تتصل أساسا microtumor جيل، وكذلك الجرعات المخدرات والصيانة. لأن حبات microtumor هشة وممزقة بسهولة، لا بد من الحذر الشديد في كل مراحل النمو لفحص وصيانة. إذا حدث خطأ أثناء أي من هذه العمليات، والتفسير التجريبي يمكن أن يتعرض للخطر، مما تسبب في تمديد أو التكرار غير الضروري للتجارب أو حتى استبعاد البيانات.

تعديلات والمشاكل، خصوصا في عملية التنمية microtumor، تضمن تصميم وإنتاج أداة مسعور مخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

RS و RSS موظفون في Vivo Biosciences. يتم تمويل JCA جزئيا من قبل UAB Kinome Core.

شكر وتقدير

بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R21 (PI: C. ويلي، CA185712-01)، الدماغ جائزة ورم بوغ (PD: غراي غيليسبي، P20CA 151129-03) وعقد SBIR (PI: R. سينغ، N43CO-2013-00026).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Collagenase-I سيجما ألدريتشCO130
التربسين EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplementLifeTechnologies 17502-0481x التركيز النهائي
B-27 الملحق مع فيتامين أتقنيات الحياة12587-0101x التركيز النهائي
المؤتلف البشري FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 نانوغرام / مل التركيز
النهائيتقنيات EGF الحياة البشرية المؤتلفةPGH031510 نانوغرام / مل التركيز النهائي
L-GlutamineCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM التركيز النهائي
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 & micro ؛ جم / مل التركيز النهائي
البنسلين ستربتومايسينأوميغا ScientificPS-20100 U / مل البنسلين G ، 100 & micro ؛ جم / مل من الستربتومايسين التركيز النهائي
GentamicinLife Technologies15750-06050 نانوغرام / مل التركيز النهائي
MTTLife TechnologiesM6494المحضرة إلى 5 مجم / مل في PBS وتصفية معقمة ، 1 مجم / مل في البئر
SDSFisherBP166للمخزن المؤقت لتحلل MTT ، محضرة إلى 10٪ في 0.01 & nbsp ؛ M حمض الهيدروكلوريك ، 5٪ في بئر
حمض الهيدروكلوريكفيشرA144SI-212للمخزن المؤقت لتحلل MTT ، أعد إلى 0.01 & nbsp ؛ M مع SDS, 5 mM في بئر
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM في مخزون DMSO, 2  ومايكرو. M في محلول تلطيخ PBS ، 1 & nbsp ؛ ومايكرو. م في حالة جيدة
توقف s كوكتيل مثبط البروتين فوسفاتيز بيرس ThermoScientific78420نسبة 1:100 في MPER 
مثبط بروتين البروتينات من هالت  بيرس ثرثرو ساينتScientific87786نسبة 1: 100 في كاشف استخراج بروتين الثدييات MPER
(MPER) بيرسثرثرو ساينتيفPI78501
تريبان بلوبيرس ثرثرو ساينتيكال15250-061
DMSOفيشرBP231لإذابة الكالسين AM والمركبات
الملحية المخزنة بالفوسفات بدون Ca /Mg Lonza17-517Qمخفف إلى 1x بماء MiliQ فائق النقاء ومفلتر معقم (لزراعة الخلايا)
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع Ca / MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVمخفف إلى 1x بماء MiliQ فائق النقاء (للغسيل المسبق)
بروتوكول الفورمالين المحايد 10٪032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
مثبط بروتين الفوسفاتيز عالي الكثافة HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt's Protein PhosphatasePierce78420
مثبط بروتين البروتين Halt'sPierce87786
كاشف استخراج بروتين الثدييات (MPER) ThermoScientific78501
رقاقة التنميط لبروتين التيروزين كيناز (PTK)PamGene86312
PTK كيناز عازلةPamGene36000300 & micro; ل 10x مخزون PK المخزن المؤقت في 2.7   ؛ مل dH2< / sub>O ، رقم الكتالوج لمجموعة كاشف PTK
ATPPamGene36000رقم الكتالوج لمجموعة كاشف PTK
PY20- الجسم المضاد المترافق FITCPamGene36000لمجموعة كاشف PTK
PTK المضافPamGene32114
PTK-MM1 (10x BSA)PamGene36000لمجموعة
كاشف PTKرقاقة التنميط المصفوفة Serine / Threonine Kinase (STK)PamGene87102
STK kinasePamGene32205رقم كتالوج لمجموعة كاشف STK
الأجسام المضادة الأولية STK (أنبوب DMAB) رقمكتالوج PamGene32205لمجموعة كاشف STK
الأجسام المضادة الثانوية المترافقة FITCأنبوب PamGene32203
STK-MM1 (100x BSA) PamGeneرقم الكتالوج 32205لمجموعة كاشف STK
عازلة الأجسام المضادة STKPamGene32205رقم الكتالوج لمجموعة كاشف STK
المعدات
# 11 شفرات ،مشرط فيشرمعقمة 3120030
# 3 ، معقمةفيشر08-913-5
أطباق بتري زجاجية 100 ممفيشر08-748D
ملقط شبه منحنيفيشر12-460-318
قارورة التربسينفيشر10-042-12B
مغناطيسيفيشر14-490-200
3/4 "شريط تحريكفيشر14-512-125
مصفاة خلية B-D   ؛فيشر# 352340
B-D 50 مل أنبوب الطرد المركزيفيشر# 352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 برنامج التحليل الحركي فحص PamGene
Evolve Kinaseتطبيق PamGene
UpKin (التنبؤ ب كيناز المنبع)PamGene
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
نظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS)SyntheconRCCS-Dمع 10 مل HARV يمكن التخلص
محلول رقم كتالوج أنبوب رقم كتالوج buffer مزيج مقابض محرك برنامج برنامج منه

المراجع

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MTT
جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.