يمكن تصغير الطعوم الغريبة المشتقة من المريض من الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال إلى أورام دقيقة حية باستخدام نظام ثقافة بيوجيل بشري ثلاثي الأبعاد. هذا الاختبار ثلاثي الأبعاد الشبيه بالجسم الحي مناسب لاختبار الاستجابة للأدوية والتنميط الجزيئي ، بما في ذلك التحليل الحركي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إن استخدام الطعوم الغريبة المشتقة من المريض لنمذجة السرطانات قد قدم نظرة ثاقبة مهمة لبيولوجيا السرطان والاستجابة للأدوية. ومع ذلك ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وتتطلب عمالة مكثفة. للتغلب على هذه العقبات ، تحولت العديد من المجموعات البحثية إلى الثقافات الكروية للخلايا السرطانية. على الرغم من أنها مفيدة ، إلا أن كرويات الورم أو المجاميع لا تكرر تفاعلات مصفوفة الخلية كما هو موجود في الجسم الحي. على هذا النحو ، توفر مناهج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) التي تستخدم سقالة مصفوفة خارج الخلية نظاما نموذجيا أكثر واقعية للتحقيق. بدءا من الطعوم الغريبة تحت الجلد أو داخل الجمجمة ، يتم فصل أنسجة الورم إلى معلق خلية واحدة يشبه المجالات العصبية للخلايا الجذعية السرطانية. ثم يتم دمج هذه الخلايا في مصفوفة خارج الخلية مشتقة من الإنسان ، 3D biogel البشري ، لتوليد عدد كبير من الأورام الدقيقة. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن زراعة الأورام الدقيقة لمدة شهر تقريبا مع قابلية عالية للحياة ويمكن استخدامها لاختبار الاستجابة للأدوية باستخدام فحوصات السمية الخلوية القياسية مثل 3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) وتصوير الخلايا الحية باستخدام Calcein-AM. علاوة على ذلك ، يمكن تحليلها عبر الكيمياء النسيجية المناعية أو حصادها للتنميط الجزيئي ، مثل التنميط الحركي عالي الإنتاجية القائم على المصفوفة ، والذي تم تفصيله هنا أيضا. وبالتالي ، فإن الأورام الدقيقة ثلاثية الأبعاد تمثل نظاما نموذجيا متعدد الاستخدامات عالي الإنتاجية يمكنه التكرار بشكل وثيق في بيولوجيا الورم في الجسم الحي أكثر من الأساليب التقليدية.
المقدمة
وداخل الجمجمة أورام المخ الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا هي الصف الثالث astrocytomas والصف الرابع ورم أرومي الأشكال (ورم أرومي أو GBM). هذه الأورام تقدم التكهنات الفقيرة مع متوسط البقاء على قيد الحياة لمدة عام بين 12-15 شهرا مع العلاجات الحالية للGBM في 1-3 الولايات المتحدة. وتشمل العلاجات Multimodality الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي بما في ذلك temozolomide (TMZ) وكلاء المستهدفة كيناز. وكثيرا ما dysregulated إشارات كيناز في الخليج للحاسبات الآلية، بما في ذلك مجموعات فرعية من الأورام مع التضخيم أو الطفرات تفعيل في البشرة عامل النمو مستقبلات (EGFR)، ويزيد في صفائح الدم المستمدة عامل النمو مستقبلات (PDGFR) ي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم إنجاز جميع التقييمات العلاج طعم أجنبي باستخدام نموذج ورم مثلي لورم أرومي على بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
1. عزل خلايا GBM طعم أجنبي المستمدة من المريض
- إعداد الكواشف
- إعادة تشكل كولاجيناز-I في الماء المعقم إلى تركيز 5 ملغ / مل مرشح ومعقمة. متجر في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية (التركيز النهائي هو 50 ميكروغرام / مل في 100 مل من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد أثبتنا أن نظام الثقافة biogel 3D يدعم النمو على المدى الطويل وظيفة من أنواع خلايا متعددة. في هذا المشروع التعاوني، وتستخدم xenolines GBM المشتقة من المريض (PDX) لإنتاج مئات microtumors. كانت جزءا لا يتجزأ من الخرز biogel (2 مم) وبعد دبق سريع أنهم مثقف في مفاعل حيوي مخصصة NB-وسائل الإعلام ليس صحيحا - تنفصل الخلايا (3 × 10 5) أو neurospheres (50 40). تم تحديد الجدوى الخلوية (Calcein-AM)، لمحة النمو (الإنتقالي العسكري)، وتحليل kinomic أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تتصل أساسا microtumor جيل، وكذلك الجرعات المخدرات والصيانة. لأن حبات microtumor هشة وممزقة بسهولة، لا بد من الحذر الشديد في كل مراحل النمو لفحص وصيانة. إذا حدث خطأ أثناء أي من هذه العمليات، والتفسير التجريبي يمكن أن يتعرض للخطر، مما تسبب في تمديد أو التكرار غير الضروري للتجارب أو حتى استبعاد البيانات.
تعديلات والمشاكل، خصوصا في عملية التنمية microtumor، تضمن تصميم وإنتاج أداة مسعور مخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
RS و RSS موظفون في Vivo Biosciences. يتم تمويل JCA جزئيا من قبل UAB Kinome Core.
شكر وتقدير
بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R21 (PI: C. ويلي، CA185712-01)، الدماغ جائزة ورم بوغ (PD: غراي غيليسبي، P20CA 151129-03) وعقد SBIR (PI: R. سينغ، N43CO-2013-00026).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Collagenase-I | سيجما ألدريتش | CO130 | |
| التربسين EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life | Technologies 17502-048 | 1x التركيز النهائي |
| B-27 الملحق مع فيتامين أ | تقنيات الحياة | 12587-010 | 1x التركيز النهائي |
| المؤتلف البشري FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 نانوغرام / مل التركيز |
| النهائيتقنيات EGF الحياة البشرية المؤتلفة | PGH0315 | 10 نانوغرام / مل التركيز النهائي | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM التركيز النهائي |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 & micro ؛ جم / مل التركيز النهائي |
| البنسلين ستربتومايسين | أوميغا Scientific | PS-20 | 100 U / مل البنسلين G ، 100 & micro ؛ جم / مل من الستربتومايسين التركيز النهائي |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 نانوغرام / مل التركيز النهائي |
| MTT | Life Technologies | M6494 | المحضرة إلى 5 مجم / مل في PBS وتصفية معقمة ، 1 مجم / مل في البئر |
| SDS | Fisher | BP166 | للمخزن المؤقت لتحلل MTT ، محضرة إلى 10٪ في 0.01 & nbsp ؛ M حمض الهيدروكلوريك ، 5٪ في بئر |
| حمض الهيدروكلوريك | فيشر | A144SI-212 | للمخزن المؤقت لتحلل MTT ، أعد إلى 0.01 & nbsp ؛ M مع SDS, 5 mM في بئر |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM في مخزون DMSO, 2 ومايكرو. M في محلول تلطيخ PBS ، 1 & nbsp ؛ ومايكرو. م في حالة جيدة |
| توقف s كوكتيل مثبط البروتين فوسفاتيز | بيرس ThermoScientific | 78420 | نسبة 1:100 في MPER |
| مثبط بروتين البروتينات من هالت | بيرس ثرثرو ساينتScientific | 87786 | نسبة 1: 100 في كاشف استخراج بروتين الثدييات MPER |
| (MPER) بيرس | ثرثرو ساينتيف | PI78501 | |
| تريبان بلو | بيرس ثرثرو ساينتيكال | 15250-061 | |
| DMSO | فيشر | BP231 | لإذابة الكالسين AM والمركبات |
| الملحية المخزنة بالفوسفات بدون Ca / | Mg Lonza | 17-517Q | مخفف إلى 1x بماء MiliQ فائق النقاء ومفلتر معقم (لزراعة الخلايا) |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع Ca / Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | مخفف إلى 1x بماء MiliQ فائق النقاء (للغسيل المسبق) |
| بروتوكول الفورمالين المحايد 10٪ | 032-060 | ||
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| مثبط بروتين الفوسفاتيز عالي الكثافة Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase | Pierce | 78420 | |
| مثبط بروتين البروتين Halt's | Pierce | 87786 | |
| كاشف استخراج بروتين الثدييات (MPER) Thermo | Scientific | 78501 | |
| رقاقة التنميط لبروتين التيروزين كيناز (PTK) | PamGene | 86312 | |
| PTK كيناز عازلة | PamGene | 36000 | 300 & micro; ل 10x مخزون PK المخزن المؤقت في 2.7 ؛ مل dH2< / sub>O ، رقم الكتالوج لمجموعة كاشف PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | رقم الكتالوج لمجموعة كاشف PTK |
| PY20- الجسم المضاد المترافق FITC | PamGene | 36000 | لمجموعة كاشف PTK |
| PTK المضاف | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | لمجموعة |
| كاشف PTKرقاقة التنميط المصفوفة Serine / Threonine Kinase (STK) | PamGene | 87102 | |
| STK kinase | PamGene | 32205 | رقم كتالوج لمجموعة كاشف STK |
| الأجسام المضادة الأولية STK (أنبوب DMAB) رقم | كتالوج PamGene | 32205 | لمجموعة كاشف STK |
| الأجسام المضادة الثانوية المترافقة FITC | أنبوب PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 (100x BSA) PamGene | رقم الكتالوج 32205 | لمجموعة كاشف STK | |
| عازلة الأجسام المضادة STK | PamGene | 32205 | رقم الكتالوج لمجموعة كاشف STK |
| المعدات | |||
| # 11 شفرات ، | مشرط فيشر | معقمة 3120030 | |
| # 3 ، معقمة | فيشر | 08-913-5 | |
| أطباق بتري زجاجية 100 مم | فيشر | 08-748D | |
| ملقط شبه منحني | فيشر | 12-460-318 | |
| قارورة التربسين | فيشر | 10-042-12B | |
| مغناطيسي | فيشر | 14-490-200 | |
| 3/4 "شريط تحريك | فيشر | 14-512-125 | |
| مصفاة خلية B-D ؛ | فيشر | # 352340 | |
| B-D 50 مل أنبوب الطرد المركزي | فيشر | # 352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 برنامج التحليل الحركي | فحص PamGene | ||
| Evolve Kinase | تطبيق PamGene | ||
| UpKin (التنبؤ ب كيناز المنبع) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| نظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | مع 10 مل HARV يمكن التخلص |
المراجع
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
