مقالة منهجية

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

DOI:

10.3791/54036

⸱

يونيو 13, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Surgery, Tohoku University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السائل الصفراوي هو مصدر قيم للحويصلات / الإكسوسومات خارج الخلية التي تحتوي على مؤشرات حيوية يحتمل أن تكون مهمة. يمثل هذا البروتوكول طريقة قوية لعزل الإكسوسومات من الصفراء البشرية لمزيد من التحليلات بما في ذلك توصيف miRNA.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البحث Exosome في السنوات الثلاث الماضية وسعت كثيرا من نطاق نحو تحديد وتوصيف المؤشرات الحيوية واستخداماتها العلاجية.

وقد ثبت Exosomes مؤخرا لاحتواء الرنا الميكروية (ميرس). نشأت ميرس أنفسهم المؤشرات الحيوية القيمة لأغراض التشخيص. كما جمع العينات في العيادات والمستشفيات هو متغير تماما، ميرنا بمعزل عن الصفراء كلها تختلف إلى حد كبير. لتحقيق قوية ودقيقة وقابلة للتكرار الشخصية ميرنا من عينات الصفراء التي تم جمعها بطريقة بسيطة يتطلب وضع بروتوكول ذات جودة عالية لعزل وتوصيف exosomes من الصفراء. وتتطلب هذه الطريقة عدة centrifugations وخطوة الترشيح مع خطوة تنبيذ فائق النهائية لتكوير exosomes معزولة. المجهر الإلكتروني، البقع الغربية، وتدفق الخلوي ومتعددة المعلمة جسيمات متناهية الصغر تحليل البصرية، حيثما كان ذلك متاحا، خطوات حاسمة توصيف للتحقق من جودة هxosomes. لعزل ميرنا من هذه exosomes، ارتفاعه المحللة مع ذلك، ميرنا الاصطناعية غير محدد من الأنواع مثل ايليجانس انواع معينة، أي سل-مير-39، من المهم للتطبيع كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي. عزل exosome من السائل المراري التالي هذا الأسلوب يسمح للميرنا ناجحة التنميط من عينات الصفراء تخزينها لعدة سنوات في -80 درجة مئوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثل غيرها من السوائل البيولوجية، أي حليب الثدي، البلازما أو البول، والصفراء تحتوي exosomes، الدهون الحويصلات الغنية 1-4. يمكن Exosomes حمل أو تغيير الوظائف البيولوجية في خلايا المتلقي 5، 6، شكل من أشكال الاتصال خلية خلية التي قد تكون جزءا من وظيفة وضعها الطبيعي 4، 7-9. يمكن أن تحتوي Exosomes الأنواع ميرنا التي يمكن أن توفر مصدرا قيما للالمؤشرات الحيوية للتشخيص 10. اكتسبت ملامح miRNAs اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة كعلامات التشخيصية والتنبؤية لمجموعة متنوعة من الأمراض 11-14.

ميرنا نفسها يمكن العثور عليها في السوائل البيولوجية، وربما تفرز من الخلايا الميتة وكمية من الخلايا سقيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل المرض الأساسي. البيانات الشخصية ميرنا من exosomes لا تعبر بالضرورة عن الشخصية ميرنا الخلية تنشأ 6، 10، 15-17، بعد exosomes قد تحمل تواقيع ميرنا التي قد تكون سمة لم الوالدينليرة لبنانية ترغب في الخلايا السرطانية. وقد تم تحديد exosomes المستمدة من ورم في بلازما المرضى الذين يعانون من السرطان الرئوي وسرطان البروستاتا والأورام الأخرى 8 و 16 و 18.

والهدف من هذه الطريقة هو العزلة متينة وموثوق بها من exosomes من العينات الصفراء الإنسان ومستقلة إلى حد كبير من إجراءات التعامل مع فترة سابقة. وقد تم تطويره لاستخدام الصفراء كمصدر موثوق به من ميرنا لتشخيص محتمل للأمراض القناة الصفراوية مثل سرطان القنوات الصفراوية cholangiocarcinoma 19. انها تتكون من عدة خطوات الطرد المركزي مع زيادة سرعات لعزل exosomes وقد تكون قابلة للتطبيق على السوائل البيولوجية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحصول على الصفراء من المرضى عن طريق تصوير البنكرياس بالتنظير الباطني بالطريق الراجع (ERCP) يتطلب الموافقة على بروتوكول الخاضعين للدراسة الإنسان من قبل مجلس المراجعة المؤسسية. وقد وافق جميع الأعمال المعروضة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية جامعة جونز هوبكنز.

1. Exosome عزل من الصفراء

  1. أداء تصوير البنكرياس بالتنظير الباطني بالطريق الراجع (ERCP). وضع المريض في موقف ضعيف وتدخله.
    1. تمرير منظار الإثناعشري عن طريق الفم من المريض وأدخله في الجزء الثاني من الاثني عشر والتعرف على حليمة الرئيسية.
    2. انتقائي يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة عن طريق إدراج التجويف ثلاثية مبضع المصرة محملة مسبقا مع 0.035 بوصة (0.9 ملم) سلك التوجيه ماء.
    3. دفع سلك التوجيه بتوجيه جهاز أشعة للالقناة الكبدية اليسرى منذ أحيانا قد يكون من الصعب التفريق بين القناة المرارية من القناة الكبدية اليمنى، ثم دفعمبضع المصرة 5 سم في القناة الصفراوية للحصول على وضع مستقر.
    4. إزالة سلك التوجيه، ونعلق حقنة 10 مل إلى ميناء سلك التوجيه من خلال قفل لور ونضح الصفراوية باستخدام 10 مل من الضغط السلبي.
    5. إزالة حقنة تحتوي الصفراء على المضي قدما في ERCP قبل إعادة إدخال سلك التوجيه وحقن عامل تباين عبر ميناء حقن ليعتم الشجرة الصفراوية.
    6. نقل الصفراء التي تم جمعها في أنبوب 15 مل على الجليد والحفاظ على الجليد حتى جاهزة للمضي قدما في خطوة الطرد المركزي.
      الحذر: ارتداء القفازات لحماية نفسك والعينات! علاج الصفراء كمصدر محتمل للعدوى لأنها يمكن أن تحتوي على التهاب الكبد A الجسيمات الفيروسية!
    7. نأخذ عينة (ق) على الجليد. إما المضي قدما في الخطوة 1.2 أو أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم تجميد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
      ملاحظة: بشكل روتيني استخدمت عينات المخزنة بهذه الطريقة لعدة سنوات مع نتائج جيدة 19.
  2. نقل 400 ميكرولتر من الصفراوية في أنبوب microcentrifuge وجمع الخلايا والحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. إزالة طاف قبل pipetting، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge الطازجة وأجهزة الطرد المركزي لعينة (ق) في 16500 x ج لمدة 20 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية لمسح طاف المزيد من الحطام. تجاهل أنابيب في نفايات بيولوجية. بدلا من ذلك، وتدور العينات في نابذة بدلا من ذلك.
  4. جمع طاف وتصفية عليه في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع حقنة من خلال مرشح غشاء 0.2 ميكرون polyethersulfone (PES) التي لديها معدلات تدفق جيدة وانخفاض بروتين ملزمة لإزالة أي جزيئات أكبر من 200 نانومتر نقاط.
  5. الماصة وطاف تصفيتها لنابذة الأنابيب وإضافة برنامج تلفزيوني بحيث الأنابيب أكثر من 2/3 كاملة. إذا كانت أنابيب تحتوي على أقل سيولة من ذلك، فإن أنابيب ينهار خلال الطرد المركزي! الأنابيب يمكن غسلها، تعقيمها وإعادة استخدامها عدة مرات.
  6. بيلوآخرون في exosomes من خلال تنبيذ فائق في 120000 x ج لمدة 70 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد نظرة الطرد المركزي في الجزء السفلي من أنبوب نابذة لرؤية أحيانا الكريات الصفراء الصغيرة؛ هذه هي exosomes.
  7. تجاهل طاف بواسطة الصب بعناية وتطهير النفايات عن طريق إضافة مواد التبييض إلى تركيز النهائي من 10٪ ت / ت والسماح لها الوقوف لمدة 20 دقيقة.
  8. للتجارب المصب، إما معالجة بيليه (ق) في حجم صغير من الحل المناسب (أي الترسيب المناعي الشعاعي فحص (المعهد الملكي) العازلة لعزل بروتين، RNA العازلة تحلل لمير العزلة) أو و resuspend في 50-150 ميكرولتر من الفوسفات المالحة (PBS) والتي يمكن تخزينها إما في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR QRT-) أو استخراج البروتين الخ) أو استخدامها لتوصيف إعداد exosome بواسطة تيم أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر .

2. Exosome تحديد من قبلانتقال المجهر الإلكتروني (تيم) أو CryoEM

  1. و resuspend الحويصلات خارج الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل pipetting. من الناحية المثالية، استخدام exosomes التي لم يتم تخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية، وخاصة عند تنفيذ عزل لأول مرة.
  2. كثف قسامة 20 ميكرولتر (حوالي 2 ميكروغرام) إلى 400 Parlodion الشبكات النحاسية المغلفة الكربون يتناغم لمدة 2 دقيقة والسماح ليجف في RT.
  3. إصلاح exosome في 1٪ (ت / ت) غلوتارالدهيد (EM-درجة) لمدة 5 دقائق على RT عن طريق وضع قطرات بعناية على إعداد المجففة.
  4. غسل شبكات مرتين مع الماء لمدة 5 دقائق ثم النقيض من المركبات الكهربائية وصمة عار مع حمض الفسفوتنغستيك 1٪ (PTA) لمدة 30 ثانية.
  5. الحصول على صور باستخدام المجهر الإلكتروني مع الجهد تسارع من 80 كيلو فولت بدأت في تكبير من 20،000X وزيادة ل100،000X عند تحديد حجم الجسيمات.
    ملاحظة: محضرات أخرى مثل طبقات على 200 شبكة النحاس أو النيكل شبكات الكربون المغلفة Formvar ولى النقيض من تلطيخكه 1٪ أو 2٪ خلات اليورانيل لمدة 10-15 دقيقة ممكنة أيضا.
  6. لCryoEM، مزيج قسامة 20 ميكرولتر (حوالي 2 ميكروغرام) مع 60 ميكرولتر بروتين G الذهب 10 نانومتر (1: 3 نسبة). وهذا سوف يساعد على تحديد قطرها exosome.
  7. نقل العينات على شبكات الكربون هولي C-شقة-تفريغها توهج وإزالة السائل الزائد من قبل النشاف. تجميد الشبكات عن طريق غمس منهم على الفور الى الايثان السائل.
  8. تركيب شبكات في cryoholder في النيتروجين السائل.
  9. الحصول على الصور بسرعة 200 كيلو فولت مع تكبير من 20،000X و100،000X.

3. Exosome تحديد من متعدد المعلمة جسيمات متناهية الصغر تحليل بصري

  1. Resuspend وexosomes معزولة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل pipetting.
  2. تمييع exosomes في 600 ميكرولتر PBS في عدة نسب مختلفة (مثل 01:50، 1: 100، 1: 300، 1: 600 و 1: 1200).
  3. تصور exosomes بواسطة ضوء الليزر تناثر مع الصك والبرامج المناسبة في الوقت الحقيقي وفقا لMANUFACTUبروتوكول الإندوبلازمية في 20.
  4. زيادة مستوى الكاميرا في وضع الالتقاط حتى تصبح جزيئات مرئية، ثم ضبط التركيز لجعل جزيئات تبدو على نحو سلس.
  5. بينما في الوضع العادي، والحد من الكاميرا إلى أدنى مستوى الجزيئات لا يزال ينظر، إذا لزم الأمر ضبط مصراع الكاميرا وتحقيق مكاسب لتحقيق ذلك.
  6. فحص البصر لضمان 20-100 جزيئات مرئية على الشاشة، إن لم يكن مسح وحدة وضبط التخفيف في برنامج تلفزيوني.
  7. ثم ضبط مدة القبض على ما بين 30-60 ثانية. بعد القبض على الفيديو، وضبط المعلمات المعالجة حتى يتم تحديد جميع الجزيئات التي تظهر على الشاشة ومعالجة ملف الفيديو.

4. Exosome توصيف عن طريق ويسترن وصمة عار

  1. ليز exosome الكريات 2-5 مل من الصفراء في 100 ميكرولتر من الجليد الباردة الترسيب المناعي الشعاعي فحص (المعهد الملكي) العازلة مع مثبط البروتياز من قبل pipetting صعودا وهبوطا بدقة وخلط لست] بقوة لمدة 30 ثانيةفي دوامة لإذابة البروتينات بشكل فعال.
  2. في حين أن معظم الوقت ليس من الضروري استخدام نبض صوتنة من العينات على الجليد مع 2 البقول لمدة 10 ثانية كل لضمان تحلل كامل.
  3. بيليه مواد غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 15000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونقل طاف لأنبوب نظيفة.
  4. تحديد تركيز البروتين مع طريقة الاختيار (أي حمض bicinchoninic (BCA)، Coomassie أو تعديل لوري، 660 نانومتر الفحص البروتين، الخ) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. هذه الطريقة لا يقل أهمية طالما يتم استخدام نفس الأسلوب باستمرار لتحقيق النتائج التي يمكن مقارنتها عبر التجارب.
  5. تحميل 50 ميكروغرام من البروتين لكل عينة العازلة في Laemmli بعد تسخين العينة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في بئر من هلام بولي أكريلاميد لالكهربائي (PAGE).
  6. Electrophorese العينات على المواد الهلامية PAGE مقابل 1.5 ساعة ونقل البروتينات فصلها إلى غشاء النايلون.
  7. بقفل الغشاء (s) مع الحليب الخالي 5٪ في مخزنة المالحة تريس مع 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة، ثم احتضان مع الأجسام المضادة exosome محددة مثل مكافحة CD63 ومكافحة TSG-101 في التخفيف 1: 500 ويفضل O / N عند 4 درجات مئوية.
  8. غسل الأغشية مع TBS-T 3 × 10 دقيقة، ثم احتضان مع الاقتضاء، مطابقة الضد الثانوية HRP-مترافق في الحليب الخالي 5٪ في TBS-T لمدة 1-2 ساعة على RT.
  9. غسل غشاء (ق) 3 × 5 دقائق مع TBS-T وكشف بروتينات معينة مع الكواشف التوهج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. صورة الأغشية مع الفيلم أو نظام التصوير الرقمي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

5. الرنا الميكروي عزل من Exosomes متفرقة

ملاحظة: ويتم عزل ميرنا من exosomes الصفراء من استخدام ميرنا العزلة المعدلة على أساس عدة المتاحة تجاريا، ولكن أي طريقة RNA العزلة أخرى يمكن استخدامها أو تكييفها.

  1. إضافة 300 &# 181؛ ل تحلل / بناء عازلة لبيليه exosome (معزولة عن 400 الصفراوية ميكرولتر)، دوامة، الماصة أو تمر من خلال إبرة / حقنة لليز تماما exosomes للحصول على المحللة متجانسة.
  2. إضافة 1/10 (30 ميكرولتر) حجم ميرنا جناسة المضافة، ومزيج جيد من قبل vortexing أو قلب الأنبوب عدة مرات.
  3. احتضان هذا المزيج لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  4. إضافة حجم حمض الفينول: الكلوروفورم مساويا لجناسة الأولي (300 ميكرولتر).
  5. إضافة 5 ميكرولتر من 5 fmol / ميكرولتر سل-مير 39 ودوامة لمدة 30-60 ثانية.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ج في RT لفصل مائي (العلوي) والعضوية (أقل) مراحل.
  7. نضح بعناية المرحلة العليا من قبل pipetting ونقل إلى أنبوب جديد مع الإشارة إلى حجم نقل. تجاهل المرحلة العضوية في حاوية النفايات العضوية المناسبة.
  8. لإثراء لالرنا صغيرة تضاف 1/3 كمية الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية المستردة وتخلط جيدا قبل vortexing أو للقلب توتكون عدة مرات.
  9. الماصة الخليط المحللة / الايثانول على فلتر خرطوشة، وتصل إلى 700 ميكرولتر في وقت واحد.
  10. أجهزة الطرد المركزي خراطيش لمدة 15 ثانية في مدة أقصاها 10000 x ج أو تطبيق فراغ لتمرير الخليط من خلال تصفية.
  11. جمع الرشاحة وإذا تجاوز خليط المحللة / الإيثانول 700 ميكرولتر، ونقل التدفق من خلال لأنبوب جديد وكرر الإجراء لجمع كل الرواشح. يحتوي على هذه فلتر كسور RNA تخلو من الرنا صغيرة، ويمكن استخدامها لاسترداد هذه الرنا أكبر.
  12. إضافة 2/3 حجم RT الإيثانول بنسبة 100٪ في إجمالي الترشيح وتخلط جيدا من قبل vortexing.
  13. الماصة الخليط الترشيح / الايثانول على خرطوشة فلتر الثانية. مثل قبل الحد الأقصى لحجم التي يمكن تطبيقها في آن واحد هو 700 ميكرولتر.
  14. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 10000 x ج أو تطبيق فراغ كما هو موضح في الخطوة 5.10.
  15. تجاهل التدفق من خلال، وكرر حتى كل من خليط الترشيح / الايثانول تم تصفيتها.
  16. تطبيق 70081؛ ل ميرنا الحل اغسل 1 إلى خرطوشة الفلتر، الطرد المركزي لمدة 5-10 ثانية أو تطبيق فراغ وتجاهل التدفق من خلال.
  17. غسل فلتر مع 500 ميكرولتر غسل الحل 2/3 كما فعلت في الخطوة 5.16.
  18. تكرار غسل مرة الثانية مع 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 كما في الخطوة 5.16، تجاهل التدفق من خلال وضع مرشح مرة أخرى في أنبوب جمع.
  19. تدور خرطوشة الفلتر لمدة 1 دقيقة في 10000 x ج لإزالة جميع السوائل المتبقية من مرشح.
  20. نقل خرطوشة مرشح في أنبوب جمع جديدة وتطبيق 100 ميكرولتر من (95 ° C) المياه nuclease ساخنة مجانية إلى مركز للتصفية.
  21. تدور المجالس لمدة 20-30 ثانية في أقصى سرعة لاستعادة الحمض النووي الريبي.
  22. جمع شطافة واستخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ exosomes صغيرة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري العادية أو التدفق الخلوي، المجهر الإلكتروني أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر لابد من القيام بها. التحليل البصري جسيمات متناهية الصغر لديه ميزة على المجهر الإلكتروني أنه هو أيضا الكمي ويوفر حجم التوزيع والتركيز. الصك يدخل شعاع ليزر تركز بدقة من خلال منشور زجاجي في العينة. يتم التقاط الحركة البراونية من الحويصلات معزولة عن طريق EMCCD كاميرا عالية الحساسية وتتبع على أساس الإطار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للاستفادة موثوق exosomes معزولة عن النكد، فمن المهم استخدام وسائل عالية الجودة بما يتفق العزلة للحصول على عينات عالية الجودة في المقابل. منهجية محددة في هذه الورقة هي وسيلة راسخة لعزل exosomes وميرنا من الصفراء الإنسان. وهو يسلط الضوء على عدد من الخطوات الهامة في توصيف exosomes معزولة التي كحد أدنى يجب أن تشمل المجهر الإلكتروني أو التحليل الضوئي جسيمات متناهية الصغر والبقع الغربية.

الخطوة الأكثر أهمية في عزل exos...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا أحد من المؤلفين لديه مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من خلال جائزة K08 (DK090154-01) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH ؛ إلى F.M.S.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 وميكرو ؛ م مرشح غشاء Polyethersulfone (PES)Corning431229
أنابيب الطرد المركزي الفائق polyallomer thinwall   ؛بيكمان كولتر331374
دوار SW40Tiبيكمان كولتر
LM10-HS & nbsp ؛النانوية Nanosight
(NTA) ؛Nanosight
mirVANALife TechnologiesAM1560
مثبط البروتياز الكاملRoche الذي تم توزيعه بواسطة Sigma-Aldrich4693116001
Immobilon PSQMillipore ، Bedford MAISEQ00010
الأجسام المضادة المضادة ل CD63Abcamab59479
Anti-Tsg101Abcamab30871
برنامج تحليل تتبع الجسيمات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  2. Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649(2013).
  3. Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856(2014).
  4. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  5. Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  6. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282(2011).
  7. Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
  8. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  9. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  10. Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
  11. Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
  12. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
  13. Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
  14. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  15. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
  16. Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  17. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  18. Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
  19. Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
  20. Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
  21. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

microRNA miRNA

مقالات ذات صلة