مقالة منهجية

واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية

9.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54043

⸱

يونيو 18, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

في هذه المقالة

ملخص

وهناك طريقة العائد المرتفع على خطوة واحدة تنقية السلبية المؤتلف هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) overexpressed في القولونية باستخدام راتنجات diethylaminoethyl في دفعة واسطة يوصف. HP-NAP تنقيته بواسطة هذه الطريقة هو مفيد لتطوير اللقاحات والعقاقير، أو تشخيص له. بيلوري -associated الأمراض.

الملخص

هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) هو عامل الفوعة الرئيسي للهيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري). انها تلعب دورا حاسما في ه. -induced بيلوري التهاب المعدة عن طريق تنشيط الكريات البيض عدة الفطرية بما فيها العدلات، وحيدات، والخلايا البدينة. الخصائص المناعية والمناعية من HP-NAP تجعل منه مرشحا محتملا التشخيص واللقاحات له. بيلوري ومرشح دواء جديد لعلاج السرطان. من أجل الحصول على كميات كبيرة من تنقية HP-NAP المستخدمة في التطبيقات السريرية لها، وسيلة فعالة لتنقية هذا البروتين مع ارتفاع العائد ونقاء يحتاج إلى أن تنشأ.

في هذا البروتوكول، ونحن قد وصفت طريقة لخطوة واحدة تنقية الكروماتوغرافي السلبية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية (إي كولاي) باستخدام diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني (على سبيل المثال، باستخدام Sephadex) طدفعة واسطة ن. يشكل المؤتلف HP-NAP ما يقرب من 70٪ من البروتين الكلي في E. يتم استرداد القولونية وبشكل كامل تقريبا في جزء قابل للذوبان على تحلل الخلايا في درجة الحموضة 9.0. تحت الظروف المثلى في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد معظم HP-NAP في جزء غير منضم في حين أن البروتينات الذاتية من E. تتم إزالة القولونية بكفاءة من الراتنج.

هذه طريقة تنقية باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني غلة وظيفية HP-NAP من E. القولونية في شكل الأصلي مع ارتفاع العائد والنقاء. المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.

المقدمة

هيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري) هو أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والقرحة الهضمية. كما تم تصنيفها هذه البكتيريا كمادة مسرطنة في البشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان، وهي جزء من منظمة الصحة العالمية، في عام 1994. وتشير التقديرات إلى أن معدل انتشار ه. العدوى بيلوري 70٪ في البلدان النامية، و30-40٪ في البلدان الصناعية 1. على الرغم من أن معدل إصابة ه. بيلوري يتناقص في البلدان الصناعية، فإن معدل إصابة ه. بيلوري في البلدان النامية لا يزال مرتفعا 2. العلاج القياسي للقضاء على ه. يتكون العدوى بيلوري من إدارة مضخة البروتون مثبط، مؤشر أسعار المنتجين، واثنين من المضادات الحيوية، كلاريثروميسين بالإضافة إلى أموكسيسيلين أو ميترونيدازول 3. ومع ذلك، وصعود المقاومة للمضادات الحيوية في H. ذات الصلة ب بيلوري العلاج قرحة يحث على وضع استراتيجيات جديدة لمنع سص علاج العدوى. تطوير لقاح وقائي و / أو العلاجية ضد ه. بيلوري يمكن أن توفر نهجا بديلا للسيطرة على ه. العدوى بيلوري.

هيليكوباكتر بيلوري تم تحديد-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP)، وهو عامل الفوعة كبير من H بيلوري، للمرة الأولى في المستخلصات المائية من H. بيلوري مع القدرة على تفعيل العدلات على الانضمام إلى الخلايا البطانية وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 4. تسلل العدلة من الغشاء المخاطي في المعدة وجدت في H. pylori- المرضى المصابين مع التهاب المعدة قد تسهم في التهاب وتلف الأنسجة المعدة. وبالتالي، قد HP-NAP تلعب دورا المرضية من خلال تفعيل العدلات للحث على التهاب المعدة، مما يسبب المزيد من قرحة أو H. بيلوري -associated الأمراض المعدية. ومع ذلك، HP-NAP هو مرشح محتمل للتطبيقات السريرية 5،6. نظرا للمحترفين مناعة والمناعيةperties من HP-NAP، هذا البروتين يمكن أن تستخدم لتطوير لقاحات، وكلاء العلاجية، وأدوات التشخيص. وقد أجريت تجربة سريرية لاستخدام المؤتلف HP-NAP واحدة من مكونات لقاح بروتين ضد ه. بيلوري. يتكون هذا اللقاح المؤتلف HP-NAP، المرتبط سامة للخلية جين ألف (CagA)، والبروتينات المفجي سامة للخلية ألف (فاكا) وضعت مع هيدروكسيد الألومنيوم، وكذلك ثبت أن تكون آمنة ومناعة لدى البشر (7). أيضا، HP-NAP بمثابة مناعي قوي لتحريك T نوع المساعد 1 (TH1) -polarized الاستجابات المناعية لعلاج السرطان 8 وأسفل تنظيم الاستجابات المناعية بوساطة TH2-التي تسببها الحساسية والالتهابات الطفيلية 9،10. أما بالنسبة للتشخيص، وقد تم تطبيق المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP في H. -infected بيلوري المرضى 11. وأظهرت إحدى الدراسات أن مستوى الأجسام المضادة HP-NAP الخاصة في الأمصال من H. السنة التحضيرية-infected وري المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة وكان أعلى بكثير من تلك التي من المرضى الذين يعانون من التهاب المعدة المزمن 12. وأظهرت دراسة أخرى أيضا أن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP ترتبط مع وجود غير الفؤاد-المعدة غدية 13. وهكذا، يمكن تطبيقها المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP لتشخيص سرطان المعدة في H. -infected بيلوري المرضى. مجتمعة، المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.

من بين العديد من الطرق المستخدمة لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في القولونية (إي كولاي) في شكله الأصلي ذكرت حتى الآن، هناك حاجة إلى الثانية خطوة تنقية تنطوي اللوني هلام الترشيح للحصول نقية للغاية HP-NAP 14-16 . هنا، وطريقة استخدام سلبي اللوني دفعة واسطة معيوصف diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني لتنقية HP-NAP overexpressed في E. القولونية مع ارتفاع العائد ودرجة نقاوة عالية. واستندت هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP من الكسر غير منضم. هذا النهج تنقية باستخدام DEAE التبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي بسيط وتوفير الوقت من خلال السماح تنقية المؤتلف HP-NAP عبر خطوة واحدة اللوني من خلال مجموعة من الكسر غير منضم. بالإضافة إلى HP-NAP، والعديد من الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الفيروسات 17، المناعي G (مفتش) 18، الهيموجلوبين 19، بروتين الفوسفاتيز 20، وعامل الفوعة فلاجيلين 21، كما تم الإبلاغ عن أن يطهر التبادل الأيوني اللوني في سلبية واسطة. ويفضل وضع سلبي للالتبادل الأيوني اللوني إذا الشوائب هي قاصرالمكونات الموجودة في العينة تعرضوا ليتم تنقيته 22. وقد استعرضت تطبيق اللوني سلبي في تنقية الجزيئات الحيوية الطبيعية أو المؤتلف مؤخرا 23.

ويقدم هذا التقرير خطوة بروتوكول خطوة للتعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية، تحلل الخلايا، وتنقية HP-NAP باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني. إذا كان البروتين المطلوب لتنقية مناسبة للالتبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي، ويمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول صفها كنقطة انطلاق لتطوير عملية تنقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم جمع الدم البشري من المتطوعين الأصحاء للموافقة المسبقة عن خطية مسبقة وموافقة من مجلس المؤسسي استعراض جامعة تسينغ هوا الوطنية، هسينشو، تايوان.

1. التعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية

  1. إعداد البلازميد pET42a-NAP التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP من H. بيلوري 26695 سلالة كما هو موضح سابقا (16). إعداد البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP مع الطفرات نقطة المطلوبة كما هو موضح (انظر البروتوكول، خطوة 8).
  2. تحويل 10 نانوغرام من البلازميدات الحمض النووي أعلاه إلى E. القولونية BL21 (DE3) الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية، خط الخلايا على مرق استذابة (LB) أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  3. تطعيم المستعمرات واحد في أنابيب الفردية التي تحتوي على 5 مل من مرق LB مع 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين وزراعتها كما precultures في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 2 مل من الخلايا ما قبل ثقافة أعلاه إلى 200 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين في قارورة 1 لتر. احتضان القارورة ثقافة تلقيح عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 0،4-0،5 الكشف عن طريق الأشعة فوق البنفسجية / VIS معمل.
  5. إضافة 80 ميكرولتر من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في الثقافة أعلاه لتركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن HP-NAP. احتضان الثقافة لمدة 3 ساعة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 1،6-1،7.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 6000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة طاف. تخزين بيليه خلية في -70 درجة مئوية حتى تنقية.

2. إعداد جزء البروتين القابلة للذوبان التي تحتوي على HP-NAP

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية للخروج في 4 درجات مئوية.

  1. و resuspend 50 مل من خلية صellet أعد بروتوكول خطوة 1.6 في 20 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم التي تحتوي على 0.13 ملي phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF)، 0.03 مم N-ألفا-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)، و 0.03 ملي N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) في 4 درجات مئوية كما سبق وصفها 16.
  2. تعطيل خلايا البكتيريا عن طريق تمرير تعليق البكتيرية من خلال الخالط ارتفاع ضغط تعمل على مجموعة من 15،000 إلى 20،000 رطل لمدة 7 مرات في 4 درجات مئوية.
  3. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا المحللة في 30000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لفصل أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان باستخدام نابذة. نقل طاف باعتبارها جزء من البروتين القابلة للذوبان في كوب.
  4. قياس تركيز البروتين في جزء البروتين القابلة للذوبان باستخدام طريقة برادفورد باستخدام طقم التجارية مع زلال المصل البقري (BSA) كمعيار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. إضافة 177.6 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 20 مل من الالبريد ذوبان جزء من البروتين الحصول عليها من بروتوكول خطوة 2.3 إلى ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني من درجة الحموضة 9.0 إلى 8.0 درجة الحموضة.
  6. إضافة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم إلى محلول البروتين المذكور أعلاه لجعل تركيز البروتين النهائي ليكون 0.5 ملغ / مل.

3. تنقية المؤتلف HP-NAP من E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات التبادل الأيوني

  1. إعداد 15 مل من راتنجات DEAE.
    1. تزن من 0.6 غرام من مسحوق جاف من راتنجات DEAE وتعليقه في 30 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 في اليوم على الاقل.
    2. أجهزة الطرد المركزي الراتنج في 10000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. إزالة والتخلص من طاف.
    4. إضافة 15 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم.
    5. كرر بروتوكول الخطوات 3.1.2 إلى 3.1.4 أربع مرات أكثر.
    6. تخزين 15 مل استقر الراتنج (50٪ الطين في 30 مل العازلة تريس) في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: كل من الخطوة التاليةتتم الصورة من عند 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 45 مل من البروتينات القابلة للذوبان التي أعدت في بروتوكول خطوة 2،6 حتي 15 مل من الراتنج وتحريك الطين بروتين / الراتنج مع محرك مغناطيسي في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. صب الطين بروتين / الراتنج في عمود من البلاستيك أو الزجاج مزودة محبس. تسمح الراتنج ليستقر تحت الجاذبية.
  4. فتح محبس للسماح الحل البروتين لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غير منضم، الذي يحتوي على تنقية HP-NAP.
  5. إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في العمود.
  6. فتح محبس للسماح للغسل العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غسل.
  7. كرر بروتوكول الخطوات 3،5-3،6 أربع مرات أكثر لجمع الكسور غسل إضافية.
  8. إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم في عمود.
  9. فتح محبس للسماح للشطف العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع من خلال تدفق كما الكسر شطف.
  10. كرر بروتوكول الخطوات 3،8-3،9 أربع مرات أكثر لجمع الكسور شطف إضافية.

4. تبادل العازلة وإزالة الذيفان الداخلي من HP-NAP تنقية كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات

ملاحظة: أعرب النقي HP-NAP في E. يحتاج القولونية يتعرضون للتخفيف الصرف وإزالة الذيفان الداخلي السابقة لتحفيز العدلات.

  1. أداء غسيل الكلى لتغيير المخزن المؤقت للتنقية HP-NAP إلى Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ودرجة الحموضة 7.2، في 4 درجات مئوية باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 14 كيلو دالتون كما هو موضح سابقا (24).
  2. تصفية مدال HP-NAP من خلال سيرينجالبريد فلتر مع موجبة الشحنة، غشاء ماء تعلق على 20 الحقنة مل في معدلات تدفق تتراوح 2،5-4 مل / دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الذيفان الداخلي.

5. توصيف خصائص الجزيئية لتنقية المؤتلف HP-NAP من الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)، ويسترن التنشيف، الأم-PAGE، جل الترشيح اللوني، والتعميم ازدواج اللون الطيفي

  1. تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP بواسطة SDS-PAGE والغربية النشاف مع supernatants ثقافة هجين يحتوي الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ماب 16F4 25 كما سبق وصفه (24).
  2. تحليل المطهرون HP-NAP التي كتبها الأم-PAGE وهلام الترشيح اللوني لدراسة وضعها بلازميدة قليلة القسيمات كما هو موضح سابقا (26).
  3. تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP من ازدواج اللون الطيفي دائري لدراسة هيكلها الثانوي كما هو موضح سابقا (26).

6. تقييم الطهارة من HP-NAP من الفضة تلطيخ من هلام SDS-PAGE

  1. إعداد الحل وتحديد وتوعية حل، حل الفضة، ووضع حل، والتوقف عن الحل، والحل غسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للمجموعة الفضية تلطيخ.
  2. أداء تلطيخ الفضة من هلام SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لعدة تلطيخ الفضة.
  3. الحصول على صورة من هلام مع نظام التصوير.

7. قياس ROS الإنتاج من العدلات المستحث بواسطة HP-NAP

  1. عزل العدلات الإنسان من الدم heparinized البشري عن طريق الترسيب ديكستران تليها الطرد المركزي كثافة التدرج كما هو موضح سابقا (24).
  2. قياس الإنتاج ROS من العدلات حفز مع HP-NAP باستخدام التوهج الفحص تعتمد على مينول.
    1. تشغيل قارئ لوحة وضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. وضعفارغة مسطحة القاع لوحة 96-جيدا بيضاء داخل الغرفة لوحة القارئ، والسماح لها الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
    2. تحضير مخاليط التحفيز في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 0.9 ملي CaCl 2، 0.5 ملي MgCl 2، و 13.3 ميكرومتر 5-أمينو-2،3-ثنائي هيدرو-1،4-phthalazinedione (مينول) مع وجود وغياب 0.67 ميكرومتر-إزالة الذيفان الداخلي HP-NAP أعدت من بروتوكول خطوة 4.2.
    3. ضبط تركيز العدلات الإنسان أعدت من الخطوة بروتوكول 7،1-2 × 10 6 خلية / مل في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 5 ملي الجلوكوز.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق العدلة في كل بئر من 96-بشكل جيد في حين طبق من ذهب.
    5. إضافة 150 ميكرولتر من خليط من الحوافز التي أعدت من بروتوكول خطوة 7.2.2 في العدلات تحتوي جيدا في فترة زمنية من 5 ثوان لكل بئر.
    6. قياس الانبعاثات من التوهج لمدة 5 ثوان لكل بئر على مدى ثلاث ساعات باستخدام قارئ لوحة.

8.بناء الحمض النووي البلازميدات ايواء HP-NAP المسوخ التي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) القائم على الطفرات الموقع المباشرة

ملاحظة: تم إنشاء PCR القائم الطفرات المباشر الموقع في الأساس كما هو موضح سابقا 27 إلا أن أدخلت المواقع قيود "الصامتة" لالاشعال الطفرات التي كتبها الطفرات موقع الموجه (SDM) برنامج -assist 28.

  1. أداء PCR رد الفعل.
    1. إضافة 10 نانوغرام البلازميد pET42a-NAP، 1 ميكرومتر من أزواج التمهيدي الطفرات المدرجة في الجدول 1، 200 ميكرومتر من triphosphates deoxynucleoside (dNTPs)، و 3 وحدات من مزيج انزيم عالية الدقة PCR في أنبوب PCR يحتوي على ماء منزوع الأيونات، وإعطاء النهائي حجم 25 ميكرولتر.
    2. بدء دورات PCR في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفسد الحمض النووي القالب، وتابع مع ​​12 دورات التضخيم في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، T م لم -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
    3. الانتهاء من دورات PCR معخطوة الصلب في T م ص -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وخطوة التمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. علاج 15 ميكرولتر من الناتج PCR مع 0.4 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تحليل 2 ميكرولتر من الناتج PCR تعامل I-DPN من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز.
  3. المسوخ الشاشة.
    1. تحويل 2 ميكرولتر من الناتج PCR إلى E. القولونية DH5α الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية.
    2. نشر الخلايا تحولت على لوحة LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    3. عزل DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام عدة تحلل القلوية التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. علاج DNA البلازميد معزولة في بروتوكول خطوة 8.3.3 مع انزيم التقييد XhoI للتحقق من وجود الطفرات الصامتة المطلوبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    5. تسلسلDNA البلازميد التحقق من قبل بروتوكول خطوة 8.3.4 مع التمهيدي T7 المروج لتأكيد تصحيح تسلسل الترميز من المسوخ HP-NAP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أعرب الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي لتنقية السلبية المؤتلف HP-NAP في E. ويرد القولونية باستخدام DEAE راتنجات التبادل الأيوني في دفعة واسطة في الشكل 1. وتقوم هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP في شكله الأصلي من الكسر غير منضم (الشكل 2A وباء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وضع دفعة اللوني السلبي مع DEAE راتنجات أنيون الصرف المقدمة هنا هي مناسبة لتنقية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية E. قيم الرقم الهيدروجيني للمخازن المستخدمة في خطوات تحلل الخلايا وتنقية هي حيوية للغاية لضمان ذوبان HP-NAP في E. لست] القولونية والفصل الفعال للالمؤتلف HP-NAP من الشوائب الخلية المضيفة، على التوالي. يجب هي lysed الخلايا البكتيرية في الرقم الهيدروجيني 9.0، ويجب أن يتم تنفيذ تنقية السلبية في درجة الحموضة 8.0 للحصول على HP-NAP في ارتفاع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

HWF و YCY مخترعان لبراءات الاختراع TW I 432579 و US 8،673،312 لطريقة التنقية بخطوة واحدة للبروتين المنشط للعدلات Helicobacter pylori . ستكون جميع المواد الموضحة في المخطوطة متاحة لأغراض البحث. يؤكد المؤلفون أن هذا لا يغير التزامهم بجميع سياسات JoVE بشأن مشاركة البيانات والمواد.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور تشاو شنغ تشنغ في جامعة تسينغ هوا الوطنية ، تايوان ، لإجراء قياس ثنائي اللون الدائري. كما نشكر الدكتورين إيفانثيا جالانيس وإيانكو دي إيانكوف في Mayo Clinic، الولايات المتحدة الأمريكية، على توفير الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل HP-NAP. نحن نقدر الدكتورين هان وين تشانغ وتشونج تشين في مستشفى ماكاي التذكاري ، هسينشو ، تايوان ، لتقديم المشورة لتطبيق IRB ، والسيد Te-Lung Tsai في مستشفى Mackay Memorial ، Hsinchu ، تايوان ، للإشراف على تحليل العدلات المعزولة ، والسيدة Ju-Chen Weng في جامعة Tsing Hua الوطنية ، تايوان ، لمساعدتها الفنية. تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (MOST 104-2311-B-007-003 و NSC101-2311-B-007-007 و NSC98-2311-B-007-006-MY3) ، وبرنامج البحث المشترك لجامعة تسينغ هوا الوطنية ومستشفى ماكاي التذكاري (100N7727E1 ، 101N2727E1 ، 103N2773E1) ، وبرنامج البحث في جامعة تسينغ هوا الوطنية (104N2052E1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد
pET42a-NAP N / AN / Aأعدت كما هو موضح في البيانات التكميلية للمرجع 15   ؛
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. القولوني< / em> BL21 (DE3)ThermoFisher Scientific IncC6000-03https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
KanamycinAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
الأيزوبروبيل بيتا ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
= IPTG٪ 20
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)سيجما ألدريتش10837091001مثبط البروتياز
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)مثبط البروتياز Sigma-AldrichT7254
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)Sigma-AldrichT4376مثبط البروتين
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
معيار البروتين (ألبومين مصل الأبقار)سيجما ألدريتشP5619 بروتين قياسي لمقايسة بروتين Bio-Rad
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– Sephadex   A-25 كلوريد شكلSigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
Spectrum / Por أنابيب غسيلالكلى مختبرات الطيف132720مع قطع الوزن الجزيئي 14 كيلو دالتون < / > http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720 ؛
وحدات Acrodisc & reg مع Mustang & reg ؛ MSTG25E3 غشاء EPallلإزالة السموم الداخلية ؛ تعمل بمعدلات تدفق تتراوح من 1 إلى 4 مل / دقيقة
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر MAb 16F4N / AN / Aمرفوعة ضد HP-NAP المنقى من سلالة H. pylori NCTC 11637 كما هو موضح في Refernce 23 ؛   هدية من الدكتورين إيفانثيا جالانيس وإيانكو دي إيانكوف في Mayo Clinic ، الولايات المتحدة الأمريكية
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare LifeSciences 28989335لتصنيع كروماتوغرافيا ترشيح الهلام
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
تلطيخ الفضة PlusOne ، بروتينGE Healthcare علوم الحياة17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Life Sciences17-1440-02للطرد المركزي المتدرج للكثافة لتنقية العدلات البشرية
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963 / 17144002
صفيحة بيضاء مسطحة 96 بئرThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511محمية من الضوء
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
توسيع & nbsp ؛ نظام PCR الطويلSigma-Aldrich11681834001مصدر لمزيج إنزيم PCR عالي الدقة
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn INew England BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho INew England BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. القولونية < م > DH5 & ألفا ؛شركة Thermo Fisher ScientificInc 18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
NameCompany Product NumberComments
Equipment
 
U-2800 شعاع مزدوج الأشعة فوق البنفسجية / VIS مقياس الطيفالضوئي هيتاشي & nbsp ؛N / Aخارج السوق وترقيتها إلى طراز جديد
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 الخالط عاليAvestin IncC315320http://www.avestin.com/English/c3page.html
هيتاشي كوكي هيماك CP80WX الطرد المركزي العامهيتاشي كوكي 90106401لفصل أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من الإشريكية القولونية< إم > المحللة
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
& Auml ؛ KTA FPLCGE علوم الحياة للرعايةالصحية 18-1900-26لميكروماتوغرافيا ترشيح الهلام
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
أفيف موديل 62ADS مقياس الطيف الضوئيالمضغوط Aviv BiomedicalN / Aخارج السوق وتم ترقيته إلى نموذج جديد http://www.avivbiomedical.com/circular.php
نظام التصوير LAS-3000FujifilmN / Aتم إيقافه واستبداله
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) متعدد التسمياتPerkin-Elmer1420-018للكشف عن التلألؤ الكيميائي
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018
مجموعة الضغط

المراجع

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157(2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786(2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HP NAP DEAE

مقالات ذات صلة