مقالة منهجية

قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في

12.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54045

⸱

يونيو 27, 2016

1Department of Pharmacology, University of Virginia

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الورقة طريقة لقياس أكسدة الوقود في ذبابة الفاكهة السوداء التي يتم فيها تغذية كميات ضئيلة من ركائز التمثيل الغذائي المحددة ذات العلامات الإشعاعية للذبابة. يتم جمع وقياس الزفير ذو التصنيف الراديويCO2 الناتج عن أكسدة الوقود.

الملخص

ويتزايد تطبيق قوة الوراثة ذبابة الفاكهة على أسئلة من الإشارات الهرمونية والتمثيل الغذائي، وتطوير نماذج من الأمراض التي تصيب البشر في هذا الحي. وهناك حاجة إلى طرق حساسة لقياس المعلمات مثل معدلات التمثيل الغذائي لدفع فهم علم وظائف الأعضاء والمرض في الحيوانات الصغيرة مثل ذبابة الفاكهة. الطريقة الموصوفة هنا يقيم أكسدة الوقود في أعداد صغيرة من الذباب الكبار تغذية الأغذية التي تحتوي على كميات ضئيلة من 14 ركائز المسمى C مثل الجلوكوز أو الأحماض الدهنية. بعد فترة التغذية وأي التلاعب التجريبية إضافية، يتم نقل الذباب لأنابيب قصيرة توج مع شبكة، والتي يتم وضعها في قوارير زجاجية تحتوي على ورق الترشيح المشبعة كوه التي الفخاخ الزفير، CO رديولبلد 2 لدت من أكسدة ركائز رديولبلد كما بيكربونات البوتاسيوم، KHCO 3. ويقاس هذا بيكربونات رديولبلد من التلألؤ العد. هذا هو عبد القديرنهج uantitative، قابلة للتكرار، وبسيطة لدراسة أكسدة الوقود. استخدام الجلوكوز رديولبلد والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية أو يسمح بتحديد مساهمة هذه المصادر الوقود المختلفة لاستقلاب الطاقة في ظل ظروف مختلفة مثل التغذية والصيام وخلفيات وراثية مختلفة. ويكمل هذا النهج الأخرى المستخدمة لقياس في استقلاب الطاقة في الجسم الحي، وينبغي تعزيز فهم تنظيم الأيض.

المقدمة

وقد ساهم العمل في الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في فهم الأسس الوراثية، والعمليات التنموية، والنمو، والشيخوخة، والسلوك، والحصانة والأمراض التي تصيب البشر 1،2. وأدى عدد لا يحصى من النهج البيولوجية الوراثية والخلايا في ذبابة الفاكهة تقدم في هذه المجالات. ومع ذلك، وضعت دراسة التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة ببطء أكثر، ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى الصعوبات في قياس المعلمات الأيض في مثل هذه الحيوانات الصغيرة. دفعت اهتماما باستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السكري ولفهم المساهمات التمثيل الغذائي للنمو ومختلف الأمراض الميدان لتطوير وتكييف تقنيات التمثيل الغذائي لهذا الكائن الحي 3،4.

وسائل موثوق بها تتوفر لقياس عدد من المعلمات الأيض في ذبابة الفاكهة الآن. على سبيل المثال، فإنه واضح ومباشر لتقييم الاستهلاك الغذائي 5، ومستويات الدهون الثلاثية المخزنة والجليكوجين، وكذلك تعميم مستويات الدملمف الجلوكوز والسكر تعميم كبير في الطيران، طرهالوز، وهو ديساكهارايد تتألف من اثنين من جزيئات الجلوكوز 4. وقد مكن استخدام استشفاف الأيض دراسة امتصاص العناصر الغذائية من النظام الغذائي وتحويل العناصر الغذائية الممتصة مثل الجلوكوز إلى جليكوجين أشكال التخزين والدهون الثلاثية 6. ويمكن تقييم معدلات التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة من خلال قياس استهلاك الأوكسجين 7،8 وثاني أكسيد الكربون (CO 2) الإنتاج. دورة حمض الستريك يتأكسد الوحدتين الكربون التي يمكن أن تدخل دورة كما أسيتيل التميم A (لجنة الزراعة)، وهي مشتقة من استقلاب الكربوهيدرات الغذائية وتخزينها والأحماض الدهنية. كل منعطف دورة يولد جزيء واحد كل من GTP (أو ATP) والجهة المانحة الإلكترون القوات المسلحة الهايتية 2، ثلاثة جزيئات NADH، وجزيئين من ثاني أكسيد الكربون الناتج من النفايات 2. CO 2 إنتاج يمكنأن تستخدم لتقدير معدل الأيض القاعدي. إجمالي إنتاج CO 2 يمكن قياسها كميا في ذبابة الفاكهة من خلال استخدام قياس التنفس المتاحة تجاريا أو المصنوعة يدويا 9-10،11.

قياس إجمالي إنتاج CO 2، وخصوصا عندما يقترن قياس استهلاك O 2، ويوفر معلومات قيمة حول كامل الجسم استقلاب الطاقة. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء لا تحديد المواد الغذائية التي تتأكسد لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). يمكن ثلاث فئات رئيسية من المواد المغذية يدخل الليمون الحامض دورة التحويل التالية إلى الاسيتيل جنة الزراعة: الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، والبروتينات. الجلوكوز 6 فوسفات، والمستمدة من الجلوكوز الغذائية أو تخزين الجليكوجين، يمكن تحويلها إلى البيروفات التي decarboxylated بواسطة نازعة البيروفات لتشكيل الاسيتيل جنة الزراعة. انهيار الأحماض الدهنية المستمدة من الغذاء أو من الدهون الثلاثية المخزنة بواسطة عائدات ß للأكسدة أسيتيل التميم أن ثم يدخل دورة حمض الستريك. أخيراوالغالبية العظمى من الأحماض الأمينية يمكن أن تدخل دورة حمض الستريك بعد أن تحول إلى البيروفات، أسيتيل التميم أو حمض الستريك وسيطة دورة مثل ألفا كيتوغلوتارات.

يمكن رصد مساهمة بالمغذيات محددة لاستقلاب الطاقة خلال القاعدية والشروط حفز من خلال استخدام استشفاف المشعة. ويتم تكييف بروتوكول المعروضة هنا للاستخدام في ذبابة الفاكهة من بروتوكول يستخدم لتقييم الأكسدة في الخلايا المزروعة في الثقافة 12،13. في هذا النهج، ذباب الفاكهة ويتم تغذية 14 ركائز C-رديولبلد الأيض (الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية) في النظام الغذائي لفترة قصيرة (ساعة) أو طويلة (أيام) نبض، طاردت على الطعام الخالي من الملصقات، وبعد ذلك تعرضت ل غرفة تحتوي على هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ورقة مرشح -saturated لمحاصرة الزفير CO 2، والبيكربونات. بيكربونات رديولبلد يمكن قياسها عن طريق عد التلألؤ. الاختلافات في رديولبلد-CO 2 إنتاج بين التجربةقد تعكس مجاميع كتائب من الذباب استخدام أنواع مختلفة من الوقود لإنتاج ATP على مدار فروق سريعة أو الجوهرية طويلة في التمثيل الغذائي الوقود بين التراكيب الوراثية، على سبيل المثال.

البروتوكول

1. إعداد يطير الأغذية التي تحتوي على رديولبلد الاستقلابية ركائز

  1. في أنبوب microfuge، مزيج 1-2 μCi الركيزة رديولبلد (د [6- 14 C] -glucose، د [1- 14 C] -glucose أو [1- 14 C] حامض -palmitic، 40 - 60 MCI / ملمول) مع 15 ميكرولتر FD & C رقم 1 أزرق صبغة الطعام وH 2 O ليعادل إجمالي حجم 25 ميكرولتر.
    تنبيه: الكربون 14 هو بيتا باعث للطاقة المنخفضة ويبلغ مداه قصير في الهواء. ومع ذلك، ورعاية لمنع تسرب جزيئات أو رديولبلد ابتلاع عرضي من قبل المجرب. يطير قارورة الغذاء أكثر من طرف بسهولة. مما لا شك فيه لإيوائهم في وعاء من شأنها منعهم من التحول، وخصوصا عندما radiolabel في شكل سائل (الخطوة 1.2) أو في الغذاء unsolidified (الخطوة 1.4). الذباب التي يتم تغذيتها أو تم تغذيتها ركائز رديولبلد سوف تبدأ في الزفير كميات صغيرة من ثاني أكسيد الكربون رديولبلد 2. يجب أن تبقى هذه الذباب في صناديق الاكريليك في كمة الدخان، وصحن صغير من كوه كاليفورنيان يتم تعيين في مربع لاستخدامها بوصفها الغسيل CO 2.
  2. الماصة كل من الركيزة رديولبلد ومزيج صبغة زرقاء في الجزء السفلي من ذبابة القارورة الغذاء فارغة (الطول: 9.4 سم، العرض: 2.2 سم).
  3. معيار الحرارة يطير الطعام في المايكرويف حتى يتم المسال الطعام فقط (15-20 ثانية في مستوى طاقة عالية لقنينة واحدة تحتوي على 10 مل من المواد الغذائية).
  4. إضافة المواد الغذائية 975 ميكرولتر المنصهر إلى / مزيج صبغة زرقاء رديولبلد الركيزة وبسرعة دوامة والرصد توحيد اللون الأزرق لضمان خلط كاملة.
  5. السماح الطعام لتبرد وتتصلب تماما على RT لمدة 20 - 30 دقيقة.

2. تغذية ركائز رديولبلد الأيضية لالذباب الكبار الفاكهة

  1. تخدير الكبار الذباب باستخدام أجهزة التخدير CO 2 مكون من البولي ايثلين التي يسهل اختراقها تنصهر إلى قاعدة الاكريليك وتوصيلها إلى خزان CO 2 مع منظم ضغط. تدفق CO 2 في جهاز التخدير في 5 لتر / دقيقة.
    1. نقل تخديرد الذباب إلى قارورة تحتوي رديولبلد والغذاء مصبوغة الزرقاء (ن = 15-30 الذباب في القارورة). قارورة كاب مع سدادة رغوة، وراحة أفقيا حتى يستيقظ الذباب فوق. قارورة نقل إلى حاوية الاكريليك بغطاء (180 سم × 180 سم × 240 سم ارتفاع).
  2. بالنسبة للتغذية على المدى القصير، تجويع الذباب لمدة 18 - 24 ساعة قبل نقل الذباب إلى الطعام رديولبلد ل2 - خطوة التغذية 3 ساعات تي انه الجوع خطوة مهمة لأن الذباب تغذية لا يأكل موثوق مصدرا جديدا من المواد الغذائية المقدمة لهم . بالنسبة للتغذية على المدى الطويل على مدى 5-7 أيام، الذباب لا يلزم أن يكون جوعا، ولكن المجرب أن ترصد محتوى الماء من الطعام رديولبلد في قارورة ويعيش الذباب في واستخدام الإبر والمحاقن إلى إضافة الماء إلى قارورة مع الأغذية الجافة.
  3. نقل الذباب في الغذاء الخالي من الملصقات التي كتبها "التنصت" لهم في قارورة جديدة. فترة مطاردة الأولية من 2-4 ساعة يسمح الذباب لتنظيف جزيئات الطعام رديولبلد من البشرة ويسمح هضم radiolabelإد الأغذية المتبقية في الأمعاء. رصد التقدم المحرز الطعام من خلال الأمعاء عن طريق التفتيش البصري من الذباب للبحث عن بطون الزرقاء.
  4. وفي وقت لاحق، ونقل الذباب لأنواع الغذاء المختلفة (12-24 ساعة على الغذاء القياسية أو 1٪ أجار لقياس آثار تغذية مقابل دولة صام على التنفس) أو درجات الحرارة المحيطة (12-96 ساعة عند 18 مئوية أو 30 مئوية لمدة الوراثية التلاعب باستخدام GAL80 حساسة للحرارة (GAL80 نهاية الخبر)، على سبيل المثال).
    ملاحظة: سيكون طول هذه الفترة مطاردة تختلف مع التجربة التي يتم تنفيذها. لمثل مطاردة 96 ساعة على 30 درجة مئوية قد يكون ضروريا في التجارب باستخدام GAL80 نهاية الخبر من أجل تفعيل تماما التعبير التحوير GAL4 التي تعتمد على.

3. إعداد جهاز CO 2 -Collection

  1. تجميع المواد اللازمة لبناء "يطير القرون"، وأنابيب المغطاة شبكة التي سوف تحتوي على الذباب وصفت مع 14 C-الجلوكوز أو 14 حمض البالمتيك وC-ثار ستبقى مفتوحة إلى الغلاف الجوي. قطع رأس 50 ملم 12 ملم × 75 ملم أنابيب البولي بروبلين، وترك 25، أنابيب القاع ذهابا واستمرت ملم. إعداد 35 ملم × 35 ملم الساحات من 130 ميكرون شبكة من النايلون. أيضا، الحصول على الشريط الشفاف في موزع الشريط.
  2. تجميع المواد لأجهزة -collection CO 2. لكل يطير جراب، تجميع 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة، وهو أعلى المطاط سدادة مع ثقب خارج المركز، مركزا جيدا لإدراجها من خلال ثقب في السدادة العليا، الصف GF / B ستوكات الزجاج ورقة فلتر (2.1 سم قطر دائرة، 1 ميكرون المسام). يستخدم GF ورق الترشيح / B بسبب قوة الرطب عالية وقدرة التحميل العالية.
  3. إعداد 5٪ KOH جديدة في يوم من الاستخدام. قبل الخطوة 3.4، أضعاف، ووضع GF / B مرشح ورقة دائرية في وسط جيدا أن ومترابطة من خلال ثقب في أعلى المطاط سدادة وتشبع مع 100 ميكرولتر من 5٪ KOH. انظر الشكل 1.
  4. وبعد الحضانة (ق) على وسائل الإعلام الخالي من الملصقات، وnesthetize الذباب مع CO 2. فرشاة يطير في أنبوب قطع البولي بروبلين، وكأب مع شبكة من النايلون، واستخدام الشريط الشفاف التمسك شبكة لأنبوب. العمل بسرعة لتجنب الذباب الاستيقاظ والهروب قبل شبكة تم اضافته آمن للأنبوب. عدد متساو من الذباب ينبغي أن تستخدم في كل جراب الطيران لإجراء تجربة معينة؛ 10-20 الذباب في جراب ذبابة تنتج ما يكفي من رديولبلد-CO 2 لقياس بواسطة عد التلألؤ (الخطوة 4.1 أدناه).
  5. نقل جراب يطير إلى 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة. تتويج قنينة زجاجية مع المطاط أعلى سدادة يمسك مركز تحتوي أيضا المشبعة KOH ورقة الترشيح GF / B. أضعاف أعلى واسعة من المطاط أعلى سدادة فوق الشفاه من قارورة زجاجية التلألؤ. انظر الشكل 1.
  6. قوارير الزجاج مجموعة تحتوي على الذباب في بغطاء، والحاويات الاكريليك، واحتضان لفترات متفاوتة من الزمن (2-12 ساعة يعمل بشكل جيد).

4. تحليل النتائج

  1. فينهاية الحضانة، وقوارير زجاجية إرفع قبعة، ونقل المشبعة كوه ورق الترشيح GF / B إلى 6 مل البلاستيك التلألؤ قارورة تحتوي على 4 مل التلألؤ كوكتيل.
  2. إذا لزم الأمر، وتجميد الذباب في القرون ذبابة على الثلج الجاف ومخزن في -80 مئوية لتقرير لاحق من ركائز المخزنة. لاحظ أن هذه العينات المشعة ويجب أن يتم تخزينها وفقا لذلك.
  3. إعداد قارورة التلألؤ إضافية: واحدة تحتوي على غير المستخدمة GF / B رقة الترشيح لتكون بمثابة الخلفية و01:59 الآخرين تحتوي على 0،1-0،5 μCi الركيزة رديولبلد لتحديد التدوير / μCi.
  4. قياس التدوير لكل عينة باستخدام عداد التلألؤ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. حساب بمول 14 CO 2 / نسخة في الدقيقة و بمول 14 CO 2 في الطيران في الساعة. طرح نسخة في الدقيقة الخلفية من قيمة التدوير لكل عينة. من البيانات الركيزة رديولبلد أنيق، وحساب التدوير / μCi من عينة لتصحيح الخلفية حساب.
    1. استخدم النشاط معين والتركيز الإشعاعية الركيزة رديولبلد (على سبيل المثال، 50 μCi / مكرومول و 0.1 μCi / ميكرولتر، على التوالي) لحساب بمول / نسخة في الدقيقة قدمت الشركة المصنعة. استخدام هذا العامل لتحويل البيانات جراب يطير تصحيح الخلفية من نسخة في الدقيقة 14 CO 2 / عينة لبمول 14 CO 2 / عينة. ثم القسمة على عدد من الذباب وعدد من ساعة في جراب الطاير.

النتائج

كمية الزفير والمحاصرين CO رديولبلد 2 الذي يتم انتاجه من عملية التمثيل الغذائي للركيزة المشعة يجب أن تتطابق مع عدد من الذباب في جراب ذبابة فضلا عن مقدار الوقت الحيوانات تنفق في جهاز جمع CO 2. لاختبار هذا، تم تغذية الذباب التي تم صام لمدة 18 ساعة حمض البالمتيك رديولبلد (0.02 μCi / ميكرولتر الغذاء) لمدة 2 ساعة ثم اختبار لإنتاج رديولبلد CO 2 في مجموعات من 12 أو 25 الحيوانات لمدة 3 أو 6 حضانات ساعة. وكانت كمية CO 2 التي تنتجها 25 الذباب تقريبا ضعف الكمية المنتجة بنسبة 12 الذباب، وكمية لكل مجموعة تضاعف عندما تمت زيادة فترة حضانة من 3 ساعات إلى 6 ساعات (الشكل 2A). كانت بمول 14 CO 2 / الذبابة / ساعة أي ما يعادل تقريبا في كل مجموعة.

الصوم يحفز انهيار الأحماض الدهنية التي كتبها ss سxidation. لذا CO 2 الإنتاج من أكسدة الأحماض الدهنية يجب أن تكون مرتفعة في الحيوانات صام مقارنة مع الحيوانات التي تتغذى. لتحديد ما إذا كان هذا هو الحال، طلب منهن الصيام لمدة 18 ساعة الذباب التي غذيت على حمض البالمتيك رديولبلد لمدة 2 ساعة. وبعد هذا النبض التغذية قصيرة، تم تقسيم الذباب إلى مجموعتين ونقل إلى الغذاء ذبابة الخالي من الملصقات أو 1٪ أجار لمدة 3 ساعة ثم ينقل ليطير القرون لمدة 2 ساعة. في تجربتين منفصلتين، الذباب مطاردة على أجار تنتج ثاني أكسيد الكربون بشكل ملحوظ أكثر رديولبلد 2 مقارنة مع الذباب مطاردة على الغذاء (الشكل 2B)، مشيرا إلى أن الأكسدة şş تم زيادة في الحيوانات صام.

figure-results-1
الشكل 1. جهاز لجمع الزفير، رديولبلد CO 2.
الذباب الذي قد استهلكت ركائز التمثيل الغذائي رديولبلد هيوضع في "يطير جراب" (FP)، أنبوب قطع أجهزة الطرد المركزي توج مع شبكة (M). يتم وضع جراب يطير الى 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة وتوج مع سدادة مطاطية أعلى (S) التي تحتوي على ثقب خارج المركز، التي من خلالها يتم وضع مركز جيد (CW) الذي يحتوي على GF / B رقة الترشيح المشبعة مع 100 ميكرولتر 5٪ KOH. الزفير CO 2 يتفاعل مع KOH ومحصور على ورقة الترشيح كما بيكربونات. المحاصرين، رديولبلد CO 2 يمكن قياسها كميا بواسطة التلألؤ العد من ورقة الترشيح المشبعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. 14 CO 2 الإنتاج الاقتران مع الوقت وعدد الذباب فيذبابة قرنة ويستجيب لبنك الاحتياطي الفيدرالي والشروط صام.
(أ) بمبلغ 14 CO 2 تنتج في الذباب يتغذى بالميتات رديولبلد يرتبط مع عدد من الذباب اختبار (ن ​​= 12 (الحانات مفتوحة) أو 25 (الحانات مغلقة)) والوقت الذي يقضيه في جراب الطيران (3 أو 6 ساعات ). على أساس لكل الطيران، أنتجت الذباب 0.99، 1.13، 1.10 و 1.01 بمول 14 CO 2 / ساعة (البيانات الواردة في نفس اليسار إلى الترتيب الصحيح عن بيانات الرسم البياني).
(ب) الذباب التي طاردت على أجار أكسدة أكثر بالميتات رديولبلد من الذباب التي طاردت على الغذاء. البيانات هي من تجربتين وذكرت كوسيلة الانحراف المعياري، ن = 16-17 الذباب / مجموعة (التجربة 1)؛ ن = 10 الذباب / مجموعة (تجربة 2). * ع = 0.017، الطالب اختبار t. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس أكسدة ركائز رديولبلد محددة في الكبار ذبابة الفاكهة. هذه التقنية هي واضحة، الكمية، يمكن استنساخه وحساسة، ومكملة لطرق الحالية التي تقيس مجموع CO 2 الإنتاج والاستهلاك O 2 لأنها يمكن أن تستخدم لتحديد المغذيات (ق) التي تتأكسد لإنتاج ATP.

قياس ثاني أكسيد الكربون 2 تتحرر من أكسدة ركائز رديولبلد محددة باستخدام الطريقة الموصوفة هنا هو مكمل لتقنيات قياس مجموع CO 2 الإنتاج. إجمالي CO 2 إنتاج (V CO2) يسمح تقدير معدل الأيض، وعندما يعرف الكلي O 2 استهلاك (V O2)، ويمكن حساب معدل الأيض ومصدر الوقود للأكسدة يمكن أن يقدر على أساس نسبة التبادل التنفسي (V CO2 / V O2 = RER). متىالكربوهيدرات هي الركيزة حصرية، RER = 1، ولكن عندما الأحماض الدهنية هي المصدر الوحيد، RER = 0.7، نظرا للرياضيات الكيمياء من ردود فعل الجلوكوز وأكسدة الدهون. في حالة عدم وجود معدات لقياس استهلاك الأوكسجين في ذبابة الفاكهة 14، لا يمكن تحديد مصدر وقود الأكسدة. ومع ذلك، من خلال وضع العلامات الذباب مع كميات ضئيلة من الركيزة المشعة أو بأخرى ومعدلات قياس رديولبلد إنتاج CO 2، يمكن للمرء استخلاص استنتاجات حول قدرة الذباب على أكسدة ركيزة بالنظر في نقاط زمنية مختلفة خلال التحفيز أو عن آثار نظرا طفرة على أكسدة الوقود.

وهناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا، ينبغي توخي الحذر عند استخدام المواد المشعة لتجنب تسرب وتلوث من المجالات البحثية. ثانيا، عندما التخدير الذباب خلال الخطوات 2.1 و 3.4، يجب المجرب العمل بسرعة لتجنب الآثار من ثاني أكسيد الكربون لفترة طويلة 2تعرض على عملية التمثيل الغذائي والسلوك. مجموعة من 20 الذباب يمكن تخدير ونقل إلى قارورة جديدة أو في جراب ذبابة في 20 ثانية أو أقل. عند نقلها من جهاز التخدير إلى قارورة الغذاء، يجب أن استراح في قارورة من جانبها لمنع الذباب تخدير من أن يعلقوا على سطح الطعام. عندما الذباب هي الغذاء رديولبلد بتغذية على مدى عدة أيام كما في الخطوة 2.2، يجب المجرب تأكد من أن الغذاء لا تجف كما الذباب حساسة للجفاف.

بنك الاحتياطي الفيدرالي أو الدولة صام قبل وضع العلامات، واختيار التسمية، وطول الوقت وضع العلامات، وطول الوقت في جراب الطاير، وطريقة التخدير والمعلمات التي يمكن أن تتعرض لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديل عند استخدام هذه التقنية. أولا، الذباب تعرض لفترات وضع العلامات قصيرة (2-3 ساعة) من غير المرجح أن تستهلك كميات كبيرة من المواد الغذائية رديولبلد إلا إذا تعرض لفترة الصيام مسبقا. الثاني، واختيار التسمية جوتؤثر على استنتاجات واحد قادر على رسم حول الظواهر الأيضية. على سبيل المثال، رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [1- 14 C] -glucose يمكن أن تعكس الأكسدة من خلال دورة حمض الستريك أو تحويلة الفوسفات البنتوز، في حين رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [6- 14 C] -glucose يعكس الأكسدة خلال دورة حمض الستريك فقط 12،15،16. أن تغذية الذباب مع التتبع رديولبلد لمن الأحماض الأمينية الأساسية 17،18 تكون الإستراتيجية الجيدة لتقييم أكسدة الأحماض الأمينية المستمدة من البروتينات. وأخيرا، وفترات وضع العلامات مطولة مع الجلوكوز رديولبلد تثير أيضا إمكانية إدراج هذه السلائف إلى فئات أخرى من الجزيئات مثل الدهون الثلاثية 19 والأحماض الأمينية مثل ألانين، التي interconverts بسهولة مع البيروفات. ويمكن تقييم ذلك من خلال قياس النشاط الإشعاعي تدمج في هذه فئات مختلفة من الجزيئات 6. راد في الواقع، الأفواج منفصلة من الذباب يمكن تغذيةiolabeled ركائز بنفس الطريقة وتستخدم بعد ذلك لإجراء التجارب جراب ذبابة أو قياس radiolabel التي يتم تخزينها ويبقى في الجليكوجين والدهون الثلاثية في تغذية وصام الظروف 6، على سبيل المثال. استراتيجية أخرى هي استخدام فترات قصيرة وضع العلامات التي من المرجح أن تكشف أكسدة المواد الغذائية الغذائية رديولبلد أنفسهم وليس أشكال تخزين هذه المواد المغذية. ثالثا، من الممكن أيضا أن مجموعتين من الذباب يمكن أن يكون معدلات مماثلة من 14 CO 2 إنتاج أكثر من كمية معينة من الوقت، ولكن بنسب مختلفة جدا في البداية. لذلك، تفاوت مقدار الوقت الذي يتجه قضاء في جراب الطيران قد يكون معيارا هاما لتغيير عند تقييم التباين المظهري. وأخيرا، يدعو هذا البروتوكول للاستخدام خلال فترة قصيرة من CO 2 التخدير عند وضع الذباب في الجهاز جراب الطاير. ومن الممكن أن التخدير CO 2 قد تؤثر على وظيفة التمثيل الغذائي على مدى التجربة جراب الطاير. وعلى البديلpproach هو استخدام التخدير النيتروجين الذي لا يؤثر على معدل الأيض (20).

كما هو الحال مع أي أسلوب الذي يقيس مثل هذا النظام المعقد كما أكسدة الوقود ومعدل الأيض، وطريقة وصفها هنا له حدود. أولا، فمن الممكن أن تسير في مجموعات مختلفة يمكن أن تستهلك كميات مختلفة من المواد الغذائية رديولبلد وبالتالي ستدخل مرحلة جمع CO 2 للمقايسة مع كميات مختلفة بدءا من الركيزة. هذا ويمكن للرقابة لإلى حد ما عن طريق إجراء التجربة على عينات كبيرة الحجم وعن طريق تغذية الذباب بشكل جماعي. لفترات قصيرة وضع العلامات، والذباب مع الشجاعة مماثلة أزرق اللون سيكون قد استهلك radiolabel ويمكن ان يتم تطويرها إلى الجزء مطاردة من التجربة. كما يمكن قياس كمية radiolabel المتبقية في مجموعة من الذباب في نهاية التجربة وفي الأفواج منفصلة من الذباب بعد نهاية التغذية وفترة مطاردة الأولية. الثانية، ومستويات النشاط بينقد تختلف مجموعات من الذباب في القرون الطاير. وهذا يجب أن يكون تجريبيا وأخذها في الاعتبار عند تفسير البيانات. ثالثا، هذه التقنية لا يقيس إجمالي CO 2 الإنتاج، والإنتاج فقط من المغذيات غذائية معينة أو شكل التخزين (ق) من تلك المواد الغذائية. هذا البروتوكول ليست بديلا للبل هو مكمل لقياسات VCO 2 لأنه يوفر معلومات مختلفة وإضافية.

الطريقة الموصوفة هنا يقيس الزفير، CO رديولبلد 2 الذي هو نتاج أكسدة كميات ضئيلة من ركائز المحددة للتمثيل الغذائي. من خلال تغيير التسمية المستخدمة - الجلوكوز، والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية - يمكن للمرء أن تصميم تجارب متطورة على نحو متزايد لتقييم المساهمات من ركائز مختلفة لعملية التمثيل الغذائي في ظل الظروف الفسيولوجية المختلفة مثل الجوع وعلى خلفيات وراثية مختلفة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قياس metabolisم في مراحل اليرقات والعذارى للتنمية، واثنين من مراحل دورة حياة ذبابة الفاكهة التي تتميز بها اقصى تخزين المواد الغذائية وانهيار، على التوالي.

الإفصاحات

يعلن صاحب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلف الدكتورين Mingjian Lu و Morris Birnbaum على المشورة المفيدة ودعم التمويل من NIDDK (R21DK089391).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض البالمتيك ، [1-14 درجة مئوية] - ، 50 وميكرو ؛ CiPerkinElmerNEC075H050UC
الجلوكوز ، D- [6-14C] - ، 50 & CiPerkinElmerNEC045X050UC
الجلوكوز ، D- [1-14C] - ، 50 & micro ؛ CiPerkinElmerNEC043X050UC
ذبابة الفاكهة قارورة ، ضيقة ، البوليسترينجينيسي Scientific32-116
أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع ، 12 × 75 ممفيشر ساينتفيك14-959AA
شبكة ، نايلون نيتكس ، 120 وميكرو ؛ مجينيسي Scientific57-102
20 مل قوارير زجاجية من البورسليكاتفيشر ساينتفيك03-337-15
سدادة علوية للقارورة مع ثقب خارج المركزفيشر ساينتفيكK882310-0000
بئر مركز البولي بروبلينفيشر ساينتفيكK882320-0000
ورق ترشيح زجاجي من الألياف الدقيقة Whatman GF / B ، دائرة ، قطر2.1 سمفيشر ساينتفيك09-874-20
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273
6 مل قوارير تلألؤ مع أغطية دفع / ملتوية التشخيصالوطنيSVC-06

المراجع

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
  4. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  5. Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  6. Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
  7. Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
  8. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
  9. Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
  10. Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681(2014).
  11. Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
  12. Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
  13. Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
  14. Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
  15. Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
  16. Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
  17. Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  18. Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
  19. Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
  20. Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

14 14
قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.