تشكيل عملاق الحجم Polymersomes عن طريق الإماهة بمساعدة جل

ملخص

نقدم بروتوكولا لتشكيل حويصلات بوليمر عملاقة بسرعة (pGVs). باختصار ، يتم تجفيف محاليل البوليمر على أغشية الاغاروز المجففة الملتصقة بالغطاء. يؤدي ترطيب أغشية البوليمر إلى تكوين سريع ل pGVs. تعمل هذه الطريقة على تطوير كبير في إعداد الحويصلات العملاقة الاصطناعية للتطبيقات المباشرة في دراسات المحاكاة الحيوية.

الملخص

يتم استكشاف حويصلات البوليمر < p class = 'jove_content'> على نطاق واسع كنظائر اصطناعية للحويصلات الدهنية بناء على استقرارها ومتانتها وخصائص الحاجز وتعدد استخداماتها الكيميائية وخصائصها الفيزيائية القابلة للضبط. ومع ذلك ، فإن الطرق النموذجية المستخدمة لتحضير حويصلات عملاقة الحجم (> 4 ميكرومتر) تتطلب وقتا طويلا وعمالة ، مما ينتج عنه أعداد منخفضة من البوليمرات السليمة. هنا ، نقدم لأول مرة استخدام الإماهة بمساعدة الهلام للتكوين السريع وعالي الغلة لحويصلات البوليمر العملاقة (>4 ميكرومتر) (البوليميرسومات). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تكوين البوليمرات من مجموعة واسعة من محاليل الإماهة بما في ذلك العديد من المخازن المؤقتة المختلفة المتوافقة مع الفسيولوجيا ووسائط زراعة الخلايا الكاملة ، مما يجعلها مفيدة بسهولة لدراسات تقليد الطبيعة الحيوية. هذه التقنية قادرة أيضا على إنتاج البوليمرات بشكل موثوق من تركيبات البوليمر المختلفة مع عوائد أفضل بكثير وصعوبة أقل بكثير من الطرق التقليدية. يمكن ضبط حجم البوليمر بسهولة عن طريق تغيير درجة الحرارة أثناء الجفاف أو إضافة مميعات الغشاء إلى غشاء البوليمر ، مما ينتج عنه بوليمرات عملاقة الحجم (>100 ميكرومتر).

المقدمة

إنشاء خلية الحجم، الحويصلات unilamellar العملاقة الاصطناعية (GUVs) هو من اهتمام متزايد في إعادة الإعمار في المختبر من العمليات الخلوية المختلفة لبناء إطار للجيل لتشبه الخلايا النظام ^1،2 الاصطناعي. في حين GUVs تتألف من الأغشية الدهنية هي يقلد ممتازة من الأغشية الطبيعية والبيولوجية، فهي غير مستقرة ضد التقلبات البيئية والحصول على حياة الرف قصيرة نسبيا. بسبب هذه القيود، وقد استخدمت بوليمرات كتلة محبة للجهتين كما يقلد الدهون لتكوين الحويصلات البوليمر، أو polymersomes. وفي هذا السياق، polymersomes هي مفيدة في تطوير نظم الخلايا الجزيئية الحيوية بسبب زيادة استقرارها ³ والكيميائية تعدد ^4،5 والصفات الفيزيائية للتعديل ^6-8.

الأساليب الحالية لتشكيل تشمل polymersomes عملاق الحجم electroformation ⁹ و قالب الإماهة ^10، وكلاهما ثهيك هي مضيعة للوقت، معدات كثيفة العمالة، تتطلب المتخصصة وإنتاج محاصيل منخفضة من polymersomes العملاقة سليمة. وقد وضعت وبمساعدة هلام بسيط طريقة معالجة الجفاف مؤخرا لإنتاج GUVs الدهون ^11. هنا، نحن تصف تطويع تقنية الإماهة بمساعدة هلام لخلق polymersomes العملاقة مع اختلاف التراكيب البوليمر، حجم تسيطر عليها، وفي مختلف التراكيب العازلة.

لفترة وجيزة، والمجففة 1٪ ث / ت هلام الحمض النووي الأفلام الكهربائي الاغاروز القياسية على ساترة الزجاج. ثم تنتشر حلول البوليمر أعدت في الكلوروفورم عبر فيلم الاغاروز المجففة والسماح للتتبخر. بعد إزالة المذيب كاملة، وممهى الأفلام البلاستيكية في المنطقة العازلة في الاختيار مع التدفئة معتدلة (40-70 درجة مئوية) والعملاق (> 4 ميكرون) تتشكل polymersomes الحجم في غضون 30 دقيقة. هذه الطريقة تنتج بسرعة مئات سليمة تماما، polymersomes بشكل جيد باستخدام معدات المختبرات القياسية وreagenنهاية الخبر بأقل التكاليف.

تتشكل الشكل 1. تخطيطي تصور طريقة معالجة الجفاف بمساعدة هلام. polymersomes العملاق يتكون من مجموعة من البوليمرات diblock بعد ~ 30 دقيقة من الإماهة. يرمز كتلة ماء في أرجواني ويرمز كتلة مسعور باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول

1. البوليمرات وإعداد الاغاروز

ملاحظة: قفازات ومعطف المختبر يجب أن ترتديه في أي وقت خلال هذا البروتوكول. مطلوبة نظارات السلامة أيضا خلال العمل مع أي المذيبات العضوية أو أي خطوة مع إمكانية الرش.

1. إعداد 5 ملغ حل / مل من البوليمر في الكلوروفورم. إضافة 1 مل من الكلوروفورم إلى 5 ملغ من بولي الصلبة (أكسيد الاثيلين) - بولي ب- (بوتادين) (بيو-PBD، EO ₂₂ -BD ₃₇₎ من البوليمرات diblock في قارورة زجاجية ودوامة لإذابة تماما. تنفيذ كافة الخطوات باستخدام الكلوروفورم في غطاء الدخان الكيميائية.
2. خلط في الدهون fluorescently المسمى (شراؤها حلت بالفعل في الكلوروفورم) في 0.5 مول التركيز النهائي٪ في 99.5 مول٪ البوليمر الخالي من الملصقات.
   1. على سبيل المثال، ماصة ~ 12 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الدهون fluorescently المسمى في الكلوروفورم إلى 997.58 ميكرولتر بيو-PBD، EO ₂₂ -BD ₃₇ البوليمر في الكلوروفورم (مع الوزن الجزيئي 2950 دالتون) لتركيز النهائي من 0.5 مول٪ دهن وصفت مختلطة و 99.5 مول٪ البوليمر.
   2. حل تخزين في قارورة محكمة الإغلاق مع غطاء مقاوم للالكلوروفورم في -20 درجة مئوية. التفاف السباكين الشريط على حافة قنينة فيها مسامير غطاء على قارورة وتأمين غطاء على القارورة. لف قطعة أخرى من الشريط السباكين على السطح الخارجي للغطاء، وأخيرا التفاف بارافيلم في الخارج من الشريط لضمان الحد الأدنى من التبخر.
3. جعل 1٪ ث / ت حل الاغاروز عن طريق خلط 0.5 ملغ الاغاروز القياسية في 50 مل من الماء (أو 50 مل 100 ملي السكروز) في قارورة 250 مل مخروطي. تغلي الحل الاغاروز في الميكروويف القياسي ل~ 1 دقيقة (أو حتى بشكل كامل المنحل كما لوحظ من قبل المقاصة من الحل).
   ملاحظة: الحل الاغاروز يمكن استخدامه بعد بضع دقائق من تبريد أو يسمح لترسيخ وتخزينها وإعادة صهرها باستخدام نفس الإجراء.

2. إعداد الاغاروز السينمائي

1. قطع في نهاية الخروج من 1000 ميكرولتر ماصة لمنع انسداد. باستخدام قطع طرف، ماصة 300 ميكرولتر من الحل الاغاروز ذاب على 25 ملم ساترة الزجاج مربع مباشرة من الشركة المصنعة.
2. السماح للالاغاروز لتبرد إلى ~ 65-75 درجة مئوية قبل ترسب. إذا كان الاغاروز هو بارد جدا، وسوف تبدأ لتتجمع على السطح خلال عملية الانتشار. على العكس من ذلك، إذا كان الاغاروز حار جدا، وسوف تتطلب أكثر تنتشر في التمسك الاغاروز إلى السطح.
3. مجرد عقد حافة ساترة مع أصابع القفاز واستخدام حافة طويلة من 1000 ميكرولتر ماصة أخرى لنشر الاغاروز بالتساوي على سطح ساترة. نقل معلومات سرية ماصة ذهابا وإيابا عبر ساترة حتى تلتزم تماما agarose لويغطي ساترة.
4. ضع ساترة المغلفة الاغاروز على قطعة من بارافيلم مع الاغاروز مواجهة. مرة واحدة والمغلفة العدد المرغوب فيه من coverslips، ضع بارافيلم مع لل coverslips إلى 37 درجة مئوية الحاضنة ليذوى الاغاروز على سطح لا يقل عن 1 ساعة.
   ملاحظة: الجفافيتم تحديدها من قبل اختفاء طبقة واضحة من الاغاروز. ساترة ينبغي أن ننظر شقة واضح. وبمجرد أن الأفلام هي المجففة تماما، وتخزين coverslips مع سطح الاغاروز مواجها لها في البلاستيك القابل للتصرف طبق بتري.

تشكيل 3. بوليمر السينمائي

1. ماصة 30 ميكرولتر أعدت حل البوليمر على الفيلم الاغاروز.
2. مجرد عقد حافة ساترة مع أصابع القفاز واستخدام حافة طويلة من إبرة 18 G لنشر الحل عبر الأفلام الأغاروس باستخدام حركة دائرية نشر. مواصلة نشر حتى يبخر حل.
   ملاحظة: كن حذرا من نهاية حادة من الإبرة.
3. وضع الأفلام البلاستيكية في البلاستيك طبق بيتري الجانب البوليمر مواجهة ووضع طبق بتري في مجفف فراغ المنزل القياسية مغطاة بورق الألومنيوم (لمنع photobleaching من من الدهون المسمى) لمدة 1 ساعة على الأقل لإزالة تماما أي مذيب المتبقية.

4. تشكيل بولymersomes

1. الالتزام وcoverwell، إما ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان الصنع (PDMS) جيد (ل~ 0.5 سم كتلة سميكة من PDMS شفي مع ~ 1 سم القطر من منتصف لكمات الخروج) أو متوفرة تجاريا جيدا إلى ساترة المغلفة مع فيلم البوليمر. اضغط على coverwell بلطف على ساترة المغلفة البوليمر مع البوليمر التي تواجه حتى يتم تشكيل ختم ضيق بين coverwell وساترة. يجب الحرص على عدم الضغط من الصعب جدا وكسر ساترة.
2. إضافة 200-500 حل الإماهة ميكرولتر (الماء على ما يرام، ولكن مجموعة من المخازن أو سائل الإعلام يعمل أيضا) إلى غرفة (حجم الإماهة يتوقف على حجم coverwell الالتزام).
3. إنشاء غرفة الرطوبة لتقليل التبخر من الحل الإماهة. وضع، Kimwipe الرطب توالت على طول حواف الزجاج طبق بيتري. وضع فيلم البوليمر مع coverwell الالتزام في غرفة الرطوبة، وتغطي مع غطاء. تغطية طبق بتري مع رقائق الألومنيوم لتقليل photobleaching من. مكانطبق بيتري على طبق ساخن تعيين إلى 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
4. ضبط درجة حرارة صفيحة ساخنة أثناء الإماهة 24-70 درجة مئوية لضبط حجم الحويصلات شكلت (الشكل 5). 70 ° C بالقرب من T _م من الاغاروز لذا يجب توخي الحذر عند الشروع أبعد درجة الحرارة هذه.

5. توصيف Polymersomes بواسطة الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP)

1. نقل ساترة مع الالتزام coverwell مباشرة إلى مجهر مقلوب للتصوير.
2. اختيار مجموعة مرشح المناسب استنادا إلى المادة الدهنية الفلورسنت المدرجة في حل البوليمر. لنسبة الدهون في المسمى الرودامين مخدر في محاليل البوليمرات، واستخدام 560/25 نانومتر تصفية الإثارة ومرشح 607/36 نانومتر الانبعاثات، أو مجموعات مرشح للمقارنة.
3. استخدام هدف النفط 100X للتركيز على السطح العلوي للساترة حيث سيتم التقيد polymersomes. إذا كان polymersomes هي خاصةكبيرة (> 20 ميكرون) أو إذا كان الفيلم البوليمر سميكا جدا، هدف خفض استهلاك الطاقة (على سبيل المثال، 40X) ينبغي أن تستخدم لتصور أفضل للpolymersomes.
4. تحديد polymersomes باستخدام المجهر مضان. تحديد polymersomes من قبل جوفاء، حويصلة كروية مميزة مع قطر> 5 ميكرون.
5. تميز غشاء سيولة باستخدام الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) على المجهر مضان تحتوي على مكثف قابل للتعديل. ونظرا لطبيعة ملتصقة والتعبئة ضيق من polymersomes على ركائز والحركة الطبيعية للpolymersomes محدودة، وزيادة جودة FRAP التصوير.
   1. تركيز المجهر على polymersome من الفائدة. إغلاق مكثف لمنطقة صغيرة وضمان حافة polymersome هي داخل المنطقة التصوير من الفائدة.
   2. زيادة التعرض الكاميرا والتأكد من إزالة جميع المرشحات كثافة محايدة لphotobleach فعال في المنطقة من الفائدة. السماح للغشاء فلوريدا uorescence كثافة لphotobleach لمدة 30-60 ثانية أو حتى كثافة مضان وانخفضت بشكل ملحوظ.
   3. أطفئ مصباحك وفتح بالكامل المكثف. تقليل التعرض إلى الإعدادات البداية وتبدأ على الفور التقاط الصور كل 30 ثانية لمدة 3 دقائق.
   4. حساب معاملات نشر غشاء باستخدام الطرق القياسية ^12. إذا تستعيد المنطقة المبيضة كثافة مضان داخل دقيقة 3-5، وهذا يدل على أن الغشاء السائل.

6. توصيف Polymersome الحجم

الرقم 6. عملية لتحليل حجم polymersomes باستخدام برامج التصوير. إرشادات حول كيفية قياس قطر الحويصلات شكلت خطوة بخطوة. يجب على المستخدم معرفة حدات معايرة بالبكسل / ميكرون من الاداة المستخدمة.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. فتح الصور المكتسبة للpolymersomes في صورة برامج التحليل ^13.
2. تعيين المقياس للصورة عن طريق النقر على مربع تحليل المنسدلة والنقر على "نطاق مجموعة".
   1. معايرة مقياس لالمجهر باستخدام الطرق القياسية (أي ميكرومتر).
   2. سد في وحدات معايرة وانقر على زر "موافق".
3. انقر على مربع أداة خط ورسم خط يمتد من قطر الحويصلة.
4. جمع القياسات طول طريق النقر على مربع تحليل المنسدلة والنقر على "التدبير".
5. مواصلة قياس الحويصلات الفردية التالية الإجراء أعلاه وستضاف إلى إطار قياسات البيانات كل قياس جديد.
6. اضغط على "السيطرة + دال" بعد تعادله كل سطر وقياس طول بصمة الخط الذي رسمته علىصورة مما يجعل من الاسهل لتتبع التي تم تحليلها الحويصلات.

النتائج

تشكلت Polymersomes باستخدام الإجراء المبين أعلاه (الشكل 1)، ومعدات المختبرات المشتركة هو مبين في الشكل (2). وقد ممهى Polymersomes مع الماء منزوع الأيونات (الشكل 3) وتصويرها على مجهر مقلوب في epifluorescence باستخدام الهدف النفط 100X. لاحظ أنه إذا polymersomes تكون غير مرئية، لأنها قد شكلت في أحجام كبيرة جدا لالتقاط مع هدف النفط 100X. قد تحتاج إلى هدف خفض استهلاك الطاقة لاستخدامها بدلا من ذلك. واحدة من مزايا استخدام الإماهة بمساعدة هلام هو براعة تشكيل polymersomes في مجموعة متنوعة من حلول معالجة الجفاف. تشكلت Polymersomes بنجاح في الماء منزوع الأيونات، وهي الثدييات المتوسطة خلية ثقافة كاملة، حلول السكروز واثنين من المحاليل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو مخزنة تريس المالحة (TBS))، كما هو مبين في الشكل (4). وفي ظل الظروف القياسية (الإماهةمع الماء عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة)، تم العثور على أكثر من 70 ~ polymersomes عادة مع كل 40 × 40 ميكرون ² مجال الرؤية. في حين أن إنتاج سطح polymersomes ليست متجانسة، وهناك العشرات من الحقول نظر مع هذا العائد تمثيلا. وعلاوة على ذلك، كانت polymersomes مستقرة في حل لا يقل عن 24 ساعة.

تم ضبطها حجم Polymersomes بسهولة عن طريق المضادة للجفاف والأفلام البلاستيكية في درجات حرارة متفاوتة. كان Polymersomes شكلت في الماء منزوع الأيونات في RT متوسط ​​قطرها من 2.9 ± 0.7 ميكرون. كما يزيد من درجة الحرارة أثناء الإماهة، وبلغ متوسط ​​حجم polymersomes يزيد أيضا (الجدول 1). في درجات حرارة عالية (> 60 درجة مئوية)، polymersomes شكلت مع أحجام حتى أكبر من 100 ميكرون (الشكل 5).

تم الانتهاء من تجهيز جميع الصور باستخدام مفتوحة المصدر برامج التصوير (الشكل 6).تم فتح الصور التي تم جمعها في البرنامج. وقد دخلت حجم بكسل معايرة إلى فك الحجم. باستخدام أداة الخط، ورسم خطوط عبر الأقطار. بعد رسم كل خط الفردية، وقد تم قياس طول معايرة وتضاف إلى مربع النتائج. ويمكن بعد ذلك تآمر البيانات في البرنامج الرياضي لاختيار (على سبيل المثال، إكسل، بريزم، المنشأ، الخ)

. الشكل 2. صورة من مختبر المواد المشتركة وغير مكلفة اللازمة لتشكيل polymersomes البنود المطلوبة هي: بارافيلم، وهو 18.5 G إبرة، البوليمر في الكلوروفورم أو غيرها من المذيبات مناسب، 1000 ميكرولتر ماصة، قارورة مخروطي، ملاقط، الاغاروز، 25 ملم coverslips مربع، PDMS الآبار التصوير والزجاج طبق بيتري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ينتشر الشكل 3. صور من طريقة معالجة الجفاف بمساعدة هلام. الذائب الاغاروز على ساترة مربع 25 ملم حتى حتى المعاطف فيلم ساترة بأكملها. ثم يتم وضع Coverslips إلى 37 درجة مئوية الحاضنة والفيلم هو المجففة. وتودع حل البوليمر على الفيلم الاغاروز المجففة وتنتشر باستخدام إبرة في حركة دائرية. ساترة ثم يتم وضع في O مجفف / N لتتبخر تماما أي بقايا المذيبات. وأخيرا، والالتزام غرفة التصوير لالركيزة وممهى البوليمرات مع الحل المفضل ووضعها في طبق بيتري عند 40 درجة مئوية لمدة لا يقل عن 25 دقيقة للسماح لتشكيل polymersomes. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

>

يمكن الشكل 4. Polymersomes تشكل في مجموعة متنوعة من مخازن مختلفة. وقد ممهى بيو-PBD الأفلام البلاستيكية مع العازلة المحددة عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. زيادة درجة الحرارة أثناء الإماهة يزيد من حجم polymersomes. صور epifluorescence التمثيلية للpolymersomes شكلت في الماء عند درجات حرارة الإماهة المشار إليها. زيادة درجة الحرارة في النتائج polymersomes أكبر. شريط النطاق = 10 ميكرون._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

درجة الحرارة (° C)	متوسط ​​الحجم (ميكرون)
24	2.93 ± 0.7
40	5.76 ± 2.5
50	6.65 ± 2.4
60	11.46 ± 5.8
70	14.04 ± 7.0

الجدول 1. زيادة درجة الحرارة خلال نتائج الإماهة في زيادة حجم polymersome. متوسط ​​بأقطار لأكثر من 100 polymersomes في المياه في حسبت مختلفة حالة درجة الحرارة وصورت هنا. الخطأ هو الانحراف المعياري.

المناقشة

أصبحوا استكشافها على نطاق واسع Polymersomes كما يقلد غشاء البيولوجية. خصائص قوية وتنوعا من البوليمرات جعلها جذابة على نطاق واسع للدراسات التي تتطلب functionalization الغشاء، طول العمر والقدرة على الاستجابة ضبطها. الطرق التقليدية لتشكيل polymersomes عملاق الحجم ^9،10 (> 4 ميكرون) هي كثيفة العمالة وتتطلب معدات باهظة الثمن والمتخصصة. هنا، نقدم لأول مرة، وهي طريقة سريعة ومرنة وقوية لتشكيل polymersomes الحجم العملاق باستخدام معيار الكواشف المخبرية غير مكلفة والمعدات.

استخدام الإماهة بمساعدة هلام، polymersomes unilamellar يمكن تشكيلها بسرعة (<30 دقيقة)، في مجموعة متنوعة من حلول الإماهة (بما في ذلك وسائل الإعلام ثقافة الخلية) ومع مجموعة متنوعة من البوليمرات المختلفة (لا تظهر البيانات). لم يكن لوحظ تشكيل الحويصلات الصفاحات أو غير المتماثلة باستخدام هذه التقنية. طوال هذا العمل، كنا بولي (أكسيد الاثيلين) - بولي ب- (البيوتاديين) (بيو-PBD، EO ₂₂ -BD ₃₇₎ محايدة diblock من البوليمرات. العديد من المؤلفات البوليمر مختلفة (بما في ذلك بوليمرات diblock مشحونة) تعمل بشكل جيد باستخدام هذه الطريقة (لا يظهر). ومع ذلك، بعض بوليمرات triblock المتاحة تجاريا وارتفاع الجزيئية بوليمرات الوزن diblock (~> 5000 دالتون) لا تشكل polymersomes متميزة. لجميع من التجارب في هذا المخطوط، وقد مخدر على تركيز منخفض من الدهن المسمى في محاليل البوليمرات لأغراض التصور فقط. ويمكن أيضا أساليب أخرى لتصور، بما في ذلك البوليمرات functionalized مباشرة مع صبغة الفلورسنت يمكن استخدامها. يمكن أيضا Polymersomes يمكن تصوير مع المجهر مشرق الميدان، على الرغم من المجهري مضان توفر قدرا أكبر من القرار.

معظم التعديلات الطفيفة على بروتوكول عادة لا تغير النتائج. على سبيل المثال، الفروق الصغيرة في تركيز المحلول البوليمر نشر على لل coverslips لا تغير من تشكيل البوليمر وILM تشكيلها. في حين لم يحدد مدى التركيز الكامل، وتشكيل polymersome تحدث بنجاح مع طائفة واسعة من تركيزات فيلم البوليمر (على سبيل المثال، 1-10 ملغ / مل). ومع ذلك، هناك بعض التعديلات البروتوكول الذي لا يؤثر سلبا على تشكيل polymersome. أبرزها هو أن coverslips الزجاج الجولة (بدلا من مربع) نتيجة في تشكيل سيئة للغاية من polymersomes. ونحن نعزو ذلك إلى معطف حتى للغاية من الاغاروز على الزجاج مما يعيق فعلا تشكيل polymersomes.

واحدة من أبرز التحديات لهذه التقنية هو القدرة على استرداد polymersomes من السطح مع ارتفاع العائد. وهناك بعض الحالات التي إزالة polymersomes من السطح الأصلي يمكن أن يكون مفيدا. ويرجع ذلك إلى ارتفاع مضان خلفية من فيلم البوليمر المجففة، وإزالة polymersomes الفرد والانضمام لهم لتنظيف coverslips وزيادة جودة التصوير وتوصيف (حزبcularly خلال تحليل FRAP). للقيام بذلك، pipetting لطيف مع طرف ماصة التي تم خفض نهاية قبالة سوف يلتفظ وpolymersomes من على سطح الأرض (على الرغم من أن عدد الحويصلات تعافى هو أقل بكثير من تلك التي تكونت في الأصل). ويمكن بعد ذلك Polymersomes توضع على الأسطح ساترة تعديل، والسماح للpolymersome للتفاعل مع ساترة جديدة. عادة، على الحياد polymersomes بيو-PBD، coverslips تعامل مع الأوزون لمدة 15 دقيقة تسمح polymersomes لتسقط على السطح للتصوير. مطلوب تعديل سطح مختلفة للتركيبات polymersome مختلفة (على سبيل المثال، سلبا أو إيجابا اتهم البوليمرات).

معظم المواد المستخدمة في هذا البروتوكول بنجاح تخزينها واستخدامها لعدة أيام إلى أسابيع. والاغاروز طدت يمكن reboiled وإعادة استخدامها حتى يبدأ الاغاروز أن يكون الركام حتى بعد الغليان، أو الاغاروز طدت يبدأ لتجف. Coverslips مع الأفلام الأغاروس المجففة ويمكن تخزين واستخدامد إلى أجل غير مسمى (على سبيل المثال، أشهر). البوليمر يذوب في الكلوروفورم ويمكن تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أشهر. مرة واحدة يتم تجفيفها فيلم البوليمر على الأفلام الأغاروس، ومع ذلك، تحتاج الأفلام ليتم تخزينها في ظل فراغ المنزل واستخدامها في غضون أسبوعين (لم يتحدد التخزين على المدى الطويل بشكل مباشر، ولكن هناك اختلافات ملحوظة في polymersomes تشكلت من الأفلام البلاستيكية ومضى عليها أكثر من اثنين أسابيع).

باستخدام بروتوكول الإماهة بمساعدة هلام المعروضة هنا، تتشكل مئات polymersomes شكل موحد-بسرعة مع مجرد بضع ساعات من العمل باستخدام المعدات القياسية والكواشف المخبرية وغير مكلفة. وعلاوة على ذلك، polymersomes يمكن تشكيلها في مجموعة متنوعة من المحاليل الفيزيولوجية ومن المؤلفات البوليمر مختلفة (لا يظهر). تغيرات طفيفة على طريقة لا يغير سلبا على تشكيل polymersomes، مما يجعل بمساعدة هلام الإماهة تقنية متعددة ومتاحة للعلماء متفاوتة البريد الفنيxpertise.

القدرة على خلق بسهولة polymersomes العملاقة على نطاق وحجم الخلايا ضرورية لبناء نظم تشبه الخلايا الاصطناعية. سهولة الاستخدام وتعدد الإماهة بمساعدة هلام لجعل هذه polymersomes تقدم تقدما كبيرا في مجال بيوميمتيك لإنشاء يقلد غشاء الخلية قوية. على سبيل المثال، باستخدام هذه التقنية، واستراتيجيات لتغليف مكونات الخلايا المختلفة، functionalization من البوليمر مع بروتينات غشاء الخلية وإدراج البروتينات النقل غشاء، على سبيل المثال لا الحصر، يمكن أن تكون مصممة لبناء خلايا اصطناعية على أساس polymersome.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
125 مل قارورة إرلينماير	VWR	89000-360
18 إبرة قياس	VWR	BD-305196
25 مم غطاء مربع	VWR	48366-089
Agarose	Sigma	A9539	agarose قياسي للرحلان الكهربائي لهلام الحمض
النووي الكلوروفورم	سيجما	288306-2L
تجاري	علوم المجهر الإلكتروني	70336	عوازل السيليكون بالضغط على الختم
تحليل الصور في فيجي	تحميل		مجاني: http://fiji.sc/Fiji
قارورة زجاجية بغطاء تفلون	VWR	66009-556	1.9 مل ، علبة 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 مجم من الدهون بتركيز 1 مجم / مل في الكلوروفورم
Parafilm	VWR	52858-000	10.2 سم × 38.1 م
بولي (أكسيد الإيثيلين) -b-poly (بوتادين) أو PEO-PBD (بوزن جزيئي 2,940)	البوليمر	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf< / a>
طبق بتري باستيك	VWR	25384-092
شريط تفلون	VWR	300001-057	1/2 "العرض