يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم خيط عضلي كاليفورنيا

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54057

⸱

أغسطس 1, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 2Yan Bian University Hospital, 3Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الورقة بروتوكولا يقيم التغيرات في حساسية الشعيرات العضلية Ca2+ أثناء الانقباض في الخلايا العضلية القلبية المعزولة من قلب الفئران. جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية للقلب ، ومستويات العصارة الخلوية الانقباضية / الانبساطي Ca2+ والانكماش / الاسترخاء ، يعد هذا القياس ضروريا في دعم الآليات التي تتوسط اقتران الإثارة والتقلص القلبي في القلوب السليمة والمريضة.

الملخص

فشل القلب وعدم انتظام ضربات القلب هي الأسباب الرئيسية للأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، لا تزال الآلية المرضية وعطل عضلة القلب في القلب المريضة إلى توضيح كامل. يوضح أدلة دامغة مؤخرا أن التغيرات في حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ تؤثر على الكالسيوم داخل الخلايا 2+ الأنشطة التوازن والقناة الايونية في myocytes القلب، والآليات الأساسية المسؤولة عن إمكانات العمل القلب وانقباض في قلوب سليمة والمريضة. في الواقع، أنشطة القنوات الأيونية والنقل الكامنة إمكانات العمل القلب (على سبيل المثال، الصوديوم، الكالسيوم 2+ و K + القنوات ونا + -CA 2+ مبادل) والكالسيوم 2+ التعامل مع البروتينات داخل الخلايا (على سبيل المثال، ryanodine المستقبلات والكالسيوم يتم قياس 2+ -ATPase في شبكية الهيولى العضلية (SERCA2a) أو فسفولامبان والفسفرة به) تقليديا إلى evaluيأكل من الآليات الأساسية للالقلب اقتران الإثارة، تقلص (EC). كل من الأنشطة الكهربائية في الغشاء والتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ هي إشارات الزناد من اقتران EC، في حين خيط عضلي هو وحدة وظيفية من التقلص والاسترخاء، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ أمر لا بد منه في تنفيذ الأداء ييفة عضلية. ومع ذلك، عدد قليل من الدراسات تتضمن حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في التحليل الوظيفي لعضلة القلب إلا إذا كان التركيز في الدراسة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيس قسيم عضلي تقصير / إعادة إطالة والخلايا مستوى الكالسيوم 2+ باستخدام Fura 02:00 (كشف ratiometric) وتقييم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في myocytes القلب من قلوب الفئران. والهدف الرئيسي هو التأكيد على أنه خيط عضلي ينبغي أن تؤخذ حساسية الكالسيوم 2+ بعين الاعتبار في اقتران EC للتحليل الآلية. تحقيق شامل طعلى قنوات، نقل أيون، داخل الخلايا معالجة الكالسيوم 2+، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ التي تكمن وراء انقباض العضلية في قلوب سليمة والمريضة سوف توفر معلومات قيمة عن تصميم استراتيجيات أكثر فعالية من متعدية وقيمة علاجية.

المقدمة

القلب الإثارة، تقلص (EC) اقتران هو مخطط أساسي لتحليل الخواص الميكانيكية للعضلة القلب، أي وظيفة مقلص من القلب 1،2. يبدأ اقتران المفوضية الأوروبية من خلال الاستقطاب غشاء الثانوي لأنشطة القنوات الأيونية sarcolemmal (على سبيل المثال، نا + قناة بوابات الجهد، والتي يمكن قياسها عبر تقنيات التصحيح، المشبك). تفعيل لاحق من الجهد بوابات L من نوع كا 2+ قنوات (LTCCs) والكالسيوم 2+ تدفق عبر LTCCs تؤدي الجزء الأكبر من الكالسيوم 2+ الإفراج خلال ryanodine المستقبلات (RyRs)، وزيادة عصاري خلوي تركيز الكالسيوم 2+ من nanomolar (نانومتر ) إلى مكرومولي مستوى (ميكرومتر). هذه الزيادة في كاليفورنيا عصاري خلوي 2+ يعزز الكالسيوم 2+ ملزمة لتروبونين C (المجلس الوطني الانتقالي) في خيوط رقيقة ويثير التغيرات متعلق بتكوين مجمع خيوط لتسهيل التفاعل بين الأكتين الميوسين ومن بلوغ myocardi انكماش ال 3. على العكس، فإن الكالسيوم عصاري خلوي 2+ وإعادة المستحوذ ظهر في شبكية الهيولى العضلية (SR) من خلال كا 2+ -ATPase في ريال (SERCA2a) أو مقذوف من العضلية عن طريق نا + / كا 2+ المبادلات والبلازمي كاليفورنيا 2+ أتباز 1،2. ونتيجة لذلك، وانخفاض في الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يحرض التغييرات متعلق بتكوين خيوط رقيقة العودة إلى حالته الأصلية، مما أدى إلى تفكك الأكتين، الميوسين والعضلية الاسترخاء 1-3. في هذا المخطط، ويعتبر هذا النشاط من SERCA2a عموما لتحديد سرعة الاسترخاء عضلة القلب لأنه يشكل 70 - 90٪ من عصاري خلوي إزالة الكالسيوم 2+ في معظم خلايا القلب الثدييات 1. على هذا النحو، والشاذ الكالسيوم 2+ معالجة من قبل LTCC، RYR وSERCA2a، وما إلى ذلك اعتبرت الآليات الرئيسية لانقباض ضعف واسترخاء في قلب المريضة 1-4.

> في الواقع، مجانا عصاري خلوي كا 2+ أن وظائف كما قال رسول في حسابات اقتران EC لحوالي 1٪ من مجموع الكالسيوم داخل الخلايا 2+ والغالبية من الكالسيوم 2+ لا بد أن الكالسيوم داخل الخلايا 2+ مخازن 5،6. هذا ويرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من الكالسيوم 2+ مخازن وفيرة في myocytes القلب، على سبيل المثال، الفوسفورية غشاء، ATP، فسفوكرياتين، كالمودولين، parvalbumin، ييفة عضلية الشركات عبر الوطنية، الميوسين، SERCA2a، وكالسيكويسترين في ريال 5،6،7. من بينها، SERCA2a والشركات عبر الوطنية هي السائدة الكالسيوم 2+ مخازن 5،6،7. وعلاوة على ذلك، الكالسيوم 2+ ملزمة لالمخازن المؤقتة الخاصة به هو عملية ديناميكية خلال نشل (على سبيل المثال، 30-50٪ من الكالسيوم 2+ بربط الشركات عبر الوطنية وتنفصل منه خلال كا 2+ العابرين 7) والتغيير في كا 2+ سبب إضافي ملزم "الافراج" حرية الكالسيوم 2+ إلى العصارة الخلوية، والنتائج في التعديلات من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ اضربentration. ونتيجة لذلك، الاضطراب داخل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ يدفع الحركات خيط عضلي غير طبيعي، والتي هي السلائف من ضعف مقلص وعدم انتظام ضربات القلب 8،9. عوامل كثيرة (كلا الفسيولوجية والمرضية) يمكن أن تكون مصادر تعديلات ما بعد النسخي من البروتينات خيط عضلي، التي تؤثر على خيط عضلي الكالسيوم 2+ التخزين المؤقت وخيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية 8-10. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الطفرات في البروتينات خيط عضلي زيادة الكالسيوم 2+ تقارب ملزمة والخلايا معالجة الكالسيوم 2+، مما اثار التقوية التي تعتمد على وقفة من الكالسيوم 2+ العابرين، والشاذ الكالسيوم 2+ الإفراج عنهم، وعدم انتظام ضربات القلب 8. وتماشيا مع هذا المفهوم، لقد أظهرنا أيضا أن خيط عضلي الكالسيوم 2+ الحساسية في قلوب الفئران ارتفاع ضغط الدم الثانوي ليصل تنظيم الخلايا العصبية سينسيز أكسيد النيتريك يرتبط ضغط الدم الانبساطي مرتفعة والانقباضي الكالسيوم 2+ المستويات11، والذي بدوره يزيد من ضعف LTCC إلى الكالسيوم 2+ تثبيط معتمد على 12. وبالتالي، حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ هو منظم "نشطا" من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن والعضلية وظيفة مقلص. أصبح من الضروري لتحليل التفاعلات بين خيط عضلي والكالسيوم 2+ التعامل مع البروتينات لتحقيق شامل في العضلية اقتران EC وظيفة القلب.

هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في myocytes القلب المعزولة. تحليل شامل للالكالسيوم داخل الخلايا 2+ الشخصي، وخيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية والانكماش كشف آليات جديدة الميكانيكا عضلة القلب الكامنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

البروتوكول هو وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للأمم المتحدة للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، منقحة 1996). تم الموافقة عليها من قبل اللجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعة سيول الوطنية (موافقة IACUC أي: جامعة سول الوطنية-101213-1).

1. إعداد العازلة (مواد الجدول والمعدات)

  1. إعداد 300 مل من محلول عزلة جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم، 135، بوكل، 5.4، MgCl 2، 3.5، الجلوكوز، 5؛ HEPES، 5؛ نا 2 هبو 4، 0.4، التورين، 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
  2. إعداد 100 مل من محلول تخزين جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم 120، بوكل 5.4، MgSO 4 5؛ CaCl 2 0.2، الصوديوم البيروفات 5؛ الجلوكوز 5.5، التورين 20؛ HEPES 10؛ مانيتول 29؛ ودرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
  3. تحضير 1L من حل نضح (في ملي: كلوريد الصوديوم، 141.4، بوكل، 4؛ ناه 2 ص 4، 0.33، MGCل 2، 1؛ HEPES، 10؛ الجلوكوز، 5.5، CaCl 2، 1.8، مانيتول، 14.5، 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم).
  4. إعداد 30 مل من محلول كولاجيناز 1 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، البروتيني (0.1 ملغ / مل)، ألبومين المصل البقري (BSA، 1.67mg / مل)، والكالسيوم 2+ (0.05 ملم) إلى 25 مل من العزلة حل.
  5. إعداد 20 مل من محلول كولاجيناز 2 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، BSA (1.67 ملغ / مل)، والكالسيوم 2+ (0.05 ملم) إلى 16.7 مل من محلول العزلة.
  6. إعداد 40 مل من محلول BSA بإضافة 0.4 غرام من BSA إلى 40 مل من محلول العزلة. فصل 10 مل و 30 مل إلى قسمين الأكواب. إضافة الكالسيوم 2+ إلى 30 مل من محلول BSA بحيث النهائي الكالسيوم 2+ التركيز في حل جيش صرب البوسنة هو 1 ملم.

2. إعداد لعزل البطين الأيسر (LV) Myocytes

  1. نقل 8-12، ذكور فئران قبل أسبوع سبراغ داولي (SD) في أقفاص النقل النظيفة من منشأة الحيوان إلى غرفة التحضير والعزلة.
  2. Hأكل اثنين من حمامات المياه إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام حمام مائي واحد للمياه - خزان تغلف وأنابيب نضح من نظام الارواء Langendorff. استخدام حمام مائي آخرين للتحريض جذوع أنسجة عضلة القلب وذلك لفصل myocytes واحدة.
  3. إضافة 5 مل و 3.3 مل من محلول BSA (بدون الكالسيوم 2+) إلى 25 مل من محلول كولاجيناز 1 و 16.7 مل كولاجيناز الحل 2 لتعويض حجم 30 مل و 20 مل، على التوالي.
  4. إضافة حل العزلة (100 مل)، وحل كولاجيناز 1 (30 مل) إلى العمود 1 (العقيد 1) والعمود 2 (العقيد 2) في نظام Langendorff نضح، على التوالي (الشكل 1A).
  5. الأوكسجين في حل العزلة وحل كولاجيناز 1 في العقيد 1 وCol.2 عبر أنبوب توصيل الأكسجين في النظام نضح Langendorff (الشكل 1A). وبالمثل، الأوكسجين حل كولاجيناز 2 وحل جيش صرب البوسنة في حمام مائي تهتز مع 100٪ O 2 عن طريقأنبوب توصيل الأكسجين.

3. عزل LV Myocytes

  1. تخدير الفئران SD عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم بنتوباربيتال (30 ملغ / كلغ) وتأكد من حالة التخدير التي كتبها اصبع القدم معسر وعدم وجود انعكاس الانسحاب.
  2. نقل الفئران إلى علبة تشريح. في موقف ضعيف، وتأمين أربع أرجل على الجانبين من الجسم مع الشريط.
  3. تطبيق الصدري شقوق منتصف محوري مع مقص جراحي لفتح الصدر، وضمان عدم تلف القلب. استخدام زوج آخر من مقص نظيفة لتشريح القلب من الأوعية التي تربط (على سبيل المثال، متفوقة والوريد الأجوف السفلي، الأوعية الرئوية، والشريان الأورطي) وغشاء التامور 13.
  4. ترك جزء من الشريان الأورطي لمدة كافية (5-8 ملم)، المشبك الأبهر مع ملقط غرامة، وجبل بسرعة قنية من نظام الارواء Langendorff حدود 1 دقيقة (الشكل 1A). ربط خيوط الجروح 4/0 بإحكام على الشريان الأورطي.
    5. تشغيل صمام على العقيد 1 ويروي قلب معزولة مع حل العزلة قبل تحسنت والاوكسيجين لمدة 10 دقيقة (معدل نضح: 12-14 مل / دقيقة). إيقاف صمام على العقيد 1، بدوره على صمام على العقيد (2) ويروي القلب مع حل كولاجيناز 1 ل8-10 دقيقة.
  5. ترجل قلب هضمها من قبل قطع الشريان الأورطي ونقلها من خلال عقد الشريان الأورطي مع ملقط في قارورة تحتوي على حل العزلة الطازجة (الشكل 1Bi). استخدام مقص الجميلة وملقط لقطع معظم الجدار الحر LV (بما في ذلك الحاجز) إلى أجزاء أصغر (~ 22 ملم، الشكل 1Bii).
  6. نقل القطع في قارورة تحتوي على قبل تحسنت والاوكسيجين كولاجيناز جديدة الحل 2 (الشكل 1Biii). يهز لمدة 10 دقيقة. استمرار في تقديم الأكسجين إلى التي تحتوي على العضلية كولاجيناز حل 2.
  7. نقل العضلية - تعليق لأنبوب 10 مل الطرد المركزي باستخدام القطارات مع لمبة الشفط وإضافة الكالسيوم 2+ - تحتوي على حل جيش صرب البوسنة (1: 1 في الحجم). أجهزة الطرد المركزي في 30 جرام لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. إعادة تعليق بيليه العضلية في 5 مل من محلول BSA. الطرد المركزي وتجاهل طاف.
  8. تفريق الكريات العضلية والحفاظ على myocytes في 10 مل من محلول التخزين المؤكسج قبل في RT (الشكل 1Biv الى السادس).
  9. كرر الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مع النسيج LV المتبقية في القارورة.
    ملاحظة: الحفاظ على تكرار الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مرة أخرى حتى معظم الأنسجة LV يختفي في الحصول على عائد جيد من myocytes.
  10. الحفاظ على myocytes في حلول التخزين لمدة 6-8 ساعة على RT حتى نهاية التجارب.

4. القياسات في وقت واحد من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرون والعضلية تقلص

  1. myocytes تحميل LV مع acetoxymethyl استر FURA-02:00 (2 ميكرومتر).
    ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات التحميل والتجارب مع myocytes محملة في أنبوب الظلام (الشكل 1Bvii).
    1. الطرد المركزيifuge تعليق العضلية (1 مل) في 2000 x ج لمدة 10 ثانية. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه العضلية في 1 مل من محلول تايرود مع انخفاض الكالسيوم 2+ تركيز (250 ميكرومتر، مواد الجدول والمعدات).
    2. إضافة FURA-02:00 وبولوكسامير 407 (2 ميكرولتر)، تفريق بلطف تعليق العضلية، والحفاظ على الخليط في RT (20-24 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة (الشكل 1Bvii).
    3. الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثوان، تجاهل طاف وتفريق بيليه العضلية في 1 مل من محلول الارواء تحتوي على 500 ميكرومتر الكالسيوم 2+. بعد 10 دقيقة، الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثانية وتجاهل طاف.
    4. إضافة محلول الارواء الطازجة (500 ميكرومتر الكالسيوم 2+، 1 مل) والحفاظ على FURA-02:00 - بيليه العضلية التي تم تحميلها في هذا الحل للتسجيلات.
  2. قياس انكماش LV العضلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+
    1. قبل التسجيل، وملء الأنبوب نضح أن يمر عبرسترة المياه مع حل تايرود، وهو قبل تحسنت إلى 36 درجة مئوية.
    2. ضع بضع قطرات من FURA 02:00 - تحميل LV تعليق العضلية على غرفة المجهر مضان مقلوب لمدة 5 - 8 دقائق. ببطء يروي الحل تايرود (2.2 مل / دقيقة).
    3. اضغط على زر "البدء" على اللوحة الأمامية للمحفز إصبعي لبدء التحفيز الميدان (2 هرتز).
      ملاحظة: انتاج التيار الكهربائي (10 فولت، 5 ميللي ثانية مدتها) وتطبيقها على myocytes في الغرفة من خلال أسلاك البلاتين المتمركزة على جانبي الغرفة.
      1. اختر myocytes أن العقد ثابت (لا تلك التي تعرض فرط أو قصور انكماش) ​​للتسجيل.
    4. ضبط العضلية من خيار في الوضع الأفقي للنظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو وضبط بؤرة المجهر للحصول على صور أفضل من ساركومير. ضع مربع مستطيل الأرجواني على المنطقة التي لوحظت ساركومير واضحة بوضوح حتى المتوسطمن أطوال قسيم عضلي (الذروة الحمراء) يعرض ذروة فريدة حادة (الشكل 2A، الصورة السفلى).
    5. تسجيل التغيرات في طول قسيم عضلي في الاستجابة لتحفيز الميدان (الشكل 2A وباء).
      ملاحظة: استخدم myocytes تحميل ضمن 1-2 ساعة.
    6. ضبط فتحة الكاميرا بحيث الحقل في نظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو هو حجم العضلية (الشكل 2A). تحفيز العضلية مع الإثارة في 360 نانومتر / 380 نانومتر، والانبعاثات في 510 نانومتر (تردد اقتناء 1000 هرتز). سجل تقصير قسيم عضلي ونسبة Fura2 AM مع التحفيز الميدان (الشكل 2B).

5. تقييم حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+

  1. متوسط ​​أطوال قسيم عضلي والكالسيوم 2+ العابرين في حالة استقرار (10-20 آثار) ورسم حلقة مرحلة الطائرة من نسبة FURA-2 مقابل طول قسيم عضلي من نفس العضلية (على حد سواء مع القيمة المقاسةالصورة ودلتا التغييرات، الشكل 2C).
  2. في كل قطعة، وتحديد نسبة FURA -2 في 50٪ الاسترخاء (EC 50، الشكل 2C). مقارنة كل حلقة وEC 50 من كل تدخل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عزل myocytes LV من قلوب الفئران العادية وارتفاع ضغط الدم. تعتبر myocytes على شكل قضيب مع التصدعات واضحة (تمثل ساركومير) وتقلصات مستقرة وردا على التحفيز المجال ليكون myocytes الأمثل ويتم اختيارها للتسجيلات (الشكل 2A). في المثال الموضح في F igure 2A، وهو FURA 02:00 -loaded يتم وضع LV العضلية أفقيا ويتم ضبط فتحة الكاميرا بحيث تحتل العضلية أكثر من مجال تسجيل والمنطقة الخلفية الحد الأدنى من مدرج. في مجال تسجيل وضبط ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نحن تصف بروتوكولات لتقييم التغيرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في واحدة العضلية القلبية معزولة والتأكيد على أهمية قياس هذه المعلمة إلى جانب الخصائص الكهربية، الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين، وديناميات خيط عضلي. وذلك لأن التسجيلات واحدة أو اثنتين من المعلمات قد لا فسر الآليات الكامنة وراء تقلص القلب والاسترخاء. على عكس الطرق التقليدية لقياس انكماش العضلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+ الشخصي بشكل فردي 1، يدرس المنهج الحالي كلا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث من قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (2013068067). بواسطة برنامج الدراسات العليا في الدماغ كوريا 21 من وزارة الكورية التعليم والعلوم والتكنولوجيا ومستشفى جامعة سيول الوطنية، والجمعية الكورية لارتفاع ضغط الدم (2013)، وصندوق البحوث للاتصالات SK (رقم 3420130290) ومن المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 31460265، 81260035 NSFC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سبراج داولي الفئرانKoatech8-12 أسابيع
Pentobarbital الصوديومهانليم الصيدلانية (كوريا)AHN901رمز التأمين: 645301220
كلوريد الصوديومسيجماS9625
KClسيجماP4504
NaH2< / sub>PO4< / sub>SigmaS8282
HEPESسيجماH3375
الجلوكوزسيجماG8270
CaCl2< / sub>BiosesangC2002
MgCl2< / sub>BiosesangM2001
MannitolSigmaM4125
MgSO4< / sub>SigmaM5921
الصوديوم بيروفاتسيجماP2256
تورينميرك8.08616.1000
Na2HPO4  < / sub>Sigma71649
ألبومين الجنين البقريSigmaA7906
Collagenase Type 2WorthingtonLS004177
ProteaseSigmaP6911
Fura-2 (AM)المجسات الجزيئيةF1221
Pluronic F127 محلول 20٪ في DMSOInvitrogenP3000MP
اهتزاز حمام الماءتشانغ شينالنموذج العلمي: C-108
IonWizard Softwae SuiteIonOptix LtdExperimental Builderالاستحواذ وتحليل بيانات اقتران EC في الخلايا العضلية
والخلايا العضلية والكالسيوم & نظام تسجيل الانقباضIonOptix Ltd
حمام مائي متداولBS-TechBW2-8
مجهر مضانالعضلية نيكونDIATPHOTO 200
MyoCam-S PowerIonOptix
Fluorescence & كشف الفيديوIonOptixMyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & واجهة النظامIonOptixFSI700
مصدر ضوء الإثارةIonOptixmSTEP
مصباح ARC عالي الكثافة مزود الطاقةCairn Reseach
وحدة تحكم في عجلة الفلترIonOptixGB / MUS200
المحفز الرقميالأنظمة الطبية CorpartS-98 Mutimode
<قوي>تركيبات الحلول التجريبية
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
محلول العزل (الرقم الهيدروجيني: 7.4 ، هيدروكسيد الصوديوم)
كلوريد الصوديومسيجماS9625(ملليمول) 135
KClSigmaP4504(ملليمول) 5.4
تركيز هيبسسيجماH3375(ملليمول) 5
تركيز الجلوكوزسيجماG8270(ملليمول) 5
ملغ كلوريد < > 2 < / فرعي >تركيز BiosesangM2001(ملليمول) 3.5
CB2742654التورينسيجما (مليمول) 20
Na2HPO4  < / فرعي >تركيز سيجما71649(مليمول) 0.4
محلول تخزين (درجة الحموضة: 7.4 ، هيدروكسيد الصوديوم) تركيز
كلوريد الصوديومسيجماS9625(مليمول) 120
كيلو كلوريد سيجماP4504(مليمول) 5.4
تركيز هيبسسيجماH3375(مليمول) 10
جلوكوزسيجماG8270تركيز (ملليمول) 5.5
CaCl 2< / sub>BiosesangC2002التركيز (ملليمول) 0.2
مانيتولسيجماM4125(ملليمول) 29
ملغ SO4< / sub>سيجماM5921(ملليمول) 5
بيروفات الصوديومسيجماP2256(ملليمول) 5
تورينسيجماتركيز CB2742654(ملليمول) 20
محلول التروية (محلول التيرود ، الرقم الهيدروجيني: 7.4 ، هيدروكسيد الصوديوم)
كلوريد الصوديومسيجماS9625(ملليمول) 141.4
كيلو كلوريد سيجماP4504التركيز (ملليمول) 4
هيدروهيدروشميسيوم < فرعي >2< / فرعي > << فرعي >>سيجماS8282(مليمول) 0.33
تركيز HEPESSigmaH3375(ملليمول) 10
تركيز الجلوكوزسيجماG8270(ملليمول) 5.5
CaCl 2< / sub>BiosesangC2002التركيز (ملليمول) 1.8 & nbsp ؛         بالنسبة لتحميل Fura 2AM ، تكون تركيزات CaCl2 0.25 ملي مولار و 0.5 ملي مولار
MgCl2< / sub>BiosesangM2001التركيز (ملليمول) 1
تركيز مانيتولسيجماM4125(مليمول) 14.5
محلول الكولانجيناز 1
محلول عزل (30 مل) ألبومين
الجنين البقري (محلول BSA 5 مل)التركيز (ملليمول) 1.67 مجم / مل
الكولاجيناز من النوع 2ورثينجتونLS004177التركيز (ملليمول) 1 مجم / مل
البروتيازسيجماP6911التركيز (ملليمول) 0.1 مجم / مل
كلور الكالسيوم < تحت >2< / فرعي>BiosesangC2002التركيز (ملليمول) 0.05 ملي محلول
الكولانجيناز 2
محلول العزل ( 20 مل)
ألبومين الجنين البقري (محلول BSA 3.3 مل)التركيز (ملليمول) 1.67 مجم / مل
الكولاجيناز من النوع 2تركيز ورثينجتونLS004177 (ملليمول) 1 مجم / مل
كلوريد الكالسيوم < تحت >2< / فرعي >BiosesangC2002التركيز (ملليمول) 0.05 ملي
BSA
عزل ( 40 مل)
ألبومين الجنين البقريسيجماA7906(ملليمول) 400 مجم
كلوريد الكالسيوم < > 2< / فرعي >تركيز BiosesangC2002(مليمول) 1 ملي مولار
الخلايا تركيز تركيز تركيز تركيز تركيز تركيز تركيز تركيز تركيز محلول محلول تركيز

المراجع

  1. Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  2. Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
  3. Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
  4. Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
  5. Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
  6. Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
  7. Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
  8. Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
  9. Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
  10. Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336(2013).
  11. Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
  12. Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
  15. Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
  16. Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
  17. Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
  18. Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
  19. Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
  20. Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
  21. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  22. Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Fura 2AM
تقييم خيط عضلي كاليفورنيا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.