نموذج الفأر من الشبكية الإسكيمية-ضخه إصابة خلال ارتفاع ضغط العين

ملخص

توضح هذه المقالة إجراء لإحداث الشبكية إصابة نقص التروية ضخه بواسطة ضغط العين المرتفع في الفئران. الشبكية إصابة نقص التروية ضخه بواسطة ضغط العين المرتفع يعمل على نموذج الأمراض البشرية التي تتميز الأكسجين للخطر وتسليم المواد الغذائية في شبكية العين، مما يتيح للباحثين لدراسة آليات والعلاجات الخلوية المحتملة لأمراض الإنسان وحدة وعائية عصبية للشبكية.

الملخص

في شبكية العين نقص التروية ضخه (I / R) هو عملية المرضية التي تسهم في تلف الخلايا في ظروف العين متعددة، بما في ذلك الزرق، واعتلال الشبكية السكري، وانسداد الأوعية الدموية في شبكية العين. نماذج القوارض الإصابة I / R يقدمون أفكارا هامة في آليات واستراتيجيات العلاج لI / إصابة R الإنسان، وخاصة فيما يتعلق ضرر الاعصاب في وحدة وعائية عصبية للشبكية. المقدمة هنا هو بروتوكول لإحداث الشبكية إصابة I / R في الفئران من خلال ارتفاع ضغط العين (IOP). في هذا البروتوكول، ومقنى الغرفة الأمامية للعين مع إبرة، التي من خلالها يتدفق بالتنقيط من خزان المياه المالحة مرتفعة. استخدام هذا بالتنقيط لرفع IOP فوق الانقباضي ضغط الدم الشرياني، طبيب يوقف تدفق الدم في شبكية العين الداخلي (نقص التروية) مؤقتا. عندما يتم إعادة التداول (ضخه) عن طريق إزالة قنية، تستتبعه تلف الخلايا شديد، مما يؤدي في نهاية المطاف في التنكس العصبي في شبكية العين. مسمار الزوارالمنشأ تثبت التهاب، نفاذية الأوعية الدموية، وانحطاط الشعرية بوصفها عناصر إضافية من هذا الطراز. مقارنة منهجيات الشبكية بديلة I / R، مثل ربط الشرايين في شبكية العين، وشبكية العين / إصابة R من قبل مرتفعة IOP يوفر مزايا في خصوصيته التشريحية، قابلية الإستطراق التجريبية، وسهولة الوصول إليها الفني، وتقديم نفسها على أنها أداة قيمة لدراسة المرضية العصبية والعلاج في وحدة وعائية عصبية للشبكية.

المقدمة

في شبكية العين نقص التروية ضخه (I / R) يميز العديد من الأمراض شبكية العين البشرية، بما في ذلك الزرق، واعتلال الشبكية السكري، وانسداد الأوعية الدموية في شبكية العين ^1. في شبكية العين I / R، وانخفاض تدفق الدم (نقص التروية) في الأوعية الدموية في شبكية العين يخلق حالة من فرط الحساسية في شبكية العين إلى الأوكسجين والمواد المغذية الأخرى، مما عجل الأكسدة الشديدة والأضرار التهابات عند إعادة التداول في وقت لاحق (ضخه) ^2. تظهر الشبكية العصبية عرضة بشكل خاص لهذه التغييرات، مع التنكس العصبي في شبكية العين يجري ربما الميزة الأكثر بروزا من الضرر الناجم عن R-I /. المقدمة هنا هو بروتوكول لنمذجة الشبكية إصابة I / R في الماوس. هذه التقنية تمكن الباحثون لدراسة الآليات المحتملة واستراتيجيات العلاج لأمراض الإنسان وحدة وعائية عصبية للشبكية.

رائدة في عام 1952 من قبل الجراحين تسعى إلى فهم عواقب العصبية من فقر الدم الجراحي ^3، رودنتم إعادة تأسيس ر الشبكية I / R من ارتفاع ضغط العين (IOP) في عام 1991 لغرض توحيد النهاية الاعصاب بعد إهانة الدماغية ^4. استخدام الري بالتنقيط من خزان المياه المالحة لرفع IOP فوق ضغط الدم الانقباضي، وأظهرت هذه الدراسات أن إقناء؛ إدخال القنية العين الضغط كان كافيا لوقف التداول في شبكية العين، وبالتالي بدء انحطاط الخلايا العصبية. بدأت المزيد من الجهود الأخيرة باستخدام الشبكية I / R من ارتفاع الضغط داخل المقلة لوضع الآليات الكامنة I / R الناجم عن تنكس عصبي في شبكية العين ^12/05. وأفادت مجموعات متعددة تغيرات مرضية إضافية بما في ذلك التهاب ^{13،14، 15،16} نفاذية الأوعية الدموية، والشعرية انحطاط ^14،17. أخذت معا، وقد أنشأت هذه الدراسات الشبكية إصابة I / R من IOP ارتفاع كنموذج للمرض وعائية عصبية في شبكية العين بشكل عام.

تميز آليات الإصابة I / R الضروري لدراسة زارة شؤون المحاربين القدامىمرض scular. الشبكية إصابة I / R من IOP مرتفعة هي واحدة من العديد من النماذج الإصابة التي يسببها نقص الأكسجة، بما في ذلك الإصابات I / R في الرئة ^18، قلب ^19، الدماغ ^20، الكبد ²¹ والكلى ^22، والأمعاء ^23. وكانت هذه النماذج بالغ الأهمية في تعزيز فهمنا لمرض الأوعية الدموية والعلاجات السريرية لها. من خلال توسيع التحقيق في عمليات I / R لأنسجة العين، وشبكية العين / إصابة R من ارتفاع الضغط داخل المقلة يساعد على رسم صورة أكثر شمولا من هذه الشروط ذات الصلة.

المقابلة بشكل وثيق مع الحالات السريرية العصبية في شبكية العين، وشبكية العين / إصابة R من ارتفاع الضغط داخل المقلة يمثل أداة قيمة للباحثين المهتمين باستكشاف المرضية الدماغية. ويستهدف البروتوكول الموصوفة هنا، لين العريكة، ويمكن الوصول إليها. ويكمل جيدا قبل النهاية في انحطاط الخلايا العصبية، مثل الكمي من الخلايا العصبية للشبكية، وقياس سمك شبكية العين، وص الكهربيةتسجيل مفيدة من وظيفة الخلايا العصبية في شبكية العين. لقد أثبت هذا النموذج فائدتها في دفع عجلة التحقيق وعائية عصبية، وهذا يظهر وعد في كسب وضعية بروتوكول التأسيسية في بحوث الطب البصري.

البروتوكول

بيان الأخلاق: تم تنفيذ كافة الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جونز هوبكنز.

ملاحظة: الفئران المستخدمة أثناء التصوير هي C57BL / 6 الفئران من جاكسون، على الرغم من سلالات القوارض الأخرى أو الأنواع يمكن أن تستخدم أيضا. عند استخدام السلالات أو الأنواع الأخرى، أن ندرك أن جرعات التخدير والجدول الزمني الإصابة قد تختلف. ومن المهم للتكيف مع الظروف I / R لاستيعاب الضغط، والأنواع، والاختلافات التجريبية.

1. إعداد كوكتيل التخدير

1. الجمع بين 1.25 مل الكيتامين، 0.625 مل زيلازين، 0.375 مل آسيبرومازين، و22.75 مل الفوسفات مخزنة المالحة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
   ملاحظة: للحصول على ما تبقى من المخطوطة، وهذا الحل سوف يشار إلى كوكتيل.
2. تصفية كوكتيل في أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل جديد باستخدام حقنة 60 مل ومرشح 0.20 ميكرون. التسمية وتاريخ هذا تو جديديكون.
3. التفاف تماما أنبوب كوكتيل في رقائق الألومنيوم لمنع تدهور بفعل الضوء للمخدر.
   ملاحظة: قد يتم تخزين كوكتيل في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامها حتى تاريخ انتهاء الصلاحية من المقومات أقرب وقت ممكن، تنتهي به.

2. إعداد التخدير الداعم

1. في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، والجمع بين 4 مل الكيتامين و 16 مل الفوسفات المالحة.
   ملاحظة: من الآن فصاعدا هذا الحل أن يشار إليها على أنها معززة.
2. تصفية معززة في أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل جديد باستخدام حقنة 60 مل ومرشح 0.20 ميكرون. التسمية وتاريخ هذا الأنبوب الجديد.
   ملاحظة: قد يتم تخزين معززة في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامها حتى تاريخ انتهاء الصلاحية من المقومات أقرب وقت ممكن، تنتهي به.

3. إعداد جناح الجراحي

1. ضبط درجة حرارة الغرفة بين 18 درجة مئوية و 21 درجة مئوية.
2. بدوره على طاولة الجراحة، وضبط حرارة سطحه إلى higheدرجة الحرارة الحادي والعشرين.
3. تغطية جميع الأسطح العمل مع underpads الجراحي.
4. ترتيب قفص فارغ أو حاوية أخرى على طاولة الجراحة لتدفئة.
5. ترتيب نطاق وبلغة الأذن على سطح العمل.

4. إعداد محلول ملحي متوازن مع هيبارين الصوديوم

1. إضافة 0.5 مل من الصوديوم الهيبارين إلى زجاجة الرابع 500 مل من محلول ملحي متوازن (HBSS).
2. إدراج نهاية حادة من مجموعة الأساسي prepierced أنابيب Y الموقع في زجاجة من 0.1٪ الهيبارين الصوديوم.

5. إعداد القطب الرابع

1. شنق زجاجة من 0.1٪ من الصوديوم الهيبارين عن تمديد القطب الرابع، والمفاجئة فتح غطاء فلتر الهواء على مجموعة الأساسي prepierced أنابيب Y الموقع.
2. رفع زجاجة هيبارين الصوديوم 0.1٪ لتصل إلى 163 سم (120 ملم زئبق). قياس ارتفاع من سطح الطاولة إلى ذروة بالتنقيط الهيبارين الصوديوم.
3. إزالة أي فقاعات الهواء في الأنبوب الرابع عبها مجموعة الأساسي prepierced أنابيب Y-موقع يدويا.

6. إعداد الصوديوم الهيبارين بالتنقيط

1. ربط مجموعة الأساسي prepierced أنابيب Y-الموقع إلى مشعب خمسة صمام.
2. ربط عيار 30 ½ بوصة الإبر إلى مشعب خمسة ميناء باستخدام لور الذكور إلى LUER مواسير الذكور.
3. إدراج كل من الإبر عيار 30 ½ بوصة إلى الخاص شريحة 10 بوصة للأنابيب عيار 30.
4. استخدام المرقأة، كسر نصائح الإبرة من عيار 30 ½ بوصة الإبر جديدة وإدراج غاياتهم حادة في أنابيب عيار 30. سوف العقم أو التطهير من النصائح إبرة تكون ضرورية لالخطوة 8.3.
5. باستخدام الشريط، وترتيب أنابيب عيار 30 مع الإبر مثل أن أنابيب متصلة الموانئ الداخلية ووضع على رأس أنابيب متصلة الموانئ الخارجية. وهذا الترتيب منع صراعا من الأنابيب خلال إقناء؛ إدخال القنية غرفة الأمامي.
6. بدوره على تدفق الهيبارين الصوديوم 0.1٪ إلى مشعب خمسة صمام ولكل ميناء على حدة.
   1. تأكد من أن 0.1٪الهيبارين الصوديوم تتدفق بقوة لكل منفذ. إذا كان المنفذ تتدفق ضعيفة، يحل محل ميناء أو مسحها مع الهواء من محقنة معقمة.
   2. السماح للهيبارين الصوديوم 0.1٪ في التدفق ل2-3 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء من الأنابيب عيار 30 ومتعددة 5-صمام.
7. إيقاف كافة المنافذ على مشعب 5 صمام.

7. إعداد الفئران لجراحة

1. جعل الفئران إلى جناح الجراحة. توريد زجاجات المياه لكل قفص لمنع الجفاف الحيوانات أثناء الجراحة.
2. تسجيل وزن كل فأر.
3. حقن كل فأر داخل الصفاق مع 0.02 مل كوكتيل في الجسم غرام.
4. علامة وتسجيل عدد كل فأر.
5. وضع جميع الفئران في حاوية فارغة على طاولة الجراحة. اسمحوا 5-10 دقيقة لجميع الفئران لتحقيق التخدير العميق كما أكد عدم وجود استجابة دواسة انسحاب لقرصة أخمص قدميه.
6. لكل الماوس، إدارة قطرة واحدة منتروبيكاميد في كل عين لاتساع حدقة العين وتزييت على المدى القصير.
7. لكل الماوس، إدارة قطرة واحدة من بروباراكايين في كل عين للتخدير المحلية وتزييت على المدى القصير.
8. ترتيب الفئران في ترتيب التخدير بحيث الماوس أولى أن يكون تخدير سيكون الفأر الأول الذي مقنى.
9. السماح حوالي 2 دقيقة لقطرات العين نافذة المفعول.
10. إعداد التوالي قطع 4 بوصة من الشريط عن طريق سحب بإحكام على الشريط. جانبا من قطعة واحدة من الشريط لكل الماوس.
    ملاحظة: الفشل في سحب بإحكام على الشريط يؤدي في الشباك من الشريط.

8. يقني؛ يدخل القنية الغرفة الأمامية

1. ترتيب الماوس الأول تحت المجهر الجراحي، والتركيز المجهر على القرنية المفضل.
   ملاحظة: يمكن أداؤها كيفية تركيب الكانيولا في أي من العين. اليد اليمنى الجراحين المهيمن قد تجد طر أسهل ليقني؛ يدخل القنية العين اليسرى، في حين الأيسر الجراحين المهيمن قد يفضل اليمين.
2. تشغيل أول 0.1٪ ميناء الهيبارين الصوديوم على مشعب خمسة صمام.
3. تحت المجهر الجراحي، استخدام زوج من ملقط لproptose بلطف العين. إدراج قنية عيار 30 إبرة في الغرفة الأمامية في منتصف المسافة تقريبا بين الألياف النطيقة وقمة القرنية.
   1. الحرص على تجنب خدش أو ثقب القزحية، عدسة، أو سطح القرنية الداخلي.
   2. تجنب اختراق القرنية مرة ثانية.
   3. باستخدام حركة التواء لطيف للتغلب على الاحتكاك بين قنية والقرنية، وإدراج قنية بعمق في الغرفة الأمامية.
4. استخدام شريط من الشريط لتأمين أنابيب عيار 30 الى طاولة المفاوضات. للحد من حركة قنية إدراجها، اضغط على أنابيب عيار 30 ضد الطاولة في حين أن تفكري في الشريط.
5. تسجيل وقت بدء الجراحة.
6. باستخدام المجهر، verifذ أن أي تسرب واضح. إذا تسرب هو الحاضر، فإن حركة السوائل تكون واضحة بالقرب من العين.
7. تأكيد بصريا انتفاخ العين من خلال مراقبة أن I / R العين أكبر من العين المقابل. معا، لعدم وجود تسرب وجود انتفاخ العين يبرهن على وجود ارتفاع الناجح للضغط العين.
8. تطبيق هيدروكسي بروبيل ميثيل سيللوز لكلتا العينين. يقدم هيدروكسي بروبيل ميثيل سيللوز لتليين القرنية وختم microleaks. تطبيق هيدروكسي بروبيل ميثيل سيللوز حسب الحاجة (تقريبا كل 30 دقيقة) لتزييت المستمر.
9. كرر الخطوة 8 حتى يتم مقنى جميع الحيوانات.

9. مراقبة التخدير

1. استخدام قرصة أخمص القدمين، والمراقبة البصرية للشعيرات، أو الملاحظة البصرية من الذيل للتحقق من أن كل فأر يبقى تخدير. يجب على فأرة الحاسوب يبرهن على وجود استجابة دواسة الانسحاب، والوخز الشارب، أو حركة الذيل، والشروع فورا في الخطوة 9.2.
2. إذا يبدأ الماوس لتوقظ أثناء الجراحة، ورفعالذيل لحقن 0.05 مل معززة داخل الصفاق في أسفل البطن من وراء الماوس. السماح 1-2 دقيقة لتقوية نافذة المفعول.
3. وينبغي أن تشترط على الماوس تخدير إضافية، كرر الخطوة 9 الضرورة.

10. إزالة قنية من الغرفة الأمامية

1. لكل حيوان، بعد انقضاء 90 دقيقة، وسحب بلطف قنية من الغرفة الأمامية.
2. Untape الماوس من طاولة الجراحة، مع الحرص على عدم تعكير صفو أنابيب قنية الحيوانات المجاورة.
3. تليين كلتا العينين مع زيوت التشحيم هلام.
4. كما تتم إزالة حقنة عادية لاحقة، وترتيب الفئران في حاوية فارغة على طاولة الجراحة للتعافي من الجراحة. لا إيقاف الحرارة من طاولة الجراحة.
5. السماح، في الحد الأدنى، 2-3 ساعة لتحقيق الانتعاش على طاولة الجراحة ساخنة. مراقبة الفئران في كثير من الأحيان إلا بعد أن تعافى تماما من التخدير.

11. تنظيف المعادلةuipment

1. تطهير حقنة عادية باستخدام مناديل الكحول.
   ملاحظة: هناك طرق أخرى للتطهير أو تعقيم، مثل التعقيم، قد تكون بديلا.
2. طرد 0.1٪ الهيبارين الصوديوم من مشعب 5 صمام، الإبر عيار 30، وأنابيب عيار 30، وحقنة عادية باستخدام حقنة 60 مل مملوءة بالهواء.
3. شطف متعددة 5-صمام، الإبر عيار 30، وأنابيب عيار 30، وحقنة عادية باستخدام حقنة 60 مل مملوءة بالماء المقطر.
4. طرد الماء المقطر من مشعب 5 الميناء، الإبر عيار 30، وأنابيب عيار 30، وحقنة عادية باستخدام حقنة 60 مل مملوءة بالهواء.
5. بعد تطهير حقنة عادية والشطف جهاز الأنابيب، وتخزين هذه المعدات لإعادة استخدامها.
6. متجر، تجاهل، أو إيقاف جميع المعدات الأخرى. ترك حرارة طاولة الجراحة جرا.

12. عودة جميع الفئران لتلك أقفاص الرئيسية

1. بعد توقظ الفئران من عملية جراحية (بعد 2-3 ساعة)، والعودة كل حيوان إلى قفص وطنه. توفير الغذاء هلام لكل قفص. إعادة جميع الأقفاص إلى غرفهم المعينة.
2. إيقاف الحرارة من طاولة الجراحة. تجاهل جميع النفايات، ومسح أسفل جناح الجراحة.

13. تنفيذ تقييم الشبكية

1. حسب الاقتضاء، وجمع شبكية العين للتحليل النسيجي أو الظلام التكيف مع الفئران لتسجيل مخطط كهربية.

النتائج

آثار العصبية من أنا الشبكية / R من ارتفاع الضغط داخل المقلة وعادة تقييمها باستخدام نهجين القياسية. وكشفت NeuN immunolabeling من نوى الخلايا العصبية الهامة فقدان الخلايا العصبية التالية I / R إهانة (الشكل 1). لفترة وجيزة، عيون منزوعة النواة 7 أيام بعد I / تم إصلاحها R في امتصاص العرق، وصفت مع علامة الخلية العصبية NeuN، وكلها محمولة. تم القبض على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر، وكانت كمية الخلايا المسمى مع NeuN عن طريق عد ^11.<...

المناقشة

وقد ثبت في شبكية العين I / إصابة R من ارتفاع الضغط داخل المقلة فائدتها في نمذجة تلف الخلايا واختلال وظيفي، ولا سيما التنكس العصبي، في القوارض وحدة الوعائية العصبية في شبكية العين. يوفر هذا الإجراء الأنسجة سيطرة قوية ويمكن الوصول إليه بسهولة من حيث التطور التقني. وقد لوحظ في هذه وغيرها من النماذج إصابة I / R أن زيادة الضغط ومدة التروية قد تزيد من خطورة الاصابه ^24. لهذا السبب، لقد انتخب بعض الممارسين لاستخدام الضغوط والمدد الدماغية تختلف عن تلك المعروضة هنا ^{4،6-10،12...}

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقن الهيبارين الصوديوم ، USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP / ml
BSS محلول الري المعقم	Alcon Laboratories، Inc.	9007754-0212	500 مل
SC-2 كجم ميزان جيب رقمي	موازين الوزن الأمريكية ، Inc.	SC-2 كجم
محلول تروبيكاميد للعيون USP 1٪	Bausch + Lomb		1٪ (10 مجم / مل)
العيون بروباراكايين هيدروكلوريد USP ، 0.5٪	Bausch + Lomb		0.5٪ (5 مجم / مل)
أنابيب البولي إيثيلين INTRAMEDIC	Becton Dickinson and Company	427400	القطر الداخلي: 427400
30 جم 1/2 إبر PrecisionGlide	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 مل حقنة تيرابايت ، طرف رفيع مع إبرة شطبة داخل الأدمة ، 26 جم × 3/8	بنتون ديكنسون وشركاه	309625
60 مل حقنة Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200 / S8 مجهر	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
مرشح حقنة معقمة	Corning Inc.	CLS431224	0.20 وميكرو ؛ m
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 × 24 بوصة
الكحول الإعدادية	Covidien	6818	2 طبقة ،
متوسط الطالب Dumont # 5 ملقط	أدوات العلوم الدقيقة	91150-20
أدوات العلوم الدقيقة Hartman Hemostats		13002-10
مجموعة أساسية ، Macrobore ، موقع Y-Site مثقوب مسبقا ، 80 بوصة	Hospira	12672-28
محلول ملحي مخزن بالفوسفات درجة الحموضة 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 مل
ماء مقطر	Invitrogen	15230-204	500 مل
C57BL / 6J الفئران	مختبر جاكسون	664
حقن AnaSed: محلول زيلازين معقم	LLOYD، Inc.		20 مجم / مل
عبوة	MediChoice		المضادة للذوبان في
NAMIC لمراقبة الضغط الوعائي NAMIC	Navilyst Medical، Inc.	70039355	مشعب 5 صمامات مع سبعة منافذ أنثوية
Goniosoft ، محلول إزالة مستحلب العيون Hypromellose 2.5٪: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT، Inc.		2.5٪ (25 مجم / مل)
كيتاسيت CIII: كيتامين هيدروكلوريد	فايزر ، إنك.		100 ملغ/مل
ترانس بال IV ستاند	منتجات بريور	372	مؤثثة بامتداد من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 60 سم
محلي الصنع أسيبرومازين: حقن أسيبرومازين ماليات ، USP	Vet One		10 مجم / مل
طاولة جراحة V-Top / قابل للتعديل هيدروليكي	VSSI	100-4041-21
تركيب أنبوب لور إلى لور ذكر	أدوات وارنر	64-1579