يستخدم هذا البروتوكول الحالي مراسلي الفلورسنت ، ووضع العلامات في الجسم الحي ، وتقنيات التصوير داخل الحيوية لتمكين مراقبة العملية الديناميكية لتحضير العدلات في الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير حيوي داخلي من العدلات الاشعال عن طريق IL-1β يحركها المروج عن dsRed الفئران مراسل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الإنسان الدورة الدموية وجندت بسرعة إلى مواقع التهابات. فتيلة هو الحدث الحاسم الذي يعزز وظيفة أكلة العدلات. على الرغم من أن دراسات مستفيضة وقد كشفت وجود وأهمية فتيلة العدلات خلال العدوى والإصابة، يعني من تصور هذه العملية في الجسم الحي كانت غير متوفرة. بروتوكول المقدمة يتيح رصد عملية ديناميكية من العدلات فتيلة في الحيوانات التي تعيش من خلال الجمع بين ثلاث منهجيات: 1) عن dsRed إشارة مراسل - تستخدم كمقياس للفتيلة 2) في الجسم الحي العدلات وسم - تحقيق ذلك عن طريق حقن مضان مترافق مكافحة اللمفاويات مستضد 6G (Ly6G) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) و 3) التصوير متحد البؤر حيوي داخلي. وتشارك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول: التي يسببها oxazolone الماوس التهاب الجلد الأذن، والتخدير المناسب للحيوانات، تكرار الحقن المضادة للLy6G ماب، والسابقention التركيز الانجراف أثناء التصوير. على الرغم من أن لوحظ عدد قليل من القيود، مثل الحد من وقت التصوير المستمر (~ 8 ساعات) في الماوس واحد وتسرب ثيوسيانات-ديكستران فلوريسئين من الأوعية الدموية في حالة التهابات، ويوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا للتصوير حيوي داخلي من السلوك معبي العدلة وظيفة، والتي يمكن بسهولة أن توسعت لفحص الخلايا المناعية الأخرى في نماذج التهاب الماوس.
المقدمة
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة وقصيرة الأجل في الدورة الدموية. كانوا يجندون بسرعة إلى مواقع الإصابة أو الإصابات، حيث أنها تخدم البالعات كما المهنية من خلال الافراج عن الأوكسجين والنيتروجين وسيطة رد الفعل جنبا إلى جنب مع حبيبات تحتوي على الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1. خلال تجنيدهم، العدلات هي "تستعد" من قبل مختلف وكلاء بما في ذلك المنتجات الميكروبية، chemoattractants، والسيتوكينات الالتهابية، مما أدى إلى تعزيز ملحوظ وظيفة بلعمية لدى وصوله إلى موقع الالتهاب 2. وقد تم دراسة آليات فتيلة العدلات على نطاق واسع في المختبر 3،4. ومع ذلك، لم يكن رصد دينامية العملية المجراة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة توليدو.
1. Phenotyping من pIL1-عن dsRed الفئران
يتم إنشاؤها النسل عن طريق تربية متخالف الفئران pIL1-عن dsRed مع البرية من نوع الفئران (WT) C57BL6: ملاحظة. تعتبر ثلاثة إلى أربعة أسابيع الجراء القديمة جاهزة للphenotyping. نزيف تحت الفك السفلي من الفئران يتبع بروتوكول المعمول به مع تعديلات طفيفة 23.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تنفيذ فحص pIL1-عن dsRed الفئران على أساس المظهرية عن dsRed إشارة مضان التي تنتجها الكريات البيض في الدم الطرفية الخاصة بهم باستخدام التدفق الخلوي. ومن المعروف LPS تحفيز للحث على إنتاج IL-1β في خلايا الدم النخاعي بما في ذلك العدلات، وحيدات، والخلايا الجذعية 26-28. وبالتالي، يتم تحضين الكريات البيض معزولة مع LPS لمدة 4 ساعة قبل التدفق الخلوي التحليل. بعد ذلك، يتم تعيين النابضة لتعميم خلايا الدم النخاعي استنادا إلى حجم الخلية (FSC) والت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
والهدف من هذه الدراسة هو تطوير التكنولوجيا لرصد عملية فتيلة العدلات في الحيوانات الحية، التي لم يتم الوفاء بها من خلال التقنيات المتاحة حاليا. ولتحقيق هذا الهدف، نفذت ثلاث منهجيات محددة: 1) تحريض التهاب الجلد في IL-1β عن dsRed الفئران مراسل يحركها المروج كمقياس للفتيلة، 2) في الجسم الحي وسم العدلات مع الجرعات المنخفضة من مضان مترافق مكافحة Ly6G ماب، و 3) حيوي داخلي التصوير المجهري متحد البؤر. مزيج من هذه الطرق الثلاث يمكن تصور أنشطة متحركة العدلات معبي (عن dsRed +
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين تضارب مالي في المصالح.
شكر وتقدير
المؤلفون ليس لديهم أي اعترافات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيبارين الصوديوم | APP المستحضرات الصيدلانية | NDC 63323-540-31 | |
| ACK محلول عازلة | لونزا | 10-548E | |
| مصل الأبقار الجنيني | سيجما ألدريتش | F0926 | |
| عديدات السكاريد الدهنية | سيجما ألدريتش | L4391 | |
| هيدروكلوريد الكيتامين | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| زيلازين | مختبر لويد | NADA # 139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| كريم إزالة الشعر | Church & amp دوايت | ||
| أسيتون | فيشر Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة للفأر Ly6G | BioLegend | 127610 | |
| U-100 حقنة الأنسولين مع إبرة 28 جرام | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran ، 150 كيلو دالتون | سيجما ألدريتش | 74817 | |
| مجموعة ضخ الفراشة (إبرة 27 جم) | BD | 387312 | |
| FACSمقياس الخلوي BD | |||
| CellQuest Pro برنامج | BD | ||
| مجهر متحد البؤر | BD Olympus | FV1000 | |
| برنامج Metamorph | التصوير |
المراجع
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
