مقالة منهجية

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

DOI:

10.3791/54072

⸱

أكتوبر 16, 2016

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات البشرية من synoviocytes تشبه الخلايا الليفية المستمدة من المريض، وذلك باستخدام نظام lentiviral دون الخلايا المغذية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجسمية الناضجة يمكن عكسها إلى المحفزة تشبه الخلايا الجذعية دولة باستخدام مجموعة محددة من العوامل برمجة. لقد ولدت العديد من الدراسات التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من مختلف أنواع الخلايا الجسدية من قبل transducing أربعة عوامل النسخ ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4 وج. Myc على. تبقى دراسة iPSCs في طليعة من الأبحاث البيولوجية والسريرية. على وجه الخصوص، iPSCs المريض محددة يمكن أن تستخدم كأداة رائدة لدراسة البيولوجيا المرضية المرض، منذ iPSCs يمكن أن يتسبب من الأنسجة من أي فرد. التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن، مصنفة حسب تدمير الغضروف والهيكل العظمي في مفصل. تضخم الزليلي هي واحدة من الأسباب الرئيسية أو الأعراض التي تؤدي إلى هذه النتائج في التهاب المفاصل الروماتويدي. Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي الخلايا المكونة الرئيسية في الغشاء الزليلي التصنع. FLSs في مفصل تتكاثر دون حدود، في نهاية المطاف غزو cartil المجاورةالعمر والعظام. حاليا، الغشاء الزليلي التصنع يمكن إزالتها إلا عن طريق إجراء العمليات الجراحية. يتم استخدام الغشاء الزليلي إزالة للبحث RA كمادة يعكس حالة التهاب المفصل. كما لاعبا رئيسيا في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي، FLSs يمكن استخدامها كمادة لتوليد والتحقيق في iPSCs من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. في هذه الدراسة، استخدمنا FLSs لمريض التهاب المفاصل الروماتويدي لتوليد iPSCs. باستخدام نظام lentiviral، اكتشفنا أن FLSs يمكن أن تولد RA المريض محددة التوجيهية. وiPSCs الناتجة عن FLSs يمكن مواصلة استخدامها كأداة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الروماتويدي في المستقبل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة هي منصة الجيل القادم في مختلف المجالات السريرية والبيولوجية. وهي أداة الواعدة التي يمكن استخدامها في النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاج الطبي على التجدد. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل رئيسي إلى دراسة وفهم الخلايا المحفزة. ومع ذلك، معزولة عن تدمير الكيسة الإنسان، وترتبط hESCs مع العديد من المخاوف الأخلاقية. في عام 2007، والدكتور شينيا ياماناكا وفريقه عكس عملية برمجة الخلية وتطوير الخلايا الجذعية من البالغين البشري الخلايا الجسدية 1،2. وبالتالي، فخلافا hESCs، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تتولد من الخلايا الجسمية الناضجة، وتجنب العقبات الأخلاقية.

عادة، يتم إنشاؤها iPSCs قبل تسليم أربع جينات الخارجية: Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. يتم تسليم هذه العوامل ياماناكا أصلا باستخدام أنظمة lentiviral وفيروسات. وقد استمدت هذه iPSCs الأولى من الماوس جسدية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية 3. بعد ذلك، تم تطبيق هذه التقنية لالليفية الجلدية الإنسان 1،2. دراسات لاحقة إنشاء بنجاح iPSCs من مصادر مختلفة، مثل البول 4، والدم 5،6، الكيراتينية 7، والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، هناك بعض الخلايا الجسدية التي لم يتم استخدامها في إعادة برمجة، وفحص إمكانيات إعادة برمجة مختلف أنواع الخلايا من أنسجة معينة في حالة المرض، لا تزال هناك حاجة.

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو المرض الذي يمكن أن يصيب جميع المفاصل ويؤدي إلى الظروف الذاتية في الأجهزة الأخرى. RA يصيب حوالي 1٪ من البالغين في العالم المتقدم. وهو مرض شائع نوعا ما، وانتشاره يزيد كل سنة 8. ومع ذلك، RA من الصعب تحديد في المراحل المبكرة وoncebone تدمير يحدث هناك أي علاج يمكن أن استرداد الضرر. وعلاوة على ذلك، نجاعة الأدوية تختلف من مريض لآخر، وأنه من الصعب التنبؤ مسعفالمعهد الوطني للإحصاء ما هو مطلوب. لذلك، هناك حاجة إلى تطوير طريقة فحص المخدرات، ومطلوب مادة الخلية التي يمكن أن تعكس ظروف RA.

Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي مشاركا نشطا الخلوي في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي 9،10. توجد FLSs في بطانة باطنة الزليلي بين الكبسولة المشتركة وتجويف، الذي يشار إليه أيضا باسم الغشاء الزليلي. من خلال دعم الهيكل المشترك وتوفير المواد الغذائية للغضروف المحيطة بها، FLSs عادة ما تلعب دورا حاسما في وظيفة مشتركة والصيانة. ومع ذلك، FLSs في الاتحاد الإقليمي لها النمط الظاهري الغازية. RA FLSs يكون النمط الظاهري للسرطان مثل، في نهاية المطاف تدمير العظام المحيطة بها من انتشار لانهائي 10. مع هذه الخاصية الفريدة، FLSs يمكن استخدامها كمادة الواعدة التي يمكن أن تعكس البيولوجيا المرضية من التهاب المفاصل الروماتويدي. ومع ذلك، ونادرا ما يتم إنتاج هذه الخلايا، والظواهر خلية يغير مثل خلايا تذهب من خلال العديد من المقاطع في في المختبر الظروف. وبالتالي، فإنه يمكن أن يكون معقدا لاستخدام RA FLSs كأداة التي يمكن أن تمثل حالة المريض.

نظريا، يمكن RA iPSCs المستمدة من المريض (RA-iPSCs) تصبح أداة مثالية لفحص المخدرات وإجراء مزيد من البحوث. iPSCs ولدت لديها قدرة التجديد الذاتي ويمكن الحفاظ على وتوسعت في المختبر. مع تعدد القدرات، وهذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في ناضجة خلية غضروفية وخلية عظمية الأنساب، التي يمكن أن تسهم المواد خلية للبحوث محددة في RA وغيرها من الأمراض المرتبطة العظام 11.

في هذه الدراسة، ونحن لشرح كيفية عزل وتوسيع FLSs من الغشاء الزليلي ازالتها جراحيا، وكيفية توليد RA-iPSCs من FLSs باستخدام lentiviruses التي تحتوي على عوامل ياماناكا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: وافق هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC12TISI0861).

1. عزل خلية زليلية والتوسع

  1. خلية زليلية عزل
    1. تعقيم اثنين من أزواج من مقص جراحي وزوج واحد من الملقط.
    2. نقل الأنسجة الزليلي إلى صحن 100 ملم ويغسل مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    3. قطع الأنسجة الدهنية والعظام بقايا مصفر. نقل الأنسجة قلص إلى بئر من لوحة 6 جيدا وإضافة 5 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS).
    4. ختم الأنسجة مع مقص حتى قطع صغيرة بما يكفي لاختراق ماصة للتصرف.
    5. نقل وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنسجة لأنبوب مخروطي 50 مل. حصاد المواد المتبقية عن طريق إضافة 5 مل من DMEM مع 20٪ FBS لوحة 6 جيدا، ثم نقل إلى الأنبوب.
    6. كولاجيناز ذوبان الجليد على الجليد. إضافة كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 0.01٪ وختم الأنبوب مع بارافيلم. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 4 ساعة.
    7. بعد مرور فترة الحضانة، وملء الأنبوب مع DMEM مع 20٪ FBS، حتى الحجم الكلي هو 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج، RT لمدة 10 دقيقة.
    8. إزالة طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 40 مل من وسائل الاعلام لresuspend الكرية.
    9. كرر الخطوات من 1.1.10-1.1.11.
    10. Resuspend وبيليه في 25 مل من DMEM مع 20٪ FBS وانتظر كتل كبيرة من الأنسجة لتنزل الى القاع.
    11. نقل طاف على طبق 100 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 14 يوم.
  2. صيانة خلية زليلية والتوسع
    1. تجاهل وسائل الإعلام المستخدمة من لوحة وغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
    3. اضغط على طبق بلطف وحوالةص الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
    4. إزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 30 مل من DMEM مع FBS 20٪.
    5. نقل الخلايا إلى 3 × 100 مم أطباق، دون ترك أي بقايا المواد المرئية.
    6. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة كل 3 د. انقسام الخلايا في 80٪ confluency باستخدام 1 مل PBS / 1 ملم EDTA. المحافظة حتى مرور 3 قبل الاستخدام. تقسيم كل طبق من الخلايا في 3 أطباق في كل انقسام.
      ملاحظة: بعد وصول مرور 3، الخلايا التي لن يتم استخدامها على الفور يمكن تجميد.

2. إعادة برمجة FLSs عن طريق ترميز Lentiviruses العوامل ياماناكا

  1. تنبيغ (D0)
    1. البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا في وسائط النمو (500 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    2. في اليوم التالي، وإزالة قارورة واحدة من الفيروسة البطيئة التي تحتوي على 4 ياماناكا عوامل هي: Oct4، Klf4، Sox2 وج. Myc على من الفريزر وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية. ملاحظة: تم إنتاج الفيروسة البطيئة من قبل الإجراء الموضح في دراسة سابقة لدينا 11.
    3. في حين ذوبان الفيروس، وتغيير وسائل الاعلام وسائل الاعلام النمو FLS (20٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية في DMEM) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل بروميد hexadimethrine و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
    4. بعد تغيير وسائل الإعلام، إضافة 30 ميكرولتر من الفيروسة البطيئة للخلايا وتخلط بلطف. لتحسين العدوى، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 680 x ج، 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  2. الصيانة حتى إعادة برمجة مرئيا
    1. لمدة 3 أيام، واستبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الإعلام نمو FLS تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
    2. في اليوم التالي، واستبدال وسائل الإعلام مع خليط من وسائط النمو FLS ووسائل الاعلام التوجيهية (نسبة 1: 1) تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
      ملاحظة: يتم إعطاء مكونات وسائل الإعلام التوجيهية في قائمة المواد / المعدات.
  3. خلايا تقسيم لمستعمرة تشكيل
    1. إعداد لوحة 6 جيدا المغلفة vitronectin.
      1. إضافة 60 ميكرولتر vitronectin إلى 6 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. ضع 2 مل من الخليط في كل الآبار واحتضان في RT لا يقل عن 1 ساعة. ملاحظة: إن تركيز عمل vitronectin هو 5 ميكروغرام / مل.
    2. على D5، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
    4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
    5. انقسام الخلايا في 3 نسب مختلفة (1: 3، 1: 6 و 1: 9) لتحقيق confluencies مختلفة. إضافة 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. إضافة 300، 150، و 100 ميكرولتر من الخليط خلية لكل بئر من 6-كذلك لوحة لتحقيق نسبة 1: 3، 1: 6 و 1: 9 على التوالي.
    6. استبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الاعلام التوجيهية حتى تظهر المستعمرات. سوف تظهر المستعمرات بعد حوالي D18. ملاحظة: في هذه المرحلة، المستعمرات IPSC تتعايش مع FLSs غير برمجتها.
  4. مستعمرة قطف
    1. إعداد لوحة 48-جيدا المغلفة vitronectin بإضافة 500 ميكرولتر vitronectin إلى الآبار، واحتضان على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    2. وضع المجهر على مقاعد البدلاء النظيفة، وإزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة.
    3. إزالة حل vitronectin من لوحة 48-جيدا وإضافة 500 وسائل الاعلام التوجيهية ميكرولتر تستكمل مع المرتبطة رو-10MM، ملفوف لفائف تحتوي على البروتين كيناز (ROCK) المانع.
    4. باستخدام طرف 10P ماصة، وقطع جميع أنحاء المستعمرة. نقل مستعمرة التقطت لجانب واحد من لوحة 48-جيدا.
    5. بعد اختيار عدة مستعمرات، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    6. الحفاظ على الخلايا حتى المستعمرات هي إينو الكبيرلاف للنقل. ملاحظة: نحن عادة المسكوب الخلايا عندما يحصل على مستعمرة من الحقل المرئي من المجهر، عندما ينظر إليها في التكبير 100X.

3. المناعي تلطيخ

  1. إعداد الخلية
    1. وضع معقم 18 مم غطاء زجاجي في لوحة 12-جيدا.
    2. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لتبرد وشطف الزجاج غطاء.
    3. استبدال مع 1 مل من / مل vitronectin حل 10 ميكروغرام.
    4. احتضان لوحة في RT لا يقل عن 1 ساعة.
    5. تجاهل الحل vitronectin وiPSCs لوحة في لوحة 12-جيدا المغلفة vitronectin والثقافة لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، وتغيير وسائل الإعلام يوميا.
  2. تلطيخ الخلايا
    1. تجاهل وسائل الإعلام والثقافة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
    2. إصلاح الخلايا في 0.4٪ امتصاص العرق (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق على RT.
    4. إزالة permeabilizationحل وكتلة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 30 دقيقة في RT.
    5. تمييع الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA وفقا للجدول 1. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة على RT.
    6. إضافة الضد الثانوية (المخفف 1: 200)، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT، وتجنب ضوء.
    7. علاج الخلايا مع 1 ميكرولتر / مل دابي لمدة 10 دقيقة.
    8. وضع غطاء زجاجي على أعلى من الزجاج الشرائح مع antifade كاشف واحتضانها في RT لمدة 24 ساعة، وتجنب ضوء.
    9. تحقق من التعبير مع المجهر مضان.

4. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR)

  1. استخراج مرنا من بيليه الخلية باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج 11.
  2. تضخيم [كدنا من 2 ميكروغرام من إجمالي مرنا باستخدام النسخ العكسي 11.
  3. خلط المكونات المطلوبة لPCR باستخدام 2 ميكرولتر من [كدنا تيملوحة (11).
  4. أداء RT-PCR والتحقق من النتائج وفقا لهلام الكهربائي 11.

5. الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب) تلطيخ

  1. iPSCs الثقافة لمدة 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 قبل تلطيخ.
  2. نضح في وسائل الإعلام وإصلاح الخلايا مع PFA 4٪ لمدة 1 دقيقة.
  3. تجاهل تثبيتي، وشطف الخلايا مع عازلة شطف 1X.
  4. إعداد الكواشف لAP تلطيخ. مزيج من المواد الكيميائية في نسبة التالية: سريع الأحمر البنفسج: نفثول AS-BI حل الفوسفات: الماء = 2: 1: 1.
  5. احتضان الخلايا مع حل تلطيخ على RT لمدة 15 دقيقة، وتجنب ضوء.
  6. تجاهل الحل تلطيخ وشطف الخلايا مع العازلة الشطف.
  7. تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمنع جفاف والتحقق من التعبير باستخدام المجهر مشرق الميدان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول لتوليد iPSCs من FLSs باستخدام نظام lentiviral. ويبين الشكل 1A مخطط بسيط للبروتوكول العزلة FLS. وبعد الاستئصال الجراحي للالزليلي، والمفروم النسيج الى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي. وأضاف كولاجيناز لعزل الخلايا من كتل من الأنسجة. وحضنت الخلايا لمدة 14 يوما قبل مزيد من المعالجة. ويبين الشكل 1B مورفولوجية FLSs معزولة. واستمرت الخلايا لمدة 3 مقاطع قبل الاستخدام. مشاركة FLSs...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل اكتشاف iPSCs والعلماء تستخدم أساسا المجالس الاقتصادية والاجتماعية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية والأنساب الخلية الأخرى من خلال التمايز. ومع ذلك، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكتلة الداخلية من الكيسة، وهو الجنين في مرحلة مبكرة. لعزل المجالس الاقتصادية والاجتماعية، وتدمير الكيسة أمر لا مفر منه، ورفع القضايا الأخلاقية التي من المستحيل التغلب عليها. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها خصائص stemness وتعدد القدرات، التي لا يمكن الحصول علي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث الممول من المراكز الكورية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (HI13D2188).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق 100 ممTPP93100
6 آبار لوحةTPP92006
50 مل أنبوب كورنيكالSPL50050
15 مل أنبوب كورنيكالSPL50015
10 مل ماصة يمكن التخلصفالكون 7551
5 مل ماصة فالكون7543
12 بئر لوحةTPP92012
FLS مواد العزل< / قوي>
مقص
ملقط
جراحي DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
Penicilin Streptomycinسيجما ألدريتشP4333
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Life Technologies16000-044
كولاجينازسيجما ألدريتشC6885-100MG
بارافيلمسيجما ألدريتش54956
PBS / 1 ملي مولار EDTALife Technologies12604-039
<مواد توليد القوية >iPSC < / قوية>
DMEMLife Technologies11885
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Life Technologies11140-050
& beta - MercaptoethanolSigma AldrichM3148
PolybreneChemiconTR-1003-G
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP4333
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
Lentivirus
DMEM / F12 ، HEPESLife Technologies11330-057مكون وسائط iPSC (500 مل) مكونات
بيكربونات الصوديوم25080-094iPSC (Conc.: 543 & mu; جم / مل)
سيلينيت الصوديومسيجما ألدريتشS5261iPSC مكون وسائل الإعلام   (Conc.: 14 نانوغرام / مل)
ترانسفيرينسيجما ألدريتشT3705iPSC (Conc.: 10.7 & mu; ز / مل)
أساسي FGF2Peprotech100-18BiPSC المكون الوسائط  (Conc.: 100 نانوغرام / مل)
حياةالأنسولين البشري12585-014مكون وسائط iPSC (Conc.: 20 & mu; جم / مل)
TGF البشري & بيتا ؛ 1Peprotech100-21iPSC مكون الوسائط (Conc.: 2 نانوغرام / مل) حمض
الأسكوربيكسيجما ألدريتشA8960iPSC مكون الوسائط   (Conc.: 64 & mu ؛ جم / مل)
PolybreneChemiconTR-1003
زبدات الصوديومSigma AldrichB5887
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
guality Control Materials< / قوي >
18 مم غطاء زجاجيمتفوقHSU-0111580
4٪ بارافورمالديهايد (PFA)التكنولوجيا & ابتكارBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Vector LabSP-5050
Anti-SSEA4 الأجسام المضادةMilliporeMAB4304
الأجسام المضادةOct4 سانتا كروزSC9081
الأجسام المضادة TRA-1-60MilliporeMAB4360
الأجسام المضادة المضادة ل Sox2Biolegend630801
الأجسام المضادة للأجسام المضادة TRA-1-81MilliporeMAB4381
الأجسام المضادة المضادة ل Klf4Abcamab151733
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الأجسام المضادةالمسبار الجزيئيA11029
Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)مسبار جزيئيA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتانInvitrogenP36934
زجاج منزلق ، مطليHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
الكلوروفورمسيجما ألدريتش366919
إيزوبريبيل كحولميليبور109634
الإيثانولدوكسان64-17-5
RevertAid First Strand (كدنا) مجموعةتوليف Thermo ScientficK1622
i-Taq DNA PolymeraseiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
نجم التحميلداين بيوA750
أغاروزسيجما ألدريتش9012-36-6
1 كيلو بايت (+) علامة سلم الحمض النوويEnzynomicsDM003
الفوسفاتيز القلويةMilliporeSCR004
منها جراحي وسائط مكون وسائط تقنيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  6. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  7. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  8. Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة