Method Article

الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم خطة وبروتوكولا استراتيجيا لتحديد المتغيرات الجينية غير المشفرة التي تؤثر على ربط الحمض النووي لعامل النسخ (TF). يتم توفير بروتوكول تجريبي مفصل لمقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) وتحليل مقايسة ترسيب تقارب الحمض النووي (DAPA) لربط الحمض النووي TF المعتمد على النمط الجيني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما تؤدي الدراسات الجينية القائمة على السكان والأسرة إلى تحديد المتغيرات الجينية المرتبطة إحصائيا بمرض سريري أو نمط ظاهري. بالنسبة للعديد من الأمراض والسمات ، فإن معظم المتغيرات غير مشفرة ، وبالتالي من المحتمل أن تعمل من خلال التأثير على آليات خفية يصعب التنبؤ بها نسبيا والتي تتحكم في التعبير الجيني. هنا ، نصف نهجا استراتيجيا عاما لتحديد أولويات المتغيرات غير المشفرة ، وفحصها من حيث وظيفتها. يتضمن هذا النهج تحديد الأولويات الحسابية باستخدام قواعد البيانات الجينومية الوظيفية متبوعا بتحليل تجريبي للارتباط التفاضلي لعوامل النسخ (TFs) بالأليلات الخطرة وغير المعرضة للخطر. لكل من مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) ومقايسة ترسيب تقارب الحمض النووي (DAPA) للمتغيرات الجينية ، يتم استخدام قليل النوكليوتيد الاصطناعي للحمض النووي (oligo) لتحديد العوامل في التحلل النووي للمرض أو الخلايا ذات الصلة بالنمط الظاهري. بالنسبة ل EMSA ، يتم تحليل قليل النوكليوتيدات مع أو بدون عوامل نووية مرتبطة (غالبا TFs) عن طريق الرحلان الكهربائي غير المتمسخ على هلام بولي أكريلاميد tris-borate-EDTA (TBE). بالنسبة ل DAPA ، ترتبط قليل النوكليوتيدات بعمود مغناطيسي ويتم مسح العوامل النووية التي تربط تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد وتحليلها من خلال قياس الطيف الكتلي أو مع الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم المختزل (SDS-PAGE) متبوعا بتحليل اللطخة الغربية. يمكن استخدام هذا النهج العام على نطاق واسع لدراسة وظيفة المتغيرات الجينية غير المشفرة المرتبطة بأي مرض أو سمة أو نمط ظاهري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التسلسل والدراسات التنميط الجيني أساس، بما في ذلك دراسات الجينوم على نطاق الرابطة (GWAS)، دراسات المرشح مكان، وأعماق التسلسل الدراسات، وقد حددت العديد من المتغيرات الجينية التي ترتبط إحصائيا مع المرض، وسمة، أو النمط الظاهري. وخلافا للتوقعات في وقت مبكر، وتقع معظم هذه المتغيرات (85-93٪) في مناطق غير الترميز ولا تغيير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات 1،2. تفسير وظيفة من هذه المتغيرات غير الترميز وتحديد الآليات البيولوجية وربطها لمرض المرتبطة بها، وقد ثبت سمة، أو النمط الظاهري تحديا 3-6. لقد قمنا بتطوير استراتيجية عامة لتحديد الآليات الجزيئية التي تصل المتغيرات إلى النمط الظاهري وسيط مهم - التعبير الجيني. تم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول والكواشف

  1. عرف النظام تحقيقات الحمض النووي النوكليوتيد للاستخدام في EMSA وضبا.
    1. للحد من البروتين غير محددة ملزمة، تصميم oligos قصيرة (بين 35-45 أزواج قاعدة (بي بي) في الطول) 30، ووضع البديل من مصلحة مباشرة في وسط يحيط بها 17 سنة مضت تسلسل الجيني الذاتية لها. لoligos EMSA، إضافة "fluorophore 5. لoligos ضبا، إضافة علامة 5 "البيوتين.
    2. طلب كل من حبلا الشعور وحبلا لتكملة العكسي. بدلا من....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا القسم، وتقدم نتائج ممثل عن ما يمكن توقعه عند إجراء EMSA أو ضبا، وتباين فيما يتعلق تتميز نوعية المحللة. على سبيل المثال، فقد قيل أن تجميد وعينات البروتين ذوبان عدة مرات قد يؤدي إلى تمسخ. من أجل استكشاف إمكانية استنساخ تحليل EMSA في سياق هذه الدورات "تجميد ذوبان الجليد"، وحضنت اثنين 35 oligos بي بي اختلاف في البديل وراثي واحد مع دفعة واحدة من المحللة النووية التي تم إذابة وإعادة المجمدة لالمبلغ المشار إليه . المرات الشكل 2 يوض.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى الرغم من التقدم في مجال تكنولوجيا التسلسل والتنميط الجيني قد تتعزز بشكل كبير قدرتنا على تحديد المتغيرات الجينية المرتبطة بالمرض، لدينا القدرة على فهم الآليات الوظيفية تتأثر هذه المتغيرات متخلفة. مصدر رئيسي من المشكلة هو أن العديد من المتغيرات المرتبطة المرض تقع في ن على الترميز مناطق الجينوم، والتي تؤثر على الأرجح صعوبة في التنبؤ آليات السيطرة على التعبير الجيني. هنا، نقدم بروتوكول تستند إلى تقنيات EMSA وضبا، والأدوات الجزيئية قيمة لتحديد فريق العمل تعتمد على التركيب ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر إيرين زولر وجيسيكا بيني وليندسي هايز على المدخلات والتوجيه في تطوير البروتوكول. تم دعم MTW جزئيا من قبل NIH R21 HG008186 ومنحة جائزة الوصي من مؤسسة أبحاث مستشفى سينسيناتي للأطفال. تم دعم ZHP جزئيا بواسطة T32 GM063483-13.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

تقنيات مثبط المؤقتة الضرورية المضاد للفطريات

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الحمضالنووي قليلة النوكليوتيدات المتكاملةالمخصصة http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificBP366-500KCl ، ل CE buffer
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080ل CE و NE buffer
EDTA (0.5M) ، درجة الحموضة 8.0Life TechnologiesR1021ل CE و NE و Anneal buffer
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-1كلوريد الصوديوم ، للمخزن المؤقت NE
Tris-HCl (1M) ، درجة الحموضة 8.0InvitrogenBP1756-100للتلدين عازلة
الفوسفات المخزنة الملحية (1x)فيشر ScientificMT21040CMPBS ، لغسل الخلايا
محلول DL-Dithiothreitol (1 M)بريتياز 646563عامل اختزالSigma
كوكتيلThermo Scientific87786يمنع تقويض كوكتيل
مثبط الفوسفاتيز TFs   ؛يمنع Thermo Scientific78420إزالة الفسفرة من TFs
Nonidet P-40 بديلIBI ScientificIB01140NP-40 ، للاستخراج النووي
مجموعة فحص البروتين BCAThermo Scientific23225لقياس تركيز البروتين
Odyssey EMSA BufferKit Licor829-07910يحتوي على جميع المخازن المؤقتة اللازمة EMSA
TBE Gels ، 6٪ ، 12 بئرEC6265BOXInvitrogenل EMSA
TBE Buffer (10x)Thermo ScientificB52لمجموعة بدء تشغيل EMSA
FactorFinderMiltenyi Biotec130-092-318يحتوي على جميع المخازن
ل Licor Odyssey CLxLicorالماسح الضوئي الموصى به ل DAPA / EMSA
المضاد الحيوي المضاد للفطرياتGibco15240-062يحتوي على 10,000 وحدة / مل من البنسلين ، 10,000 & جم / مل من الستربتومايسين ، و 25 & ميكرو ؛ جم / مل من Fungizone & reg ؛
مصل الأبقار الجنينيGibco26140-079FBS ، لوسائط الثقافة
RPMI 1640 MediumGibco22400-071يحتوي على L-glutamine و 25 mM HEPES

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles