مقالة منهجية

شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين

10.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

يونيو 19, 2016

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

في هذه المقالة

ملخص

تنظم جزيئات توجيه المحور العصبي هجرة الخلايا العصبية والملاحة المخروطية المستهدفة. نقدم طريقة قوية ، الاختبار الشريطي ، لتقييم قدرة جزيئات التوجيه على جذب الخلايا العصبية أو صدها. في هذا البروتوكول ، نوضح الاختبار الشريطي من خلال إظهار قدرة FLRT2 على صد الخلايا العصبية الحصين المزروعة.

الملخص

تطور المحاور النامية بنية شديدة الحركة عند طرفها ، تسمى مخروط النمو. يتصل مخروط النمو بالإشارات البيئية خارج الخلية للتنقل في النمو المحوري. النيترين ، الشق ، السيمافورين ، والإفرين هي جزيئات توجيه معروفة يمكنها جذب أو صد المحاور عند الارتباط بالمستقبلات والمستقبلات المشتركة على المحور العصبي. تبدأ المستقبلات المنشطة جزيئات إشارات مختلفة في مخروط النمو التي تغير بنية وحركة الخلايا العصبية. هنا ، نصف البروتوكول التفصيلي لمقايسة الشريط لتقييم قدرة جزيء التوجيه على جذب الخلايا العصبية أو صدها. في هذه الطريقة ، يتم استزراع الخلايا العصبية في الحصين المنفصلة من الفئران E15.5 على أطباق مغلفة بمادة اللامينين تتم معالجتها بخطوط متناوبة من المجال الخارجي للفيبرونيكتين وبروتين الغشاء الغني بالليوسين -2 (FLRT2) والتحكم في البروتين القابل للتبلور لجزء الغلوبولين المناعي G (IgG). تم صد كل من المحاور وأجسام الخلايا بقوة من مناطق الشريط المطلي ب FLRT2 بعد 24 ساعة من الزراعة. أظهر التلوين المناعي باستخدام tau1 أن ~ 90٪ من الخلايا العصبية تم توزيعها على خطوط مغلفة ب FC مقارنة بالخطوط المطلية ب FLRT2-Fc (~ 10٪). تشير هذه النتيجة إلى أن FLRT2 له تأثير مثير للاشمئزاز قوي على هذه الخلايا العصبية. هذه الطريقة القوية قابلة للتطبيق ليس فقط على الخلايا العصبية الأولية المزروعة ولكن أيضا لمجموعة متنوعة من الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا العصبية.

المقدمة

التوجيه محور عصبي هو العملية التي من خلالها الخلايا العصبية التي شكلت حديثا إرسال المحاور الى هدفهم خلال تطوير 1،2 الجهاز العصبي. محاور تطوير تحمل بنية متحركة غاية في غيض التي تسمى مخروط النمو. مخروط النمو الحواس العظة خارج الخلية للتنقل مسار محور عصبي و. جزيئات التوجيه، مثل شق، semaphorin، وephrins، يمكن أن تجتذب أو صد المحاور اعتمادا على تفاعلها مع مستقبلات مناسبة وشارك في المستقبلات على محور عصبي 1،3،4. المستقبلات تنشيط نقل إشارات إلى مخروط النمو التي تؤثر على تنظيم هيكل الخلية من أجل الحركات محور عصبي والنمو مخروط.

وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم عمل جاذبة وطاردة الجزيئات. الكيماوي جاذبة، طارد الحشرات يمكن أن تدار في المتوسط ​​نمو / الثقافة مع التركيز التدرج (على سبيل المثال، غرفة دان أو الشرائح ميكرون) 5،6، في بقعة عالية التركيز من قبل ف الصغير ipette (على سبيل المثال، تحول فحص) 7 أو بتركيز متجانسة من خلال تطبيق الحمام (على سبيل المثال، مخروط النمو انهيار فحص) 8،9.

وتشمل الأساليب الأخرى لفحص شريط أو microcontact الطباعة (μCP)، حيث يتم المغلفة لالكيماوي جاذبة أو طاردة على سطح لوحة باعتبارها الركيزة 10-12. وقد وضعت Thestripe فحص أصلا بونهوفر وزملاؤه في عام 1987 لتحليل رسم الخرائط الطوبوغرافية في فرخ نظام retino-سقفي 13. طريقة الأصلي يتطلب نظام فراغ للبروتينات معطف على الأغشية nucleopore البولي باستخدام مخطط والمصفوفات مزجها. في إصدارات لاحقة، وطبعت البروتينات المؤتلف مباشرة على سطح لوحة الثقافة في نمط شريطية باستخدام فتحة ضيقة المصفوفات السيليكون 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد طبقت المجموعات البحثية المختلفة بنجاح هذا شريط الاختبار لتحليل الأنشطة جزيء التوجيه محور عصبي 16-21.

SS = "jove_content"> وهنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص الشريط الذي يقيس جذب أو تنافر الجزيئات التوجيه محور عصبي للخلايا العصبية الحصين فصلها. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذا الأسلوب في بيئة معملية مجهزة الحد الأدنى. لهذا الاختبار، يتم إنشاء المشارب بالتناوب من ركيزة fluorescently المسمى والبروتين السيطرة على طبق من البلاستيك باستخدام مصفوفة السيليكون مع الشقوق 90 ​​ميكرومتر والمغلفة مع laminin. في مظاهرة لدينا، نأت كانت الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران E15.5 مثقف على بالتناوب المشارب من ectodomain المؤتلف من فبرونيكتين ويسين الغنية بالبروتين 2 الغشاء (FLRT2) والسيطرة على البروتين التيسير 21. بعد 24 ساعة من الثقافة، كل من المحاور والهيئات خلية من الخلايا العصبية نفرت بشدة من المشارب FLRT2. تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة Tau1 كشفت أن ~ تم توزيع 90٪ من الخلايا العصبية في المناطق المغلفة التيسير، مقارنة ب ~ 10٪ على FLRT2-FC، مشيرا إلى أن FLRT2 ديه مثير للاشمئزاز قويوظيفة للعصبونات الحصين 21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة هاماماتسو كلية الطب.

1. إعداد مصفوفات

  1. يغلي 4-8 مصفوفات سيليكون في الميكروويف أو على طبق ساخن لمدة 5 دقائق، والسماح لهم حتى يجف تماما لمدة 1 ساعة تحت تدفق الصفحي (الجانب مخطط متابعة).
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الإجراءات التالية في إطار تدفق الصفحي.
  2. ضربة الهواء المضغوط أو استخدام شريط لاصق شفاف لإزالة أي غبار من الجانب مخطط من المصفوفات. حافظ على الجانب مخطط نظيفة لذلك يمكن أن تتمسك بشدة على سطح اللوحة.
  3. وضع بعناية المصفوفات على أطباق البلاستيك 6 سم عن طريق الضغط بواسطة الإصبع (مصفوفة واحدة لكل طبق، الجانب شريط أسفل). تجنب الحصول على فقاعات الهواء بين المصفوفة والطبق. بمناسبة موقع المشارب على الجانب السفلي من الطبق الثقافة.
  4. إذا فشلت مصفوفة لنعلق، كرر من الخطوة 1.2.

2. الجيل الشريط و laminin طلاء الخلية العصبية الثقافة

  1. إعداد fluorescently المسمى البروتين المؤتلف (25 ميكرولتر كل لحقن [خطوة 2.2] أو 100 ميكرولتر كل لطريقة وضع [خطوة 2.2.1]) عن طريق خلط البروتين-FC الموسومة (10-50 ميكروغرام / مل)، وdye- الفلورسنت مترافق الأجسام المضادة التيسير مكافحة البشري (1-3 نسبة: 30-150 ميكروغرام / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ثم، احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. باستخدام حقنة 22-G، وضخ 25 ميكرولتر من البروتين المؤتلف أعدت في الخطوة السابقة (2.1) من خلال ثقب صغير على جانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1A، 1C، و1E).
    1. بدلا من ذلك، وضع 100 ميكرولتر من البروتين المؤتلف في الشق العلوي من المصفوفة ونضح ما يقرب من نصف الحل من ثقب صغير (الأسهم في الشكل 1A، 1C، و1E)، بحيث يظل البروتين المؤتلف في المناطق المخططة.
  3. احتضان الطبق لمدة 30 ميلن عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  4. وضع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الشق العلوي (الشكل 1B) ونضح من ثقب صغير يقع على الجانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1A، C و E) لإزالة البروتينات المؤتلف غير مرتبط. لا نضح برنامج تلفزيوني تماما، لأن البروتينات سوف تجف. كرر هذه الخطوة مرتين. (3 مرات الكلية)
  5. إزالة بعناية المصفوفة وعلى الفور وضع ~ 100 ميكرولتر من البروتين التحكم (10-50 ميكروغرام / مل، بورتو) لتغطية منطقة مخطط كامل، وخلق طلاء بديل. ثم، واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  6. بعد غسل سطح الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، انه مع معطف ~ 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يجب إذابة Laminin على الجليد لمنع التجمد.
  7. احتضان الطبق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  8. غسل سطح الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة ميدي الثقافةأم. وضع طبق المغلفة مع مستنبت في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. التثقيف الحصين الخلايا العصبية من أجنة الفئران E15.5

  1. الموت ببطء الأم عن طريق خلع عنق الرحم وعزل ثلاثة E15.5 الأجنة.
  2. قطع الجلد والجمجمة sagittally في خط الوسط من الرأس مع مقص، وإزالة المخ باستخدام ملعقة صغيرة. نقل الدماغ بعناية إلى 60 ملم طبق بتري تحتوي على 3 مل من هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS).
  3. باستخدام مشرط، وقطع من نصفي الكرة الأرضية بما في ذلك القشرة، الحصين والمخطط (الشكل 2A). ثم، تشريح خارج منطقة قرن آمون عن طريق إزالة بعناية السحايا، ونقل الأنسجة الحصين تشريح لأنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 2 مل من محلول HBSS، على الجليد (الشكل 2B-C). جمع 6 الحصين من 3 أجنة في الأنبوب، والتي تكفي لزراعة الخلايا العصبية في 8 أطباق.
  4. استبدال Hحل BSS مع حل التربسين / EDTA (2 مل)، واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي.
    ملاحظة: نضح HBSS دون الطرد المركزي وليس صب حل HBSS عن طريق إمالة الأنبوب.
  5. تحييد النشاط التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل بقري جنيني (FBS).
  6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 100 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ويغسل بيليه مع 2 مل من مستنبت. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  7. الماصة الحصين صعودا وهبوطا 10 مرات في مستنبت باستخدام طرف 1،000 ميكرولتر مع وجود ثقب كبير (قطع طرف) لفصل الأنسجة.
  8. تغيير العادية (غير مختصر) طرف 1،000 ميكرولتر والماصة النسيج نأت صعودا وهبوطا للحصول على تعليق وحيد الخلية.
  9. فصل الخلايا واحد من قبل تمريرها من خلال 80-100 ميكرون خلية شبكة مصفاة.
  10. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة تصفيتها في 150 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة طاف بواسطة الشفط، و resuspend بيلوآخرون (الخلايا العصبية) في 2 مل من مستنبت.
  12. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع تلطيخ التريبان الأزرق لتحديد الكثافة وقدرتها على البقاء. ثم، لوحة 10،000 الخلايا العصبية في 150 ميكرولتر من مستنبت لكل مجموعة من تعليق stripes.The يجب أن يوضع بعناية لتغطية منطقة شريط كامل.

4. التصور من أجسام الخلايا والمحاوير التي كتبها المناعي تلطيخ باستخدام-Tau1 مكافحة الأجسام المضادة

  1. بعد 24 ساعة من الثقافة، نضح في والمتوسطة من دون إزعاج الخلايا الملتصقة، وإصلاح الخلايا العصبية مع تسخينه مسبقا لامتصاص العرق 4٪ (PFA) / 4٪ سكروز / برنامج تلفزيوني في RT لمدة 15 دقيقة.
  2. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك، واستخدام القلم المياه طارد لرسم دائرة حول المنطقة المخططة لتقليل كمية من الأجسام المضادة اللازمة.
  3. Permeabilize الخلايا العصبية مع 0.3٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  4. احتضان الخلايا العصبية مع عرقلة الحل تحتوي على 3٪ المصل حمار و 0.1٪ تريتون X-100 ل30 دقيقة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة لمكافحة Tau1 (1: 200) في 1٪ المصل حمار / 0.1٪ تريتون X-100 / PBS O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا العصبية مع المضادة للماوس مفتش الأضداد-fluorophore مترافق في 1٪ زلال المصل البقري (BSA) /0.1٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
  6. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تغطية منطقة شريطية مع 18 ملم × 18 ملم الغطاء الزجاجي باستخدام 50 ميكرولتر من antifade حل. تجنب فقاعات الهواء، والتي تتداخل مع التصوير.
  7. الحصول على صور الفلورسنت مع المجهر مضان باستخدام نظام ملائم، على سبيل المثال، X10 عدسة الهدف، مجموعات تصفية GFP وطلب تقديم العروض، وزمن التعرض 1،000 مللي ثانية (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كانت مطلية الخلايا العصبية قرن آمون فصلها من الفئران E15.5 وتربيتها لمدة 24 ساعة على خطوط fluorescently المسمى السيطرة التيسير (الشكل 3A-C) أو FLRT2-FC (الشكل 3D-F) بالتناوب مع نادي غير المسمى السيطرة. في كلتا الحالتين، كانت الخلايا العصبية مجمعة وامتدت محاور على النحو حزم. على جهاز التحكم المشارب FC / التيسير، تم توزيع الخلايا العصبية بشكل متساو على خطوط fluorescently المسمى وغير المسمى، وقدموه المحاور في اتجاهات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول فحص شريط يستخدم البروتين المؤتلف والخلايا العصبية فصلها عن الحصين E15.5 الماوس. هذا الاختبار يسمح للمراقبة فعالة من ردود مثير للاشمئزاز، جذابة، أو محايدة من الخلايا العصبية إلى البروتين المؤتلف من الاهتمام وضعت في نمط شريطية. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي طريقة بسيطة لتوليد المشارب، والتي تتم طباعة البروتين مباشرة على سطح طبق من البلاستيك، مقارنة مع الطريقة التقليدية، الأمر الذي يتطلب مصفوفات خاصة، نظام فراغ، وغشاء nucleopore 20 21. لجعل خطوط ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل Grants-in-Aid for Scientific Research من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (23700412 و 25122707 و 26670090 إلى S.Y.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي 15 ملViolamo   ؛1-3500-01
4٪ بارافورمالدهيد (PFA)ناكالاي01954-85
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للإنسان IgG الجسم المضادThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 الحمار المضاد للفأر IgG الجسم المضادThermo ScientificA-21203التخفيف 1/500
الأجسام المضادة المضادة ل Tau1ChemiconMAB3420التخفيف 1/200
Antifadeاستخدام وسائط التركيب البديلةThermo ScientificP7481
مكمل B27Thermo Scientific17504-044التخفيف 1/50
ألبومين مصل الأبقارSigma01-2030-2
مصفاة الخلية 100 umBD Falcon352360
آلة الطرد المركزيKubota2410
غطاء زجاجي 18 مم × 18 ممماتسونامي18 × 18 مم رقم 1
قلمDAKO DAKOS2002يمكن استخدام قلم بديل طارد للماء
ريشةمشرط يمكن التخلص منه2975 # 11
FBSThermo Scientific10437-028
مجهر FluorecentنيكونE600
ملقط رقم 5أدوات العلوم الدقيقة11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061التخفيف 1/100
حقنة هاميلتون805N22 مقياس ، 50 ميكرولتر
HBSSThermo Scientific14170-112
Human IgG ، Fc FragmentJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
مصل الحمار العاديجاكسون017-000-121
PBSNacalai14249-24
البنسلين الستربتومايسينالحراري العلمي15070-063التخفيف 1/100
طبق ثقافة بلاستيكي ، 60 مممصفوفات
متوفر وقابل للشراء من البروفيسور مارتن باستماير (bastmeyer@kit.edu)
مجهر ستيريوأوليمبوسSZ61
تلميح ، 1000 uLWatson125-1000S
شريط لاصق شفافTesa57315يمكن استخدام شريط لاصق بديل
Triton X-100SigmaT8787
Trypan blue ، 0.4٪Bio-Rad145-0013
Trypsin / EDTAThermo Scientific25300-054
Culture mediumNeurobasal مكمل ب B27 و GlutaMAX و Penicillin-Streptomycin.
يمكن سيليكون 150288 حراري علمي

المراجع

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FLRT2 Tau1

مقالات ذات صلة