يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

10.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54119

⸱

يوليو 3, 2016

 ,  ,  , 
1Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكول للتقييم الوظيفي للمكتبات موقع واحد التشبع الطفرات شاملة من البروتينات باستخدام الإنتاجية العالية التسلسل. الأهم من ذلك، يستخدم هذا النهج أزواج التمهيدي متعامدة مع تعدد بناء مكتبة والتسلسل. وتقدم ممثل النتائج باستخدام تيم-1 β-اكتاماز المختارة في جرعة ذات الصلة سريريا من الأمبيسلين.

الملخص

لطالما تم استخدام الطفرات الموجهة بالموقع كطريقة لاستجواب بنية البروتين ووظيفته وتطوره. فتحت التطورات الحديثة في تقنية التسلسل المتوازية على نطاق واسع إمكانية تقييم التأثيرات الوظيفية أو اللياقة البدنية لأعداد كبيرة من الطفرات في وقت واحد. هنا ، نقدم بروتوكولا للتحديد التجريبي لتأثيرات جميع طفرات الأحماض الأمينية المفردة المحتملة في بروتين ذي أهمية باستخدام تقنية التسلسل عالية الإنتاجية ، باستخدام إنزيم مقاومة المضادات الحيوية للأحماض الأمينية 263 TEM-1 β-lactamase كمثال. في هذا النهج ، يتم إنشاء مكتبة طفرات تشبع البروتين الكامل بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفرة الموجه للموقع ، وتوزيع كل موضع بشكل عشوائي على حدة لجميع الأحماض الأمينية الممكنة. ثم يتم تحويل المكتبة إلى بكتيريا ، ويتم اختيارها لقدرتها على منح مقاومة للمضادات الحيوية β-lactam. ثم يتم تحديد تأثير اللياقة البدنية لكل طفرة عن طريق التسلسل العميق للمكتبة قبل الاختيار وبعده. الأهم من ذلك ، يقدم هذا البروتوكول طرقا تزيد من عمق قراءة التسلسل وتسمح بالاختيار المتزامن لمكتبة الطفرات بأكملها ، عن طريق خلط المواضع المجاورة في مجموعات من الطول يتم استيعابها بواسطة طول قراءة التسلسل عالي الإنتاجية واستخدام الاشعال المتعامدة لترميز كل مجموعة. يتم توفير النتائج التمثيلية باستخدام هذا البروتوكول من خلال تقييم تأثيرات اللياقة البدنية لجميع طفرات الأحماض الأمينية المفردة في TEM-1 بجرعة ذات صلة سريريا من الأمبيسلين. يجب أن تكون الطريقة قابلة للتمديد بسهولة إلى البروتينات الأخرى التي يوجد فيها اختبار اختيار عالي الإنتاجية.

المقدمة

منذ فترة طويلة استخدمت الطفرات في المختبر لدراسة خصائص النظم البيولوجية وتطورها، وإلى إنتاج بروتينات متحولة أو الكائنات الحية مع وظائف محسنة أو جديدة. في حين اعتمدت النهج في وقت مبكر على الطرق التي تنتج الطفرات العشوائية في الكائنات الحية، وظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف تمكين الباحثين إلى إدخال تغييرات محددة على الحمض النووي بطريقة مواقع محددة، أي، الطفرات موقع الموجه 1،2. مع التقنيات الحالية، وعادة ما تستخدم أليغنوكليوتيد مطفرة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فمن سطحي نسبيا لإنشاء وتقييم أعداد صغيرة من الطفرات (على سبيل المثال، الطفرات نقطة) في جين معين 3،4. ومن أصعب بكثير ولكن عند اقتراب الهدف، على سبيل المثال، إنشاء وتقييم كل شيء ممكن في موقع واحد (أو أكثر حسب الطلب) الطفرات.

في حين عرف الكثير من الدراسات في وقت مبكر محاولة لتقييم أعداد كبيرة من مكانت utations في الجينات التقنيات المستخدمة في كثير من الأحيان شاقة، على سبيل المثال تتطلب تقييم كل طفرة بشكل مستقل باستخدام هراء القامع سلالات 5-7، أو كانت محدودة في قدرتها الكمية نظرا لانخفاض عمق تسلسل سانجر تسلسل 8. وإلى حد كبير محل التقنيات المستخدمة في هذه الدراسات من قبل وسائل الاستفادة من الإنتاجية العالية التكنولوجيا التسلسل 9-12. هذه الطرق بسيطة من الناحية النظرية يؤدي الى ظهور مكتبة تضم عددا كبيرا من الطفرات، إخضاع المكتبة إلى الشاشة أو اختيار وظيفة، ثم أعماق تسلسل (أي، بناء على أمر من> 10 6 التسلسل يقرأ) حصلت المكتبة قبل و بعد الاختيار. في هذه الطريقة، والمظهرية أو الملاءمة آثار عدد كبير من الطفرات، ممثلة على النحو التغيير في تردد السكان في كل متحولة، يمكن تقييمها في وقت واحد وأكثر من الكمية.

قدمنا ​​سابقا المبسطة(. أي كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات) نهج جنيه لتقييم المكتبات من جميع الطفرات الأحماض الأمينية واحدة محتملة في البروتينات، التي تنطبق على الجينات مع طول أطول من التسلسل قراءة طول 11،13: أولا، كل موقف الأحماض الأمينية غير العشوائية بواسطة الموقع الموجه للطفرات PCR. وخلال هذه العملية، يتم تقسيم الجينات في مجموعات مكونة من مواقع متجاورة بطول إجمالي استيعابها عن طريق المنصة التسلسل. المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل مجموعة ثم يتم الجمع، وكل مجموعة تعرض بشكل مستقل لاختيار والتسلسل الإنتاجية العالية. من خلال المحافظة على المراسلات بين موقع الطفرات في تسلسل وطول تسلسل القراءة، وهذا النهج في الاستفادة من زيادة عمق التسلسل: في حين يمكن للمرء أن مجرد تسلسل هذه المكتبات في ويندوز قصيرة دون تقسيم إلى مجموعات (على سبيل المثال، عن طريق بندقية القياسية. نهج التسلسل)، فإن معظم القراءات التي تم الحصول عليها سيكون من النوع البري، وبالتالي مajority من الإنتاجية تسلسل يضيع (على سبيل المثال، لمكتبة التشبع الطفرات كامل البروتين من بروتين حمض أميني 500 التسلسل في 100 حمض أميني (300 بي بي) ويندوز، في الحد الأدنى 80٪ من يقرأ ستكون من النوع البري تسلسل).

هنا، يتم تقديم البروتوكول الذي يستخدم الإنتاجية العالية التسلسل لتقييم وظيفي من كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات، وذلك باستخدام النهج المذكور أعلاه (الموضحة في الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن نقدم استخدام بادئات المتعامدة في عملية الاستنساخ من المكتبة لالباركود كل مجموعة التسلسل، والذي يسمح لها أن تكون المضاعفة في مكتبة واحدة، تخضع في نفس الوقت لفحص أو اختيار، ومن ثم إزالة المضاعفة لتسلسل عميق. منذ لا يتم إخضاع الجماعات تسلسل لاختيار مستقل، وهذا يقلل من عبء العمل ويضمن أن كل طفرة يواجه نفس المستوى من الاختيار. تيم-1 β-اكتاماز، وهو الانزيم الذي يمنح مقاومة رفيع المستوى لوتستخدم المضادات الحيوية β لاكتام (على سبيل المثال، الأمبيسلين) في البكتيريا كنظام نموذج 14-16. يوصف بروتوكول لتقييم مكتبة الطفرات تشبع كامل البروتين من تيم-1 في E. القولونية تحت الاختيار في مستوى مصل تقريبي لجرعة سريرية من الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) 17،18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لمخطط من البروتوكول. تتطلب عدة خطوات والكواشف في البروتوكول تدابير السلامة (المشار إليها ب "تنبيه"). استشارة بيانات سلامة المواد قبل استخدامها. يتم تنفيذ كافة الخطوات بروتوكول في RT ما لم يرد البعض.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام ولوحات

  1. إعداد وتعقيم بواسطة التعقيم 1 لتر الماء النقي، 100 مل سوبر الأمثل مرق (SOB، الجدول 1)، 1 لتر لوريا، Bertani مرق (LB، الجدول 2) و 1 L LB أجار (الجدول 3). إعداد بشكل منفصل وتعقيم ثلاث قوارير الثقافة تحتوي كل منها على 1 لتر LB.
    ملاحظة: طوال يشير البروتوكول "المياه" لتعقيم تعقيم المياه النقية. SOB، LB وLB أجار الرجوع إلى حلول تعقيم الأوتوكلاف.
  2. إعداد 12 ملغ / مل الأسهم من تيت بحل 0.12 غرام التتراسيكلين هيدروكلوريد في 10 مل من الايثانول 70٪. تعقيم باستخدام فلتر 0.2 ميكرون وتخزينهافي 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  3. بارد LB أجار إلى 50 درجة مئوية ثم قم بإضافة 1 مل من الأسهم تيت (تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل تيت). تصب في لوحات بتري وبارد في RT محمية من الضوء. تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.

2. بناء الجامع الجينات التشبع الطفرات مكتبة

ملاحظة: الاشعال. تقارير إنجاز المشروعات المنجزة، هضم تقييد وعملية ربط. وعينات من الحمض النووي النقاء يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

  1. تصميم الاشعال الطفرات
    1. لmutagenize كل موقف الأحماض الأمينية إلى جميع الأحماض الأمينية الممكنة، وتصميم زوج من الاشعال الطفرات التكميلية (معنى / إلى الأمام والعقاقير / عكس) لكل موقف الأحماض الأمينية مع الإرشادات التالية:
      1. استبدال كودون المقابلة لالأحماض الأمينية إلى أن mutagenized التي كتبها كالة أنباء البحرية (حيث N هو خليط من كل القواعد النوكليوتيدات أربعة وS هو خليط من السيتوزين (C) والجوانين (G)) ومركز في متزمتإيه، ويحيط بها ما يقرب من 15 النيوكليوتيدات على كل جانب.
      2. ضمان 5 'و 3' تنتهي تنتهي في C أو G وأن درجة حرارة انصهار (T م) حوالي 70 درجة مئوية 3. استخدام NNS_PrimerDesign.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) لتصميم كالة أنباء البحرية الاشعال الطفرات وفقا لهذه المبادئ التوجيهية.
    2. الاشعال أمر من مصدر تجاري. لسهولة الاستخدام، ومنهم تصنيعه في شكل لوحة 96-جيدا وقبل المخفف في الماء إلى 50 ميكرومتر، مع مجموعة واحدة من لوحات تحتوي على الاشعال الطفرات معنى وآخر الاشعال العقاقير.
    3. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 95 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. تمييع الاشعال 20 أضعاف لتصل إلى 2.5 ميكرومتر باستخدام ماصة الأقنية لنقل 5 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء.
    4. كرربروتوكول خطوة 2.1.3 لتخفيف الاشعال العقاقير الطفرات.
  2. توليف كالة أنباء البحرية مكتبات فرعية لكل موقف الأحماض الأمينية بخطوة اثنين PCR الطفرات موقع الموجه
    1. إجراء الجولة الأولى تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل التمهيدي الطفرات، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام pBR322_AvrII البلازميد كقالب والاشعال AatII_F أو AvrII_R (الاشعال الشعور الطفرات يقترن التمهيدي AvrII_R، والعقاقير الاشعال الطفرات يقترن التمهيدي AatII_F، ما مجموعه 526 تقارير إنجاز المشروعات). انظر جدول المواد للAatII_F وAvrII_R متواليات.
      1. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 4 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 15 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 10 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك طن لوحات PCR.
      2. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
      3. نقل لوحات PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. كرر الخطوات بروتوكول 2.2.1.1 - 2.2.1.3 لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الطفرات العقاقير.
    2. إجراء الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل وظيفة من الأحماض الأمينية، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام بادئات AatII_F وAvrII_R، ومختلطة والمخففة الجولة الاولى المنتجات PCR مطفرة كقالب (ما مجموعه 263 تقارير إنجاز المشروعات).
      1. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 198 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا.
      2. الجمع بين وتمييع 100 أضعاف المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل موقف الأحماض الأمينية باستخدام ماصة الأقنية لنقل الأول 1 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR التي تحتوي على منتجات PCR الناتجة عن الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء. ثم كرر نقل للمنتجات PCR الناتجة عن الاشعال العقاقير الطفرات.
      3. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 5 لأنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 24 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المختلط والمخففة في الدور الاول من المنتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك في لوحات PCR.
      4. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 200 x ج لمدة 2 دقيقة. لوحات نقل إلى thermocycler وتشغيل نفس البرنامج كما في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
    3. تحليل نتائج الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة من قبل الكهربائي للهلام.التأكد من أن جميع المنتجات هي من الحجم الصحيح وتغيب تلوث المنتجات.
      1. إضافة 2 مل من 2X صبغ هلام تحميل لحوض ماصة ثم استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR يحتوي على الجولة الثانية من منتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات 96-جيدا تحتوي على صبغة.
      2. إعداد agarose هلام 1.5٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. تحميل سلم الحمض النووي في الممرات الأولى والأخيرة من كل صف. ثم استخدام ماصة الأقنية لتحميل 10 ميكرولتر من عينات من البروتوكول خطوة 2.2.3.1.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 40 دقيقة وصورة على نقل transilluminator للأشعة فوق البنفسجية.
      5. كرر الخطوات من بروتوكول 2.2.3.2 - 2.2.3.4 حتى يتم تحليل جميع العينات.
    4. بدقة قياس تركيز كل منتج PCR كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
      1. تحويلحوالي 15 مل EB عازلة لحوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 49 ميكرولتر إلى 263 بئرا أكثر من ثلاثة، واضحة لوحات فحص أسفل السوداء الجدران 96-جيدا.
      2. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من كل خطوة الثانية المنتج PCR (بروتوكول خطوة 2.2.2) إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات فحص 96-جيدا.
      3. إعداد المنحنى القياسي تركيز الحمض النووي عن طريق تمييع امدا فج الحمض النووي ل2 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن EB 300 ميكرولتر ثم جعل عشرة التخفيفات شقين (لمجموعه 11 تركيزات). نقل 50 ميكرولتر إلى أحد عشر الأعمدة الأولى من صف واحد من لوحات 96-جيدا فحص من الخطوة السابقة والتي لا تحتوي على عينة. إلى العمود الثاني عشر إضافة 50 ميكرولتر من العازلة EB (الكاشف فارغة).
      4. إعداد dsDNA الكميات كاشف عن طريق إضافة 75 ميكرولتر من كاشف (انظر الجدول المواد) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، ثم إضافة 15 مل من العازلة EB. مزيج من قبل قلب أنبوب، ثم نقل إلى حوض ماصة. حماية كاشف عن الضوء.
      5. استخدام ماصة الأقنية لنقل 50 ميكرولتر من استعداد dsDNA الكميات الكاشف إلى كل بئر من لوحات الفحص. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا. احتضان لوحات في RT لمدة 5 دقائق محمية من الضوء.
      6. قياس مضان من كل عينة باستخدام قارئ صفيحة وموجات فلوريسئين القياسية (الإثارة 485 نانومتر، وانبعاث 520 نانومتر؛ 0.1 ثانية).
      7. طرح قيمة مضان من الفراغ كاشف من جميع العينات. توليد منحنى قياسي من قياسات مضان من العينات لامدا فج. حساب تركيز كل عينة باستخدام القياسات مضان منها والمنحنى القياسي.
  3. استنساخ كالة أنباء البحرية المكتبات الفرعية في ناقلات اختيار
    1. مزيج 100 نانوغرام لكل كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية المنتج PCR إلى خمس مجموعات فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام سالحمض النووي الكميات كاشف.
      ملاحظة: وتتكون كل مجموعة من حوالي 53 وظائف الأحماض الأمينية متجاورة متباعدة على طول تسلسل تيم-1 (مجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية المكتبة 1-5 وتتألف من المناصب 26-78، 79-132، 133-183، 184-236، و 237-290، على التوالي؛ عددهم وفقا الى Ambler وآخرون 19).
    2. إنشاء استنساخ ناقلات لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
      1. إعداد خمسة 100 تقارير إتمام المشروعات ميكرولتر وفقا للجدول رقم 6، باستخدام بادئات AvrII_F وAatII_OP1_R - AatII_OP5_R، والبلازميدات pBR322_OP1-5 كقالب (AatII_OP1_R يقترن pBR322_OP1، وما إلى ذلك).
      2. نقل إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 25 دورة: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية. انظر T قادرة المواد لمتواليات من AatII_R وAvrII_F.
      3. إعداد agarose هلام 1٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      4. إضافة 20 ميكرولتر من 6X صبغ هلام تحميل لكل عينة PCR. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم كل عينة، تخطي واحدة على الأقل بشكل جيد بين العينات.
      5. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة.
      6. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). شرائح المكوس التي تحتوي على المنتج PCR في ~ 3500 سنة مضت. نقل لفصل أنابيب microfuge. ويمكن تخزين شرائح جل في -20 درجة مئوية.
      7. اتباع الإرشادات الصانعين، تنقية العينات باستخدام مجموعة استخراج الهلام وتركيز قياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
    3. لكل من المجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة (بروتوكول خطوة 2.3.1) وناقلات الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3.2)، إعداد تقييد هضم مع AatII وAvrII الانزيمات وفقا لT قادرة 7 احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام quantita dsDNAنشوئها كاشف.
    4. إعداد ردود الفعل ربط التالية الجدول 8 لكل مجموعة فرعية مكتبة هضم تقييد كالة أنباء البحرية مع المشابهة هضم تقييد استنساخ ناقلات (NNS مجموعة فرعية مكتبة 1 مع pBR322_OP1، وما إلى ذلك). في احتضان RT لمدة 1 ساعة. تنظيف ردود الفعل باستخدام طقم تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل الحمض النووي مع 20 ميكرولتر من الماء.
    5. تحويل مجمل ردود الفعل ربط النقاء إلى كفاءة في استخدام مكتبة E. خلايا القولونية التي كتبها Electroporation لل.
      1. ذوبان electrocompetent E. خلايا القولونية ثم خلايا مكان وردود الفعل ربط النقاء على الجليد.
      2. نقل 10 ميكرولتر إذابة الخلايا لكل رد فعل ربط تنقيته ثم نقل إلى كوفيت Electroporation لل. Electroporate عند 1.8 كيلو فولت.
      3. استعادة الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 1 مل SOB. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
      4. و resuspend 10 ميكرولتر من كل ثقافة الانتعاش في 990 ميكرولتر LB. نشر 100 ميكرولتر على LB أجار لوحات جontaining 12 ميكروغرام / مل تيت. احتضان لوحات O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
      5. لكل ثقافة الانتعاش، وإعداد ثقافة قارورة 250 مل مع 50 مل LB و 50 سهم تيت ميكرولتر. نقل إلى قارورة المتبقية ~ 1 مل من ثقافة الانتعاش. احتضان O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (~ 200 دورة في الدقيقة).
    6. حساب عدد من المستعمرات في كل لوحة. احسب عدد transformants ناجحة figure-protocol-1 ، أين figure-protocol-2 هو عدد المستعمرات، figure-protocol-3 هو حجم الثقافة الاسترداد (1000 ميكرولتر) و figure-protocol-4 هو حجم الثقافة الانتعاش مطلي (1 ميكرولتر).
      ملاحظة: لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات، وكقاعدة عامة يجب أن يكون عدد من transformants ناجحة ≥100 أضعاف خلال عدد من الطفرات المتوقعة. كل الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية لديها ~ 53 وظائف، وبالتالي فإن العدد المتوقع من الطفرات هو 53 وظائف × 32 الكودونات / موقف ≈ 1.7 × 10 3؛ لإعطاء حجم مكتبة ≥100 أضعاف (≥1.7 × 10 5) ينبغي أن يكون هناك ≥170 المستعمرات في كل لوحة.
    7. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من ثقافات باستخدام طقم تنقية البلازميد ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA. مزيج معا 100 نانوغرام لكل البلازميد. وهذا يخلق كامل البروتين مكتبة التشبع الطفرات النهائية.

3. اختيار من تيم-1 كامل البروتين التشبع الطفرات مكتبة لمقاومة المضادات الحيوية

  1. إعداد ثقافة الاختيار.
    1. تمييع البلازميد من البروتوكول خطوة 2.3.7 إلى 0.5 نانوغرام / ميكرولتر في الماء ونقل 20 ميكرولتر إلى أنبوب microcentrifuge. أداء التحول، وإعادةcovery، والطلاء ويا النمو / N كما هو موضح سابقا في بروتوكول خطوة 2.3.5، باستثناء نقل 1 ميكرولتر من ثقافة الانتعاش SOB إلى 999 LB. ميكرولتر
    2. حساب عدد من المستعمرات. لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات يجب أن يكون هناك ≥100 المستعمرات، مشيرا إلى ≥10 6 transformants الناجحة (100 × 263 × 32 وظائف الكودونات / موقف ≈ 10 6).
    3. قياس تركيز 50 مل O ثقافة / N.
      1. إعداد فارغة LB بإضافة 1 مل LB إلى كفيت معمل. قياس OD600 على معمل.
      2. تمييع O / N الثقافة 10 ضعفا عن طريق إعادة التعليق 100 ميكرولتر في 900 LB. ميكرولتر قياس OD600. طرح القراءة OD600 من الفراغ وضرب من قبل 10 لإعطاء OD600 من O / N الثقافة.
    4. قبل تسخين قوارير الثقافة ثلاثة من البروتوكول خطوة 1.1 ل~ 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمييع O / N الثقافة إلى OD600 = 0.1 وإضافة 1 مل إلى قارورة واحدة (OD600 النهائي = 0.001). تله هو "ثقافة الاختيار".
    5. احتضان "ثقافة الاختيار" عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة دورية النمو عن طريق قياس OD600 كما هو الحال في البروتوكول خطوة 3.1.3 (ليس من الضروري لتمييع الثقافة 10 أضعاف) حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة).
    6. نقل 100 مل من ثقافة الاختيار لاثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. اختيار المقاومة الأمبيسلين.
    1. في حين ثقافة الاختيار ويحتضنها، وإعداد 50 ملغ الأسهم / مل من الأمبير في المياه عن طريق إذابة 0.5 غرام الأمبيسلين الصوديوم في 10 مل من الماء. تعقيم باستخدام 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. لاثنين من قوارير أخرى، إضافة تيت إلى تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل وحجم الاختيار ثقافة هذا ثا ر OD600 النهائي = 0.001. لقارورة واحدة، إضافة 1 مل أمبير، لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل - وهذا هو "ثقافة الاختيار".
    3. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة نمو ثقافة التي تم إضافتها لا الأمبيسلين في الخطوة السابقة، حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة). في هذا الوقت، وأيضا قياس OD600 من ثقافة الاختيار.
    4. تقسيم OD600 الثقافة التحديد إلى 0.1 وضرب من قبل 100 مل. نقل هذا المجلد (~ 400 مل) إلى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف.
    5. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من الاختيار (بروتوكول خطوة 3.1.6) واختيار (بروتوكول خطوة 3.2.4) الكريات خلية الثقافة ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
TLE "> 4. عالية الإنتاجية تسلسل لتحديد آثار اللياقة البدنية من الطفرات

  1. إعداد عينات للتسلسل عالية الإنتاجية
    1. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر للتخلص من تعدد الجماعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة مع الاشعال المتعامدة
      1. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9؛ نقل 23 ميكرولتر إلى عشرة أنابيب PCR.
      2. إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر النقي DNA البلازميد من ثقافة الاختيار لPCR أنابيب 1-5 ومن ثقافة الاختيار لأنابيب 6-10.
      3. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إلى الأمام الاشعال المتعامدة OP1_F - OP5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال المتعامدة OP1_R - OP5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر إلى أنابيب PCR 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل OP1_F - OP5_F وOP1_R - OP5_R.
      4. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 °؛ مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر لعزل كل من مجموعات مكتبة فرعية كالة أنباء البحرية
      1. تمييع 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.1.4 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام Group1_F - Group5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال Group1_R - Group5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر PCR أنابيب 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل Group1_F - Group5_F وGroup1_R - Group5_R.
      3. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج نفسه كما هو الحال في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
    3. تنفيذ النهائية 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر إضافة تسلسل الفهرسة
      1. ديالعود 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.2.3 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR.
      3. لأنابيب مع قالب القادمة من المجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية 1-5، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب الاشعال إلى الأمام 501_F - 505_F على التوالي. لأنابيب مع قالب الناجمة عن الاختيار والانتقاء الثقافات، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب عكس الاشعال 701_R و702_R، على التوالي. انظر جدول المواد للتسلسل 501_F - 505_F، و701_R و702_R.
      4. نقل أنابيب PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج من الخطوة 2.2.1.3.
    4. خلط وتنقية عينات
      1. تركيزات القياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. مزيج 100 نانوغرام لكل كثافة المنتج PCRالزراعة العضوية أنبوب microcentrifuge واحد.
      2. إعداد agarose هلام 2٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. إضافة 6X صبغ هلام تحميل لالمختلطة PCR المنتجات عينة. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم العينة.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). المكوس شريحة تحتوي على المنتج PCR في ~ 360 نقطة أساس. نقل إلى microfuge أنبوب. هلام شريحة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
      5. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنقية العينة باستخدام مجموعة استخراج الهلام وقياس تركيز باستخدام الكميات كاشف dsDNA. هذه هي العينة النهائية لتسلسل عالية الإنتاجية.
    5. تسلسل على منصة التسلسل الإنتاجية العالية (انظر جدول المواد للمنصة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. حساب تركيز العينة في نانومتر كما figure-protocol-5، حيث figure-protocol-6 هو تركيز العينة في نانوغرام / ميكرولتر و figure-protocol-7 هو طول سلسلة من عينة من الحمض النووي (~ 360 سنة مضت). تمييع العينة إلى 4 نانومتر في المخزن EB.
      2. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لتفسد العينة وتضعف إلى 21:00 في المخزن التهجين.
      3. تحميل 600 ميكرولتر من العينة إلى خرطوشة كاشف. التسلسل التالي تعليمات الشركة الصانعة والمطالبات التي تظهر على الشاشة.
  2. تحليل تسلسل البيانات
    1. تحميل فلاش (سريع طول تعديل قصيرة قراءة) 20، وضع في مجلد مع الملفات fastq.gz تم الحصول عليها من التسلسل.
    2. استخدام فلاش للانضمام الى ملفات fastq.gz المقابلة لنهاية يقترن يقرأ لكل زوج من المؤشرات (إلى الأمام وعكس يقرأ في كل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية للالاختيار والانتقاء الثقافات).
    3. افتح موجه الأوامر وتغيير الدليل إلى مجلد في البروتوكول خطوة 4.2.1. تاريخ كل زوج من يقرأ باستخدام الأوامر: فلاش ، حيث mates1.fastq.gz وmates2.fastq.gz هي الملفات التي تحتوي على الأمام وعكس يقرأ، على التوالي.
  3. بعد انضمام كل زوج من يقرأ، ووضع ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq في مجلدات منفصلة عن النتائج من الاختيار أو التحديد الثقافات. إعادة تسمية ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq وفقا لمجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية التي كان مطابقا (أي، 1.fastq، 2.fastq، وما إلى ذلك).
  4. تشغيل NNS_DataAnalyzer.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) من كل مجلد لحساب التهم لكل طفرة حمض أميني واحد، والتهم لمن النوع البري، لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
  5. حساب تأثير اللياقة البدنية figure-protocol-8 كل طفرة figure-protocol-9 في كل موقف figure-protocol-10 كقاعدة عشرة وغاريتم نسبة من التهم التي تم الحصول عليها في اختيار ( figure-protocol-11 ) مقابل الاختيار ( figure-protocol-12 ) حالة، نسبة إلى البرية من نوع:
    figure-protocol-13 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر - (pBR322_OP5 pBR322_OP1) في الشكل 2A خريطة البلازميد لخمسة البلازميدات pBR322 المعدلة تحتوي على مواقع فتيلة المتعامدة. لاختبار ما إذا الاشعال المتعامدة محددة، أجريت تقارير إتمام المشروعات باستخدام كل زوج من الاشعال المتعامدة على حدة، جنبا إلى جنب مع جميع البلازميدات pBR322_OP1-5 خمسة، أو مع كل البلازميدات ناقص البلازميد مطابقة الزوج التمهيدي متعامد. تم الحصول على المنتج الصحيح فقط عندما أدرج البلازميد مطابقة، وحصلت أي منتج من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا يوصف بروتوكول للأداء التقييم الوظيفي لكامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات، وذلك باستخدام تكنولوجيا التسلسل الإنتاجية العالية. جانب هام من جوانب هذه الطريقة استخدام بادئات المتعامدة خلال عملية الاستنساخ. لفترة وجيزة، وعشوائية في كل موقف من الأحماض الأمينية التي مطفرة PCR، ومختلطة معا في مجموعات من المواقف التي جنبا إلى جنب تسلسل طول واستيعابها من قبل التسلسل الإنتاجية العالية. يتم استنساخ هذه المجموعات في ناقلات البلازميد التي تحتوي على أزواج من المواقع فتيلة المتعامدة، ويخلط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة

شكر وتقدير

R.R. يقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (RO1EY018720-05) ، ومؤسسة روبرت أ. ويلش (I-1366) ، والمركز الأخضر لبيولوجيا الأنظمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شركة TyptoneResearch Products Intl.T60060-1000.0
مستخلص الخميرةمنتجات البحوث الدوليةY20020-500.0
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-212
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP9333-500G
كبريتات المغنيسيومسيجما ألدريتشM7506-500G
أجارفيشر ScientificBP1423-500
التتراسيكلين هيدروكلوريدسيجما ألدريتشT7660-5G
لوحات بتريكورنينج351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
بادئات قليلة النوكليوتيدتقنيات الحمض النووي المتكاملةhttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligosمقياس 25 نانومول ، pBR322_AvrII تحلية قياسية
متوفرة عند الطلبpBR322 بلازميد معدل لاحتواء موقع تقييد AvrII في اتجاه مجرى الجين TEM-1
pBR322_OP1 &ndash ؛ pBR322_OP5متوفرة عند الطلبخمسة بلازميدات pBR322 معدلة يحتوي كل منها على زوج من مواقع التحضير المتعامدة
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةتشتمل New England BiolabsM0491Lعلى 5x PCR عازل ومضافات PCR (محسن GC)
أنبوب مخروطي 15 ملCorning430025
ماصات متعددة القنوات (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
لوحة PCR ، 96 بئرفيشر Scientific14230232
96 ختم لوحة البئرExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well الحرارية cyclerApplied Biosystems4375786
6x هلام تحميل صبغةنيو إنجلاند BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
بروميد الإيثيديومBio-Rad161-0433
مصباح الأشعة فوق البنفسجية (FOTO / Analyst ImageTech)شركة Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96 بئر بجدران سوداء ، لوحات فحص قاعية واضحةCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA كاشفInvitrogenP7581dsDNA ، المستخدم في خطوة البروتوكول 2.2.4
فيكتور 3 فولت قارئ صفيحة دقيقةPerkinElmer
طقم تنقية الحمض النوويZymo ResearchD4003
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةCorning3621
مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجيفيشر ScientificFBUVLS-80
هلام الاغاروز استخراج الحمض النووي عازلةZymo ResearchD4001-1-100
AatIIنيو إنجلاند بيولابزR0117S
AvrIIنيو إنجلاند بيولابسR0174L
T4 DNA ligaseنيو إنجلاند بيولابزM0202S
EVB100 الإشريكية القولونية الكفاءةAvidityEVB100
Electroporator (بكتريا قولونية Pulser)Bio-Rad1652102
كوفيت التثقيب الكهربائيBio-Rad165-2089
مقياس الطيف الضوئي (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
أنابيب مخروطية 50 مل
Corning Macherey-Nagel740588.25
8 أنابيب شريطية PCRجيدة Axygen321-10-551
Qubit dsDNA HS مجموعة الفحصInvitrogenQ32854dsDNA كاشف الكمي
أنابيب فحص QubitInvitrogenQ32856
مقياس الفلور QubitInvitrogenQ32866
ملح الصوديوم أمبيسلينأكرون التكنولوجيا الحيوية50824296
مجموعة كاشف MiSeq v2 (500 دورة)IlluminaMS-102-2003
MiSeq جهاز التسلسل المكتبيIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlبدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يتسلسل على منصة Illumina HiSeq
برنامج FLAShجامعة جون هوبكنز -http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/المصدر لدمج القراءات المزدوجة من بيانات تسلسل
الجيل التالي AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
الكمية الكهربائية طقم تنقية البلازميد 430828 برنامج مفتوح

المراجع

  1. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  2. Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
  3. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
  4. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  5. Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
  6. Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
  7. Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
  8. Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
  9. Fowler, D. M., et al. High-resolution mapping of protein sequence-function relationships. Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).
  10. Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
  11. McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
  12. Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
  13. Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
  14. Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
  15. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  16. Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
  17. Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
  18. Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
  19. Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
  20. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  21. Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
  22. Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
  23. Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
  24. Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقييم كفاءة البروتينبيتا-لاكتاماز TEM-1الطفرات الموجهة للموقعبناء المكتبةالانتقاء بالمضادات الحيويةتحليل التسلسل العميقالبادئات المتعامدةتحويل البلازميد
بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.