بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

منذ فترة طويلة استخدمت الطفرات في المختبر لدراسة خصائص النظم البيولوجية وتطورها، وإلى إنتاج بروتينات متحولة أو الكائنات الحية مع وظائف محسنة أو جديدة. في حين اعتمدت النهج في وقت مبكر على الطرق التي تنتج الطفرات العشوائية في الكائنات الحية، وظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف تمكين الباحثين إلى إدخال تغييرات محددة على الحمض النووي بطريقة مواقع محددة، أي، الطفرات موقع الموجه ^1،2. مع التقنيات الحالية، وعادة ما تستخدم أليغنوكليوتيد مطفرة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فمن سطحي نسبيا لإنشاء وتقييم أعداد صغيرة من الطفرات (على سبيل المثال، الطفرات نقطة) في جين معين ^3،4. ومن أصعب بكثير ولكن عند اقتراب الهدف، على سبيل المثال، إنشاء وتقييم كل شيء ممكن في موقع واحد (أو أكثر حسب الطلب) الطفرات.

في حين عرف الكثير من الدراسات في وقت مبكر محاولة لتقييم أعداد كبيرة من مكانت utations في الجينات التقنيات المستخدمة في كثير من الأحيان شاقة، على سبيل المثال تتطلب تقييم كل طفرة بشكل مستقل باستخدام هراء القامع سلالات ^5-7، أو كانت محدودة في قدرتها الكمية نظرا لانخفاض عمق تسلسل سانجر تسلسل ^8. وإلى حد كبير محل التقنيات المستخدمة في هذه الدراسات من قبل وسائل الاستفادة من الإنتاجية العالية التكنولوجيا التسلسل ^9-12. هذه الطرق بسيطة من الناحية النظرية يؤدي الى ظهور مكتبة تضم عددا كبيرا من الطفرات، إخضاع المكتبة إلى الشاشة أو اختيار وظيفة، ثم أعماق تسلسل (أي، بناء على أمر من> 10 ⁶ التسلسل يقرأ) حصلت المكتبة قبل و بعد الاختيار. في هذه الطريقة، والمظهرية أو الملاءمة آثار عدد كبير من الطفرات، ممثلة على النحو التغيير في تردد السكان في كل متحولة، يمكن تقييمها في وقت واحد وأكثر من الكمية.

قدمنا ​​سابقا المبسطة(. أي كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات) نهج جنيه لتقييم المكتبات من جميع الطفرات الأحماض الأمينية واحدة محتملة في البروتينات، التي تنطبق على الجينات مع طول أطول من التسلسل قراءة طول ^11،13: أولا، كل موقف الأحماض الأمينية غير العشوائية بواسطة الموقع الموجه للطفرات PCR. وخلال هذه العملية، يتم تقسيم الجينات في مجموعات مكونة من مواقع متجاورة بطول إجمالي استيعابها عن طريق المنصة التسلسل. المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل مجموعة ثم يتم الجمع، وكل مجموعة تعرض بشكل مستقل لاختيار والتسلسل الإنتاجية العالية. من خلال المحافظة على المراسلات بين موقع الطفرات في تسلسل وطول تسلسل القراءة، وهذا النهج في الاستفادة من زيادة عمق التسلسل: في حين يمكن للمرء أن مجرد تسلسل هذه المكتبات في ويندوز قصيرة دون تقسيم إلى مجموعات (على سبيل المثال، عن طريق بندقية القياسية. نهج التسلسل)، فإن معظم القراءات التي تم الحصول عليها سيكون من النوع البري، وبالتالي مajority من الإنتاجية تسلسل يضيع (على سبيل المثال، لمكتبة التشبع الطفرات كامل البروتين من بروتين حمض أميني 500 التسلسل في 100 حمض أميني (300 بي بي) ويندوز، في الحد الأدنى 80٪ من يقرأ ستكون من النوع البري تسلسل).

هنا، يتم تقديم البروتوكول الذي يستخدم الإنتاجية العالية التسلسل لتقييم وظيفي من كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات، وذلك باستخدام النهج المذكور أعلاه (الموضحة في الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن نقدم استخدام بادئات المتعامدة في عملية الاستنساخ من المكتبة لالباركود كل مجموعة التسلسل، والذي يسمح لها أن تكون المضاعفة في مكتبة واحدة، تخضع في نفس الوقت لفحص أو اختيار، ومن ثم إزالة المضاعفة لتسلسل عميق. منذ لا يتم إخضاع الجماعات تسلسل لاختيار مستقل، وهذا يقلل من عبء العمل ويضمن أن كل طفرة يواجه نفس المستوى من الاختيار. تيم-1 β-اكتاماز، وهو الانزيم الذي يمنح مقاومة رفيع المستوى لوتستخدم المضادات الحيوية β لاكتام (على سبيل المثال، الأمبيسلين) في البكتيريا كنظام نموذج ^14-16. يوصف بروتوكول لتقييم مكتبة الطفرات تشبع كامل البروتين من تيم-1 في E. القولونية تحت الاختيار في مستوى مصل تقريبي لجرعة سريرية من الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) ^17،18.

ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لمخطط من البروتوكول. تتطلب عدة خطوات والكواشف في البروتوكول تدابير السلامة (المشار إليها ب "تنبيه"). استشارة بيانات سلامة المواد قبل استخدامها. يتم تنفيذ كافة الخطوات بروتوكول في RT ما لم يرد البعض.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام ولوحات

1. إعداد وتعقيم بواسطة التعقيم 1 لتر الماء النقي، 100 مل سوبر الأمثل مرق (SOB، الجدول 1)، 1 لتر لوريا، Bertani مرق (LB، الجدول 2) و 1 L LB أجار (الجدول 3). إعداد بشكل منفصل وتعقيم ثلاث قوارير الثقافة تحتوي كل منها على 1 لتر LB.
   ملاحظة: طوال يشير البروتوكول "المياه" لتعقيم تعقيم المياه النقية. SOB، LB وLB أجار الرجوع إلى حلول تعقيم الأوتوكلاف.
2. إعداد 12 ملغ / مل الأسهم من تيت بحل 0.12 غرام التتراسيكلين هيدروكلوريد في 10 مل من الايثانول 70٪. تعقيم باستخدام فلتر 0.2 ميكرون وتخزينهافي 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
3. بارد LB أجار إلى 50 درجة مئوية ثم قم بإضافة 1 مل من الأسهم تيت (تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل تيت). تصب في لوحات بتري وبارد في RT محمية من الضوء. تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.

2. بناء الجامع الجينات التشبع الطفرات مكتبة

ملاحظة: الاشعال. تقارير إنجاز المشروعات المنجزة، هضم تقييد وعملية ربط. وعينات من الحمض النووي النقاء يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

1. تصميم الاشعال الطفرات
   1. لmutagenize كل موقف الأحماض الأمينية إلى جميع الأحماض الأمينية الممكنة، وتصميم زوج من الاشعال الطفرات التكميلية (معنى / إلى الأمام والعقاقير / عكس) لكل موقف الأحماض الأمينية مع الإرشادات التالية:
      1. استبدال كودون المقابلة لالأحماض الأمينية إلى أن mutagenized التي كتبها كالة أنباء البحرية (حيث N هو خليط من كل القواعد النوكليوتيدات أربعة وS هو خليط من السيتوزين (C) والجوانين (G)) ومركز في متزمتإيه، ويحيط بها ما يقرب من 15 النيوكليوتيدات على كل جانب.
      2. ضمان 5 'و 3' تنتهي تنتهي في C أو G وأن درجة حرارة انصهار (T _م) حوالي 70 درجة مئوية ^3. استخدام NNS_PrimerDesign.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) لتصميم كالة أنباء البحرية الاشعال الطفرات وفقا لهذه المبادئ التوجيهية.
   2. الاشعال أمر من مصدر تجاري. لسهولة الاستخدام، ومنهم تصنيعه في شكل لوحة 96-جيدا وقبل المخفف في الماء إلى 50 ميكرومتر، مع مجموعة واحدة من لوحات تحتوي على الاشعال الطفرات معنى وآخر الاشعال العقاقير.
   3. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 95 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. تمييع الاشعال 20 أضعاف لتصل إلى 2.5 ميكرومتر باستخدام ماصة الأقنية لنقل 5 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء.
   4. كرربروتوكول خطوة 2.1.3 لتخفيف الاشعال العقاقير الطفرات.
2. توليف كالة أنباء البحرية مكتبات فرعية لكل موقف الأحماض الأمينية بخطوة اثنين PCR الطفرات موقع الموجه
   1. إجراء الجولة الأولى تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل التمهيدي الطفرات، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام pBR322_AvrII البلازميد كقالب والاشعال AatII_F أو AvrII_R (الاشعال الشعور الطفرات يقترن التمهيدي AvrII_R، والعقاقير الاشعال الطفرات يقترن التمهيدي AatII_F، ما مجموعه 526 تقارير إنجاز المشروعات). انظر جدول المواد للAatII_F وAvrII_R متواليات.
      1. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 4 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 15 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 10 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك طن لوحات PCR.
      2. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
      3. نقل لوحات PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. كرر الخطوات بروتوكول 2.2.1.1 - 2.2.1.3 لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الطفرات العقاقير.
   2. إجراء الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل وظيفة من الأحماض الأمينية، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام بادئات AatII_F وAvrII_R، ومختلطة والمخففة الجولة الاولى المنتجات PCR مطفرة كقالب (ما مجموعه 263 تقارير إنجاز المشروعات).
      1. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 198 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا.
      2. الجمع بين وتمييع 100 أضعاف المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل موقف الأحماض الأمينية باستخدام ماصة الأقنية لنقل الأول 1 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR التي تحتوي على منتجات PCR الناتجة عن الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء. ثم كرر نقل للمنتجات PCR الناتجة عن الاشعال العقاقير الطفرات.
      3. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 5 لأنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 24 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المختلط والمخففة في الدور الاول من المنتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك في لوحات PCR.
      4. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 200 x ج لمدة 2 دقيقة. لوحات نقل إلى thermocycler وتشغيل نفس البرنامج كما في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
   3. تحليل نتائج الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة من قبل الكهربائي للهلام.التأكد من أن جميع المنتجات هي من الحجم الصحيح وتغيب تلوث المنتجات.
      1. إضافة 2 مل من 2X صبغ هلام تحميل لحوض ماصة ثم استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR يحتوي على الجولة الثانية من منتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات 96-جيدا تحتوي على صبغة.
      2. إعداد agarose هلام 1.5٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. تحميل سلم الحمض النووي في الممرات الأولى والأخيرة من كل صف. ثم استخدام ماصة الأقنية لتحميل 10 ميكرولتر من عينات من البروتوكول خطوة 2.2.3.1.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 40 دقيقة وصورة على نقل transilluminator للأشعة فوق البنفسجية.
      5. كرر الخطوات من بروتوكول 2.2.3.2 - 2.2.3.4 حتى يتم تحليل جميع العينات.
   4. بدقة قياس تركيز كل منتج PCR كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
      1. تحويلحوالي 15 مل EB عازلة لحوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 49 ميكرولتر إلى 263 بئرا أكثر من ثلاثة، واضحة لوحات فحص أسفل السوداء الجدران 96-جيدا.
      2. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من كل خطوة الثانية المنتج PCR (بروتوكول خطوة 2.2.2) إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات فحص 96-جيدا.
      3. إعداد المنحنى القياسي تركيز الحمض النووي عن طريق تمييع امدا فج الحمض النووي ل2 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن EB 300 ميكرولتر ثم جعل عشرة التخفيفات شقين (لمجموعه 11 تركيزات). نقل 50 ميكرولتر إلى أحد عشر الأعمدة الأولى من صف واحد من لوحات 96-جيدا فحص من الخطوة السابقة والتي لا تحتوي على عينة. إلى العمود الثاني عشر إضافة 50 ميكرولتر من العازلة EB (الكاشف فارغة).
      4. إعداد dsDNA الكميات كاشف عن طريق إضافة 75 ميكرولتر من كاشف (انظر الجدول المواد) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، ثم إضافة 15 مل من العازلة EB. مزيج من قبل قلب أنبوب، ثم نقل إلى حوض ماصة. حماية كاشف عن الضوء.
      5. استخدام ماصة الأقنية لنقل 50 ميكرولتر من استعداد dsDNA الكميات الكاشف إلى كل بئر من لوحات الفحص. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا. احتضان لوحات في RT لمدة 5 دقائق محمية من الضوء.
      6. قياس مضان من كل عينة باستخدام قارئ صفيحة وموجات فلوريسئين القياسية (الإثارة 485 نانومتر، وانبعاث 520 نانومتر؛ 0.1 ثانية).
      7. طرح قيمة مضان من الفراغ كاشف من جميع العينات. توليد منحنى قياسي من قياسات مضان من العينات لامدا فج. حساب تركيز كل عينة باستخدام القياسات مضان منها والمنحنى القياسي.
3. استنساخ كالة أنباء البحرية المكتبات الفرعية في ناقلات اختيار
   1. مزيج 100 نانوغرام لكل كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية المنتج PCR إلى خمس مجموعات فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام سالحمض النووي الكميات كاشف.
      ملاحظة: وتتكون كل مجموعة من حوالي 53 وظائف الأحماض الأمينية متجاورة متباعدة على طول تسلسل تيم-1 (مجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية المكتبة 1-5 وتتألف من المناصب 26-78، 79-132، 133-183، 184-236، و 237-290، على التوالي؛ عددهم وفقا الى Ambler وآخرون ^19).
   2. إنشاء استنساخ ناقلات لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
      1. إعداد خمسة 100 تقارير إتمام المشروعات ميكرولتر وفقا للجدول رقم 6، باستخدام بادئات AvrII_F وAatII_OP1_R - AatII_OP5_R، والبلازميدات pBR322_OP1-5 كقالب (AatII_OP1_R يقترن pBR322_OP1، وما إلى ذلك).
      2. نقل إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 25 دورة: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية. انظر T قادرة المواد لمتواليات من AatII_R وAvrII_F.
      3. إعداد agarose هلام 1٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      4. إضافة 20 ميكرولتر من 6X صبغ هلام تحميل لكل عينة PCR. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم كل عينة، تخطي واحدة على الأقل بشكل جيد بين العينات.
      5. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة.
      6. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). شرائح المكوس التي تحتوي على المنتج PCR في ~ 3500 سنة مضت. نقل لفصل أنابيب microfuge. ويمكن تخزين شرائح جل في -20 درجة مئوية.
      7. اتباع الإرشادات الصانعين، تنقية العينات باستخدام مجموعة استخراج الهلام وتركيز قياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
   3. لكل من المجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة (بروتوكول خطوة 2.3.1) وناقلات الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3.2)، إعداد تقييد هضم مع AatII وAvrII الانزيمات وفقا لT قادرة 7 احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام quantita dsDNAنشوئها كاشف.
   4. إعداد ردود الفعل ربط التالية الجدول 8 لكل مجموعة فرعية مكتبة هضم تقييد كالة أنباء البحرية مع المشابهة هضم تقييد استنساخ ناقلات (NNS مجموعة فرعية مكتبة 1 مع pBR322_OP1، وما إلى ذلك). في احتضان RT لمدة 1 ساعة. تنظيف ردود الفعل باستخدام طقم تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل الحمض النووي مع 20 ميكرولتر من الماء.
   5. تحويل مجمل ردود الفعل ربط النقاء إلى كفاءة في استخدام مكتبة E. خلايا القولونية التي كتبها Electroporation لل.
      1. ذوبان electrocompetent E. خلايا القولونية ثم خلايا مكان وردود الفعل ربط النقاء على الجليد.
      2. نقل 10 ميكرولتر إذابة الخلايا لكل رد فعل ربط تنقيته ثم نقل إلى كوفيت Electroporation لل. Electroporate عند 1.8 كيلو فولت.
      3. استعادة الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 1 مل SOB. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
      4. و resuspend 10 ميكرولتر من كل ثقافة الانتعاش في 990 ميكرولتر LB. نشر 100 ميكرولتر على LB أجار لوحات جontaining 12 ميكروغرام / مل تيت. احتضان لوحات O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
      5. لكل ثقافة الانتعاش، وإعداد ثقافة قارورة 250 مل مع 50 مل LB و 50 سهم تيت ميكرولتر. نقل إلى قارورة المتبقية ~ 1 مل من ثقافة الانتعاش. احتضان O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (~ 200 دورة في الدقيقة).
   6. حساب عدد من المستعمرات في كل لوحة. احسب عدد transformants ناجحة ، أين هو عدد المستعمرات، هو حجم الثقافة الاسترداد (1000 ميكرولتر) و هو حجم الثقافة الانتعاش مطلي (1 ميكرولتر).
      ملاحظة: لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات، وكقاعدة عامة يجب أن يكون عدد من transformants ناجحة ≥100 أضعاف خلال عدد من الطفرات المتوقعة. كل الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية لديها ~ 53 وظائف، وبالتالي فإن العدد المتوقع من الطفرات هو 53 وظائف × 32 الكودونات / موقف ≈ 1.7 × 10 ^3؛ لإعطاء حجم مكتبة ≥100 أضعاف (≥1.7 × 10 ⁵⁾ ينبغي أن يكون هناك ≥170 المستعمرات في كل لوحة.
   7. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من ثقافات باستخدام طقم تنقية البلازميد ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA. مزيج معا 100 نانوغرام لكل البلازميد. وهذا يخلق كامل البروتين مكتبة التشبع الطفرات النهائية.

3. اختيار من تيم-1 كامل البروتين التشبع الطفرات مكتبة لمقاومة المضادات الحيوية

1. إعداد ثقافة الاختيار.
   1. تمييع البلازميد من البروتوكول خطوة 2.3.7 إلى 0.5 نانوغرام / ميكرولتر في الماء ونقل 20 ميكرولتر إلى أنبوب microcentrifuge. أداء التحول، وإعادةcovery، والطلاء ويا النمو / N كما هو موضح سابقا في بروتوكول خطوة 2.3.5، باستثناء نقل 1 ميكرولتر من ثقافة الانتعاش SOB إلى 999 LB. ميكرولتر
   2. حساب عدد من المستعمرات. لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات يجب أن يكون هناك ≥100 المستعمرات، مشيرا إلى ≥10 ⁶ transformants الناجحة (100 × 263 × 32 وظائف الكودونات / موقف ≈ 10 ^6).
   3. قياس تركيز 50 مل O ثقافة / N.
      1. إعداد فارغة LB بإضافة 1 مل LB إلى كفيت معمل. قياس OD600 على معمل.
      2. تمييع O / N الثقافة 10 ضعفا عن طريق إعادة التعليق 100 ميكرولتر في 900 LB. ميكرولتر قياس OD600. طرح القراءة OD600 من الفراغ وضرب من قبل 10 لإعطاء OD600 من O / N الثقافة.
   4. قبل تسخين قوارير الثقافة ثلاثة من البروتوكول خطوة 1.1 ل~ 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمييع O / N الثقافة إلى OD600 = 0.1 وإضافة 1 مل إلى قارورة واحدة (OD600 النهائي = 0.001). تله هو "ثقافة الاختيار".
   5. احتضان "ثقافة الاختيار" عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة دورية النمو عن طريق قياس OD600 كما هو الحال في البروتوكول خطوة 3.1.3 (ليس من الضروري لتمييع الثقافة 10 أضعاف) حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة).
   6. نقل 100 مل من ثقافة الاختيار لاثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. اختيار المقاومة الأمبيسلين.
   1. في حين ثقافة الاختيار ويحتضنها، وإعداد 50 ملغ الأسهم / مل من الأمبير في المياه عن طريق إذابة 0.5 غرام الأمبيسلين الصوديوم في 10 مل من الماء. تعقيم باستخدام 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   2. لاثنين من قوارير أخرى، إضافة تيت إلى تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل وحجم الاختيار ثقافة هذا ثا ر OD600 النهائي = 0.001. لقارورة واحدة، إضافة 1 مل أمبير، لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل - وهذا هو "ثقافة الاختيار".
   3. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة نمو ثقافة التي تم إضافتها لا الأمبيسلين في الخطوة السابقة، حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة). في هذا الوقت، وأيضا قياس OD600 من ثقافة الاختيار.
   4. تقسيم OD600 الثقافة التحديد إلى 0.1 وضرب من قبل 100 مل. نقل هذا المجلد (~ 400 مل) إلى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف.
   5. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من الاختيار (بروتوكول خطوة 3.1.6) واختيار (بروتوكول خطوة 3.2.4) الكريات خلية الثقافة ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA.

1. إعداد عينات للتسلسل عالية الإنتاجية
   1. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر للتخلص من تعدد الجماعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة مع الاشعال المتعامدة
      1. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9؛ نقل 23 ميكرولتر إلى عشرة أنابيب PCR.
      2. إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر النقي DNA البلازميد من ثقافة الاختيار لPCR أنابيب 1-5 ومن ثقافة الاختيار لأنابيب 6-10.
      3. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إلى الأمام الاشعال المتعامدة OP1_F - OP5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال المتعامدة OP1_R - OP5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر إلى أنابيب PCR 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل OP1_F - OP5_F وOP1_R - OP5_R.
      4. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 °؛ مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
   2. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر لعزل كل من مجموعات مكتبة فرعية كالة أنباء البحرية
      1. تمييع 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.1.4 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام Group1_F - Group5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال Group1_R - Group5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر PCR أنابيب 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل Group1_F - Group5_F وGroup1_R - Group5_R.
      3. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج نفسه كما هو الحال في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
   3. تنفيذ النهائية 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر إضافة تسلسل الفهرسة
      1. ديالعود 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.2.3 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR.
      3. لأنابيب مع قالب القادمة من المجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية 1-5، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب الاشعال إلى الأمام 501_F - 505_F على التوالي. لأنابيب مع قالب الناجمة عن الاختيار والانتقاء الثقافات، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب عكس الاشعال 701_R و702_R، على التوالي. انظر جدول المواد للتسلسل 501_F - 505_F، و701_R و702_R.
      4. نقل أنابيب PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج من الخطوة 2.2.1.3.
   4. خلط وتنقية عينات
      1. تركيزات القياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. مزيج 100 نانوغرام لكل كثافة المنتج PCRالزراعة العضوية أنبوب microcentrifuge واحد.
      2. إعداد agarose هلام 2٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. إضافة 6X صبغ هلام تحميل لالمختلطة PCR المنتجات عينة. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم العينة.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). المكوس شريحة تحتوي على المنتج PCR في ~ 360 نقطة أساس. نقل إلى microfuge أنبوب. هلام شريحة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
      5. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنقية العينة باستخدام مجموعة استخراج الهلام وقياس تركيز باستخدام الكميات كاشف dsDNA. هذه هي العينة النهائية لتسلسل عالية الإنتاجية.
   5. تسلسل على منصة التسلسل الإنتاجية العالية (انظر جدول المواد للمنصة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. حساب تركيز العينة في نانومتر كما هو تركيز العينة في نانوغرام / ميكرولتر و هو طول سلسلة من عينة من الحمض النووي (~ 360 سنة مضت). تمييع العينة إلى 4 نانومتر في المخزن EB.
      2. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لتفسد العينة وتضعف إلى 21:00 في المخزن التهجين.
      3. تحميل 600 ميكرولتر من العينة إلى خرطوشة كاشف. التسلسل التالي تعليمات الشركة الصانعة والمطالبات التي تظهر على الشاشة.
2. تحليل تسلسل البيانات
   1. تحميل فلاش (سريع طول تعديل قصيرة قراءة) ^20، وضع في مجلد مع الملفات fastq.gz تم الحصول عليها من التسلسل.
   2. استخدام فلاش للانضمام الى ملفات fastq.gz المقابلة لنهاية يقترن يقرأ لكل زوج من المؤشرات (إلى الأمام وعكس يقرأ في كل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية للالاختيار والانتقاء الثقافات). افتح موجه الأوامر وتغيير الدليل إلى مجلد في البروتوكول خطوة 4.2.1. تاريخ كل زوج من يقرأ باستخدام الأوامر: فلاش <mates1.fastq.gz> <mates2.fastq.gz>، حيث mates1.fastq.gz وmates2.fastq.gz هي الملفات التي تحتوي على الأمام وعكس يقرأ، على التوالي.
3. بعد انضمام كل زوج من يقرأ، ووضع ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq في مجلدات منفصلة عن النتائج من الاختيار أو التحديد الثقافات. إعادة تسمية ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq وفقا لمجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية التي كان مطابقا (أي، 1.fastq، 2.fastq، وما إلى ذلك).
4. تشغيل NNS_DataAnalyzer.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) من كل مجلد لحساب التهم لكل طفرة حمض أميني واحد، والتهم لمن النوع البري، لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
5. حساب تأثير اللياقة البدنية كل طفرة كقاعدة عشرة وغاريتم نسبة من التهم التي تم الحصول عليها في اختيار ( ) مقابل الاختيار ( ) حالة، نسبة إلى البرية من نوع:
   .

يظهر - (pBR322_OP5 pBR322_OP1) في الشكل 2A خريطة البلازميد لخمسة البلازميدات pBR322 المعدلة تحتوي على مواقع فتيلة المتعامدة. لاختبار ما إذا الاشعال المتعامدة محددة، أجريت تقارير إتمام المشروعات باستخدام كل زوج من الاشعال المتعامدة على حدة، جنبا إلى جنب مع جميع البلازميدات pBR322_OP1-5 خمسة، أو مع كل البلازميدات ناقص البلازميد مطابقة الزوج التمهيدي متعامد. تم الحصول على المنتج الصحيح فقط عندما أدرج البلازميد مطابقة، وحصلت أي منتج من أي حجم في غيابها (الشكل 2B).

تم إجراء التجربة التمثيلية التالية بروتوكول وصفها في هذا النص (الشكل 1). وبعد تجهيز (قسم البروتوكول 4.2)، 6.2 × 10 6 يقرأ من حالة الاختيار و 6.3 × 10 6 يقرأ من 50 ميكروغرام / مل conditi اختيار الأمبيسلينعلى تم الحصول عليها. التهم التي تم الحصول عليها عن كل الأمينية الطفرة حمضية ناتجة عن حالة الاختيار عرض مميز لوغاريتمي عادي توزيع (الشكل 3A) 13. ما لا يقل عن تهمة واحدة من تسلسل ثقافة الاختيار عن 98.9٪ من الطفرات (58 ليس لديه التهم)، وأكبر من 100 التهم 91.2٪ (465 وأقل من 100 التهم) التي تم الحصول عليها. الشكل 3B يصور تأثير اللياقة البدنية النسبي () لكل طفرة في كل موقف من تيم-1؛ توزيع هو مبين في الشكل 3C. تحت الاختيار في 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، معظم الطفرات لها تأثير اللياقة البدنية محايد أو ما يقرب من محايد (≈ 0، الموافق بكسل البيضاء في الشكل 3B وذروة كبيرة في الشكل 3C). جزء صغير من الطفرات في هذا التركيز يكون لها آثار كبيرة على اللياقة البدنية (<< 0 الموافق بكسل الزرقاء في الشكل 3B والذيل الأيسر في الشكل 3C)؛ إكسب ectedly، وتشمل هذه الطفرات داخل بقايا الموقع النشطة الحفظ جدا (S70، K73، S130، D131، N132، K234 و G236) 13،14. في المقابل، بعض الطفرات تزيد إلى حد كبير لياقة بدنية على أن من تيم-1 (0 >> الموافق بكسل الحمراء في الشكل 3B)، كما كان متوقعا منذ تيم-1 هو كفاءة عالية في التحلل الأمبيسلين ( ≈ 10 7 م -1 ق -1) 14.

يتم عرض الشكل 1. مخطط كامل البروتين التشبع بروتوكول الطفرات لتيم-1 β-اكتاماز تحت الأمبيسلين التحديد. تطبيقات كما هو موضح في بروتوكول بالخط العريض. وتظهر الخطوات البروتوكول مرقمة في اليسار، للإشارة إلى النص الرئيسي.ك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التحقق من متعامد الاشعال الموقع البلازميد المتجهات. خريطة (A) البلازميد لخمسة البلازميدات pBR322 المعدلة تحتوي على مواقع فتيلة المتعامدة (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). وأشار موقع واتجاه مواقع فتيلة المتعامدة. وصفت مواقع عدة مواقع قيود. يتم استنساخ كامل البروتين مكتبة التشبع الطفرات تيم-1 (الذي يشمل كامل تيم-1 الجينات والمروج) في الفترات الفاصلة بين تقييد مواقع AatII وAvrII. الاختصارات: تيت مقاومة التتراسيكلين الجينات، أوري أصل التكرار (ب) تم اختبار كل زوج من الاشعال المتعامدة (OP1-OP5) في PCR يحتوي على جميع البلازميدات pBR322_OP1-5 خمسة (+)، أو مع كل البلازميدات ناقص البلازميد منها (. ˗). يظهر هو بروميد إيثيديومهلام الاغاروز الملون (1٪ ث / ت) محملة كل رد فعل PCR، حجم مفصولة الكهربائي. المنتج حجم المتوقع هو 1628 سنة مضت. المسار الأول هو سلم ال DNA، والمقاسات من المعايير ذات الصلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. نتائج تيم-1-β اكتاماز كامل البروتين التشبع تجربة. (A) رسم بياني يوضح توزيع التهم لكل طفرة الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من التسلسل الإنتاجية العالية للمكتبة من حالة الاختيار. للبساطة، وتظهر الطفرات مع صفر التهم (53 الطفرات) وجود العد من واحد. آثار (B) للياقة البدنية لجميع الطفرات حمض أميني واحد في تيم-1 تحت الاختيار في 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. المعروض البيانات مصفوفة تحتوي على تأثير اللياقة البدنية النسبي () يصور colorimetrically مع الأزرق يمثل تأثير ضار، أحمر له أثر إيجابي والأبيض أي تأثير اللياقة البدنية بالنسبة إلى النوع البري. يتم تلوين الطفرات التي تم الحصول عليها لا تهم من ثقافة الاختيار الأسود. الصفوف تصور مواقع على امتداد سلسلة الابتدائي والأعمدة تشير إلى طفرة في واحد وعشرين الأحماض الأمينية أو وقف كودون (المشار إليها رمز حرف واحد، * هو وقف كودون)؛ وأشار هيكل الثانوي من تيم-1 في الزخارف الحفظ جدا اليسرى وعدة داخل موقع نشط يشار في الحق. (C) الرسم البياني يظهر توزيع الآثار اللياقة البدنية النسبية. أظهرت هي نتائج تلك الطفرات مع> 100 التهم التي تم الحصول عليها من تسلسل ثقافة الاختيار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. سوبر الأمثل مرق (سوب). أسماء الكاشف والكميات المستخدمة في إعداد 100 مل سوب (بروتوكول خطوة 1.1).

الجدول 2. لوريا، Bertani مرق (LB). أسماء الكاشف والكميات المستخدمة في إعداد 1 لتر LB (بروتوكول خطوة 1.1).

أسماء الكاشف الجدول 3. LB أجار. والكميات المستخدمة في إعداد LB أجار (بروتوكول خطوة 1.1).

الجدول 4. الأولى على مدار الطفري PCR ميكس ماجستير. أسماء الكاشف وكميات لإعداد مزيج الرئيسي للجولة الأولى مطفرة PCR (بروتوكول خطوة 2.2.1). مجموع كمية كافية ل290 25 التفاعلات ميكرولتر.

الجدول 5. الجولة الثانية الطفري PCR ميكس ماجستير. أسماء الكاشف وكميات لإعداد مزيج الرئيسي للجولة الثانية مطفرة PCR (بروتوكول خطوة 2.2.2). مجموع كمية كافية ل290 25 التفاعلات ميكرولتر.

الجدول 6. الاستنساخ ناقل PCR. أسماء الكاشف وكميات لإعداد PCR لجعل ناقلات الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3.2).

يساعد على هضم الجدول 7. تقييد. أسماء الكاشف وكميات لهضم تقييد ناقلات الاستنساخ والمجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية (بروتوكول خطوة 2.3.3).

الجدول 8. عملية ربط أسماء الكاشف وكميات لعملية ربط ناقلات الاستنساخ مع المجموعات الفرعية مكتبة هضم تقييد كالة أنباء البحرية في 1: ناقلات 3: إدراج نسبة المولي (بروتوكول خطوة 2.3.4).

الجدول 9. PCR الكواشف لإعداد عينات للتسلسل عالية الإنتاجية. أسماء الكاشف وكميات لإعداد يمزج سيد PCR تستخدم لإزالة مضاعفة مع الاشعال المتعامدة (4.1.1)، وعزل المجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية (بروتوكول خطوة 4.1.2) واضاف تسلسل الفهرسة (بروتوكول خطوة 4.1.3). مجموع كمية كافية لمدة 11 25 التفاعلات ميكرولتر.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة