نقدم نهجا لتصور جزيئات الحمض النووي الكبيرة الملطخة بالبروتين الفلوري (FP-DBP) المربوطة بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) والسطح الزجاجي المطلي بأفيدين وتمتد بتدفقات قص الموائع الدقيقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم استخدام جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على سطح الزجاج الوظيفي في فيزياء البوليمر والكيمياء الحيوية خاصة للتحقيق في التفاعلات بين الحمض النووي وبروتيناته الملزمة. هنا ، نبلغ عن طريقة تستخدم المجهر الفلوري لتصور جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على السطح. أولا ، يتم إيوتينيل الأغطية الزجاجية وتخميلها عن طريق الطلاء بالبولي إيثيلين جلايكول البيوتينيل ، والذي يربط على وجه التحديد الحمض النووي الحيوي عبر روابط بروتين أفيدين ويقلل بشكل كبير من الارتباط غير المرغوب فيه من التفاعلات غير المحددة للبروتينات أو جزيئات الحمض النووي على السطح. ثانيا ، يتم إيوتينيل جزيئات الحمض النووي بطريقتين مختلفتين اعتمادا على أطرافها. يتم تمييز الحمض النووي الحاد ب dUTP الحيوي في نهايته الهيدروكسيل 3 بوصات ، عن طريق النقل الطرفي ، بينما يتم تهجين الحمض النووي النهائي اللزج مع قليل النوكليوتيدات التكميلية البيوتينيل بواسطة DNA ligase. أخيرا ، يجعل تدفق القص الموائع الدقيقة جزيئات الحمض النووي المفردة تمتد إلى أطوالها المحيطية الكاملة بعد تلطيخها بببتيد ربط البروتين الفلوري والحمض النووي (FP-DBP).
المقدمة
وقد استخدمت التصور من جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على الزجاج أو حبة الأسطح للتحقيق في التفاعلات الحمض النووي والبروتينات، وديناميات البروتين على الصخور القائمة على الحمض النووي، 1،2 والفيزياء البوليمر. 3،4 منصة لاحد المربوطة جزيئات الحمض النووي كبيرة لديها عدد قليل متميزة المزايا بالمقارنة مع الطرق الحمض النووي تجميد الأخرى. 5 الأولى، وهو جزيء الحمض النووي كبير المربوطة على سطح يحتوي على التشكل العشوائي لفائف الطبيعية دون تدفق القص، والتي هي ذات أهمية حاسمة لبروتين الحمض النووي ملزم بالاعتراف الموقع الملزمة. ثانيا، فمن السهل جدا لتغيير البيئة الكيميائية حول جزيئات الحمض النووي لسلسلة من التفاعلات الإنزيمية في غرفة التدفق. ثالثا، تدفق القص ميكروفلويديك يدفع الحمض النووي الجزيئي تمتد ما يصل الى 100٪ من طول محيط كامل، والتي من الصعب جدا تحقيقه من خلال استخدام استطالة الحمض النووي بديلة النهج مثل تجميد سطح 6 و الحبس نانوية. 7 وstretche بالكاملويقدم د الحمض النووي جزيء أيضا المعلومات الموضعية التي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تحركات الأنزيمية على خريطة الجينوم.
ومع ذلك، فإن نهج الحمض النووي الربط لديه عيب حرج في أن الصبغة الإقحام مثل يويو-1 يسبب عموما جزيئات الحمض النووي المربوطة لا بد من كسرها بسهولة بواسطة ضوء مضان الإثارة. عموما، جزيئات الحمض النووي كبيرة يجب أن تكون ملطخة صبغة الفلورسنت لرؤية تحت المجهر الفلورسنت. لهذا الغرض، يويو-1 أو غيرها من الأصباغ سلسلة توتو تستخدم في المقام الأول لأن هذه الأصباغ يتألق فقط عندما يقحم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. 8 ومع ذلك، فمن المعروف أن صبغ الإقحام مكرر يسبب الناجم عن ضوء الحمض النووي الصور الانقسام ل من إقحام من fluorophores. 9 علاوة على ذلك، جزيئات الحمض النووي الملون fluorescently المربوطة على سطح أكثر هشاشة منذ التدفقات القص يمكن أن تمارس كسر القوات على التحرك بحرية جزيئات الحمض النووي. لذلك، قمنا بتطوير FP-DBP كرواية DNA-تلطيخ صبغ البروتين لتصوير جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على السطح. وميزة استخدام FP-DBP هو أنه لا يسبب الصور انشقاق من جزيئات الحمض النووي التي فإنه يلزم 10 وبالإضافة إلى ذلك، FP-DBP لا يزيد طول كفاف من الحمض النووي، في حين الأصباغ الإقحام مكرر زيادة طول محيط بنحو 33٪.
هذه طريقة الفيديو يقدم المنهج التجريبي لالربط جزيئات الحمض النووي كبيرة على سطح PEG-البيوتين الشكل 1 يوضح نهج مختلفة من الربط الحمض النووي مع نهايات حادة ونهايات لزجة. وبالتالي، يمكن تطبيق هذه الطريقة تلطيخ إلى أي نوع من جزيء الحمض النووي الشكل 2 يصور التمثيل التخطيطي للجمعية غرفة التدفق التي يمكن السيطرة عليها من قبل ضخ حقنة لتوليد تدفقات القص لتمتد جزيئات الحمض النووي وكذلك لتحميل الكيميائية وانزيم الحلول. يوضح الشكل (3) الميكروسكوب من جزيئات الحمض النووي بكامل طاقتها المربوطة على PEGylatسطح الطبعة 11 وملطخة FP-DBP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الحمض النووي Biotinylation
- Biotinylation من الحمض النووي العضوية صريحا باستخدام محطة ترانسفراس (TDT)
ملاحظة: استخدام T4 الحمض النووي (166 KBP)، وهو الحمض النووي العضوية حادة.- إضافة 5 ميكرولتر من 2.5 ملي كوكلي 2، 5 ميكرولتر من 10 × رد فعل العازلة، 0.5 ميكرولتر من 10 ملي البيوتين-11-dUTP، 0.5 ميكرولتر من ترانسفيراز الطرفي (10 وحدة)، و 0.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى خليط التفاعل. جعل إلى وحدة تخزين النهائي من 50 ميكرولتر من خلال إضافة 38.5 ميكرولتر من المياه.
- احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: تمديد فترة رد الفعل قد تنتج الحمض النووي المزدوج المربوطة، أي أنه من الممكن أن biotins والموسومة عند كلا الطرفين. - وقف رد فعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة (8).
- الحفاظ على أنبوب في 4 درجات مئوية.
- Biotinylation من الحمض النووي العضوية لزجة عن طريق الحمض النووي يغاز
ملاحظة: استخدام λ الحمض النووي (48.5 KBP)، وهو الحمض النووي لزجة نهاية. <رأ> - إضافة 1 ميكرولتر من يغاز T4 DNA، 5 ميكرولتر من العازلة ربط 10 ×، 1 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر الحمض النووي λ فج، وإضافة 43 ميكرولتر من الماء لجعل الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
- الحفاظ على أنبوب في 4 درجات مئوية.
2. Functionalized اشتقاق السطحية
ملاحظة: من أجل حبل حدا لجزيء الحمض النووي على سطح الزجاج، وsilanized مجموعة الأمينات الأولية على ساترة تليها البيوتين PEG الطلاء كما هو مبين في الشكل رقم 1 هذه العملية من مضاد مهمة لجزيء واحد التصوير الحمض النووي لأنه يمكن أن تقلل بشكل كبير من الضوضاء العشوائية التي تم إنشاؤها عن طريق الحجز من جزيئات غير مرغوب فيها على السطح.
- سمكة البيرانا تنظيف
ملاحظة: الحلول سمكة البيرانا تتفاعل بقوة مع المواد العضوية، ولذلك يجب التعامل معها بحذر، بعد إرشادات السلامة المناسبة.- مكان coverslips على (PTFE) رف تترافلوروإيثيلين، ويحملهم بذ PTFE موضوع ختم الشريط بالطول، نصف على حافة السطوح ونصف على الرف. بعد التفاف، وترك قطعة طويلة (~ 5 سم) من الشريط للتعامل مع رف أثناء إجراء التنظيف.
- ملء كوب زجاج 1 لتر مع 350 مل من H 2 SO 4 و 150 مل من H 2 O 2 لجعل الحل البيرانا في غطاء الدخان. وضع رف في حل سمكة البيرانا لمدة 2 ساعة.
- حل فارغة سمكة البيرانا من الدورق، وcoverslips شطف جيدا بالماء منزوع الأيونات حتى درجة حموضة الماء في الكأس يصل محايد. استخدام الشرائط ورقة الرقم الهيدروجيني.
- يصوتن رفوف من زلات غطاء في الماء دورق يحتوي على، لمدة 30 دقيقة. المياه الفارغة من الكأس قبل silanization الأمينية. استخدام 75 W السلطة صوتنة لتنظيف وderivatize ركائز الزجاج.
- Aminosilanization على سطح الزجاج
- إضافة 2 مل من N - [3- (trimethoxysilyl) بروبيل] الإيثيلين و 10 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 200 ملمن ميثيل الكحول في وعاء البولي بروبلين نظيفة لإعداد الحل aminosilanization.
- ضع coverslips تنظيفها في حاوية البولي بروبلين. يهز لهم في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- يصوتن الكأس مع زلات غطاء derivatized لمدة 15 دقيقة في 75 دبليو يهز لهم في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تفريغ الحل من الكأس، وشطف coverslips بعناية، مرة واحدة مع ميثيل الكحول، ومرتين مع الكحول الإيثيلي. متجر coverslips في الكحول الإيثيلي واستخدامها في غضون أسبوعين.
- من مضاد ساترة
- جعل 10 مل من 0.1 M بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3). تصفية حل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
- حل 2 ملغ من كربونات البيوتين PEG-succinimidyl (البيوتين PEG-SC) و 80 ملغ من فاليرات PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) في 350 ميكرولتر من NaHCO 3. استخدام أنبوب حماية خفيفة.
- دوامة أنبوب بقوة لمدة 10 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي أنه في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الفقاعات.
- شطف شريحة زجاجية مع الأسيتون، تليها الشطف مع الكحول الإيثيلي. تسمح الشريحة في الهواء تجف تماما.
- وضع قطرة (50 ميكرولتر) من حل PEG على شريحة زجاجية نظيفة. تغطية قطرات بلطف مع الأمينية silanized انزلاق الغطاء، دون إحداث أي فقاعات.
- مكان الشرائح لمدة 3 ساعة ليلة وضحاها في الظلام، و-جهت كذلك غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. استخدام حامل ماصة فارغة بوصفها الدائرة، مع الماء في القاع. ختم حل PEG المتبقي في الأنبوب والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.
- شطف ساترة مضاد للفيروسات جيدا بالماء منزوع الأيونات. تخزينها في مكان مظلم وجاف حتى الاستخدام.
3. تجميع الدائرة التدفق
- افتعال حامل الاكريليك لكمات، كما في الشكل (2). تأكد من أن قطر إدراج الأنابيب هو 0.762 ملم، وتعيين ثقب واحد هو مدخل والآخرمنفذ (الشكل 2).
- وضع الوجهين شرائط الشريط لزجة (عرض 5-6 ملم) على حامل الاكريليك (الشكل 2)، محاذاة عموديا إلى مدخل ومخرج حفرة، وليس تكدير أي ثقوب القناة. استخدام هذه الشرائط الشريط كما الجدران متعدد القنوات لجعل الدوائر. فرك الشريط باستخدام طرف الماصة.
- وضع ساترة مضاد للفيروسات على رأس لجعل غرف التدفق، مع الجانب مضاد للفيروسات لأسفل.
- لمنع أي حل من التسرب، اضغط على أعلى ساترة فوق المنطقة حيث يتم وضع الأشرطة على الوجهين. إضافة سريع الجافة الغراء الايبوكسي لإغلاق حواف الدائرة في أعلى وأسفل (اللون الأصفر في الشكل 2).
- قم بتوصيل قطعة قصيرة (2.5 سم) من أنابيب (القطر الخارجي، OD، 0.042 ") لحقنة الغاز محكم وختم مشترك مع الغراء الايبوكسي.
- توصيل أنابيب مرنة طويلة (OD: 0.03 ") إلى أنابيب مرتبطة حقنة وختم مشترك مع الغراء الايبوكسي.
- ملء TUBIترتبط نانوغرام إلى الحقنة بالماء DI. تأكد من وجود أي فقاعة الهواء.
- إدراج الأنابيب في الحفرة من غرفة التدفق مختومة مع الغراء الايبوكسي.
- وضع تلميح الأصفر (200 غيض ميكرولتر) على ثقب آخر كمستودع.
4. تحميل نموذج في غرفة تدفق
ملاحظة: يمكن استبدال Neutravidin مع البروتينات أفيدين أخرى مثل streptavidin. كل ردود الفعل لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة، ما لم يتم ذكر ذلك. أخذ محلول العينة في تلميح الأصفر، وتثبيت طرف مع الحل على ثقب حامل الاكريليك (الشكل 2B).
- ضبط معدل تدفق ضخ حقنة في 50 ميكرولتر / دقيقة. تحميل 20 ميكرولتر من البروتين أفيدين (25 ميكروغرام / مل في حل T50، تريس 10 مم، كلوريد الصوديوم 50 ملي، ودرجة الحموضة 8)، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة.
- تحميل 20 ميكرولتر من oligodeoxynucleotides المعقدة البيروكسيديز (100 ميكرومتر في 1 × TE)، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة. إذا تم استخدام ترانسفيراز الطرفي، تخطي تحميلمن oligodeoxynucleotides.
- تحميل 20 ميكرولتر من محلول الحمض النووي من الخطوة 1 إلى غرفة التدفق بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة، والحفاظ عليه لمدة 30 دقيقة.
- غسل غرفة التدفق مع 1 × TE، وتحميل 40 ميكرولتر من FP-DBP 10 (~ 80 نانومتر).
- مراقبة الحمض النووي تحت المجهر الفلورسنت مع استمرار تدفق الجزيئات تلطيخ في 1 × TE على 60X عدسة الهدف. استخدام 488 نانومتر ليزر الحالة الصلبة لإثارة FP (EGFP) -DBP. على امتداد كامل من جزيئات الحمض النووي، وتطبيق معدلات تدفق مختلفة وفقا لأطوال الحمض النووي المستخدمة. على سبيل المثال، تطبيق 50 ميكرولتر / دقيقة 48.5 KBP من الحمض النووي λ، و 100 ميكرولتر / دقيقة 166 KBP من T4 DNA.
- لإعادة تدوير حامل الاكريليك، نقع غرف تدفق تجميعها في حل المنظفات المنزلية 12. إزالة الأشرطة والايبوكسي بشفرة حلاقة وفرك مع يد لنقلهم تماما. تنشيط ثقوب الإبر مع حقنة. إبقاء أصحاب في الماء منزوع الأيونات حتى استخدامها مرة أخرى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 طريقتين مختلفتين الحمض النووي الربط اعتمادا على هياكل محطة للجزيء الحمض النووي. ويوضح الشكل 1A كيفية تهجين جزيئات الحمض النووي العضوية لزجة مع [أليغنوكليوتيد المعقدة البيروكسيديز يكمل بعضها بعضا ثبتوا على سطح PEG المغلفة أفيدين. 1B الشكل يوضح إضافة البيروكسيديز ddNTP أو dNTP إلى مجموعة الهيدروكسيل من الحمض النووي العضوية حادة من قبل ترانسفيراز الطرفي 3 '. واضاف نحن linkers مرنة بي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم منبرا لتصور جزيئات الحمض النووي طويلة البيروكسيديز لترسيخ على الأسطح. لقد ذكرت هذا النهج لجزيئات الحمض النووي المربوطة على سطح البروتين أفيدين المغلفة مع المعقدة البيروكسيديز ألبومين المصل البقري. 6 في النهج السابق، وجدنا القضية الحاسمة من الحمض النووي الصور الانقسام الناجم عن الأصباغ مكرر إقحام أن وصمة عار جزيئات الحمض النووي المربوطة على سطح. ولما كانت هذه fluorophores متحمس باستمرار لديهم احتمال كبير للهجوم على العمود الفقري الحمض النووي الفوسفات، 9
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منحة أبحاث جامعة سوغانغ لعام 201410036.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1. بيوتينيل الحمض النووي< / قوي > | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | مزود بمحلول تفاعل 10x ، 2.5 ملي مولار كلوريد الكوبالت |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP متاح أيضا |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | سيجما ألدريتش | E6758 | EDTA |
| <قوي>1.2) بيوتينيل الحمض النووي النهائي اللزج باستخدام DNA Ligase< / strong> | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | مزود بعازلة تفاعل 10x |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | متوفر أيضا في New England Biolabs |
| <قوي>2. اشتقاق السطح الوظيفي < / قوي > | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 مم × 22 مم ، رقم 1 سمك |
| رف | مخصص | ||
| PTFE شريط ختم الخيط | هان يانغ الكيميائية المحدودة | 3032292 | تفلون & تجارة شريط |
| حامض الكبريتيك | جين للكيماويات المحدودة | S280823 | H2< / sub>SO4< / sub> ، 95٪ نقاء |
| بيروكسيد الهيدروجين | جين الكيميائية المحدودة. | H290423 | H2O2 ، 35٪ في المياه |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | منظف بالموجات فوق الصوتية على الطاولة |
| M300318 | 99.9٪ | ||
| حاوية بولي بروبلين | Qorpak | PLC-04907 | |
| الكحول الإيثيلي | جين الكيميائية المحدودة | A300202 | 99.9٪ نقاء |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| مرشح حقنة | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| شركة الأسيتون | جين للكيماويات المحدودة | A300129 | نقاء 99 |
| ٪ | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~ 76 مم × 26 مم × 1 & nbsp ؛ مم |
| أكريليك دعم | تصنيع مخصص | ||
| شريط على الوجهين | 3M | نوع شفاف | |
| الجفاف الايبوكسي | 3M | ||
| أنابيب البولي إيثيلين | كول بارمر | 06417-11 ، 06417-21 | |
| غاز ضيق 250 & ل حقنة | هاميلتون | 81165 | |
| مضخة حقنة | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| <قوي>4. تحميل العينة في غرفة التدفق< / قوي> | |||
| نيوترافيدين | حراري علمي | 31000 | |
| قاعدة تريس | سيجما-ألدريتش | T1503-5KG | تريزما |
| مجهر | أوليمبوس | IX70 | |
| EMCCD كاميرا | Q التصوير | روليرا EM-C2 | |
| ليزر الحالة الصلبة (488 & nbsp; نانومتر) | أوكسسيوس | LBX488 | |
| شركة ألكونوكس | ألكونوكس |
المراجع
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
- Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
- Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
- Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
- Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
- Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
