مقالة منهجية

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات في فيفو

DOI:

10.3791/54142

⸱

يونيو 19, 2016

 ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning, Beijing Normal University, 2Department of Biomedical Science, The University of Sheffield

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح الأقطاب الكهربائية الدقيقة الحادة التوصيف الفيزيولوجي الكهربي الدقيق للمستقبلات الضوئية وإخراج الخلايا العصبية الداخلية البصرية في ذبابة الفاكهة الحية. نوضح هنا كيفية استخدام هذه الطريقة لتسجيل استجابات الجهد عالية الجودة للخلايا الفردية لتحفيز الضوء المتحكم فيه. هذه الطريقة مثالية لدراسة معالجة المعلومات العصبية في عيون الحشرات المركبة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يمكن تسجيل استجابات

بدقة استجابات الجهد للمستقبلات الضوئية للحشرات والخلايا العصبية الداخلية البصرية باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الحادة التقليدية. تمكن الطريقة الموضحة هنا الباحث من قياس الاستجابات عالية الجودة داخل الخلايا طويلة الأمد (من دقائق إلى ساعات) من ذبابة الفاكهة R1-R6 المستقبلات الضوئية المفردة والخلايا أحادية القطب الكبيرة (LMCs) إلى محفزات الضوء. نظرا لأن نظام التسجيل يحتوي على ضوضاء منخفضة ، فيمكن استخدامه لدراسة التباين بين الخلايا الفردية في عين الذبابة ، وكيف تعكس مخرجاتها الخصائص الفيزيائية للبيئة البصرية. نحدد جميع الخطوات الرئيسية في تنفيذ هذه التقنية. يتم وصف الخطوات الأساسية في إنشاء إعداد الفيزيولوجيا الكهربية المناسب للتسجيل ، مثل تصميم واختيار المعدات التجريبية. نوضح أيضا كيفية التحضير للتسجيل عن طريق عمل أقطاب كهربائية مرجعية مناسبة (حادة) ومرجعية (حادة). يتم تقديم تفاصيل حول كيفية إصلاح ذبابة سليمة في حامل ذبابة مخصص ، وإعداد نافذة صغيرة في عينها وإدخال قطب تسجيل من خلال هذه الفتحة بأقل قدر من الضرر. نوضح كيفية توطين مركز المجال الاستقبالي للخلية ، وتكييف الخلية المدروسة مع الظلام أو الضوء ، وتسجيل استجابات الجهد لمحفزات الضوء الديناميكية. أخيرا ، نصف معايير التسجيلات العادية المستقرة ، ونظهر استجابات الجهد عالية الجودة المميزة للخلايا الفردية لمحفزات الضوء المختلفة ، ونحدد بإيجاز كيفية تحديد أداء الإشارات الخاص بها. العديد من جوانب الطريقة صعبة من الناحية الفنية وتتطلب الممارسة والصبر لإتقانها. ولكن بمجرد تعلمها وتحسينها للأهداف التجريبية للمحقق ، فإنها تمنح بيانات فيزيولوجية عصبية رائعة في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) مجمع العين هو نظام نموذج رائع للتحقيق في التنظيم الوظيفي للمبصرة وعصبون المصفوفات لأخذ العينات صورة العصبية وتجهيزها، ولرؤية الحيوانات. النظام لديه مخطط الأسلاك الأكثر اكتمالا 1،2 وودي إلى التلاعب الجيني ودقيقة للرصد النشاط العصبي (ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء والوقت قرار) 3-10.

العين ذبابة الفاكهة هي وحدات، والتي تحتوي على 750 ~ الهياكل المغطاة عدسة على ما يبدو العادية يسمى ommatidia، والتي توفر معا تطير المجال البصري بانورامية التي تغطي الاتجاه تقريبا في جميع أنحاء رأسه. المعلومات الأولية العين أخذ العينات وحدات هي خلايا مستقبلة للضوء رابدوميريك لها 7،8،11. كل مقيلة يحتوي على ثمانية خلايا مستقبلة للضوء (R1-R8)، التي تشترك في نفس العدسة الوجه ولكن الانحياز إلى سبعة اتجاهات مختلفة. في حين أن خلايا مستقبلة للضوء الخارجي R1-R6 عالبريد الأكثر حساسية للضوء الأخضر والأزرق والحساسيات الطيفية للخلايا الداخلية R7 وR8، التي تقع فوق بعضها البعض، وأشر إلى نفس الاتجاه، المعرض ثلاثة أنواع فرعية مميزة: شاحب والأصفر وظهري منطقة حافة (DRA) 12- 15.

figure-introduction-1
الشكل 1. منظمة الوظيفية من ذبابة الفاكهة العين. (أ) أول اثنين من العقد البصري، شبكية العين والصفيحة، ويسلط الضوء في الرمادي داخل العين الطاير. مبصرات شبكية العين R1-R6 والصفيحة خلايا القطب كبيرة (LMCs: L1-L3) يمكن الوصول إليها بسهولة في الجسم الحي إلى تسجيلات مسرى مكروي حادة التقليدية. القطب التخطيطي يسلط الضوء على مسار طبيعي للتسجيل من R1-R6 في شبكية العين. مسار واحد لتسجيل من LMCs في الصفيحة هو التحول في مواز القطب إلى اليسار. (ب) صفيحة هو مصفوفة من الجهاز retinotopicallyخراطيش أوتوماتيكية، كل واحدة منها هي معبأة مع الخلايا العصبية التي بمعالجة المعلومات من منطقة صغيرة محددة في الفضاء البصري. بسبب تراكب العصبي، ست خلايا مستقبلة للضوء من ommatidia المجاورة مختلفة ترسل محاور منها (R1-R6) لنفس خرطوشة الصفيحة، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الناتج هيستاميني الفعل إلى L1-L3 وخلية عديم الاستطالات (ص). (ج) نشر المعلومات العصبية بين محطات محوار R1-R6 وinterneurons البصرية (بما في ذلك L4، L5، Lawf، C2، C3 و T1)، داخل خرطوشة الصفيحة معقدة. (D) R1-R6 محاور مبصرة تتلقى ردود متشابك من L2 و L4 خلايا أحادي. (ب) و (ج) المعدلة من ريفيرا ألبا وآخرون (2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العين ذبابة الفاكهة هي من نوع العصبية تراكب 16. وهذا يعني رقبعة الإشارات العصبية من المستقبلات الضوئية ثمانية ينتمون إلى سبع ommatidia المجاورة، والتي تبدو في نفس النقطة في الفضاء، يتم تجميع معا في خرطوشة العصبية واحدة في neuropils المقبلين: الصفيحة والنخاع. في حين أن ستة خلايا مستقبلة للضوء الخارجي R1-R6 مشروع محطات محوار لأعمدة العصبية في الصفيحة (الشكل 1)، وخلايا R7 وR8 تجاوز هذه الطبقة وإجراء اتصالات متشابك مع هم العمود النخاع 17-19 المقابلة. هذه التمديدات الدقيق تنتج الركيزة العصبية لرسم خرائط شبكي التوضع من رؤية الطيران في وقت مبكر، وعندها كل الصفيحة (الشكلان 1A-C) والعمود النخاع (خرطوشة) يمثل نقطة واحدة في الفضاء.

وردت مدخلات مباشرة من المستقبلات الضوئية R1-R6 من قبل خلايا القطب كبيرة (LMCs: L1 و L2 و L3) وخلية عديم الاستطالات (ص) في الصفيحة 1،2،20. للخروج من هذه، L1 و L2 هي أكبر الخلايا، والتوسط مسارات المعلومات الكبرى (1D الشكل)، مبادرة الخوذ البيضاء الفصل الاستجابة إلى داخل وخارج حواف تتحرك، وبالتالي تشكل الأساس الحسابي لكشف الحركة 21،22. التجارب السلوكية تشير إلى أن في المقابل المتوسط، ومسارات اثنين تسهل تصور الحركة من اتجاهين متعاكسين:-العودة إلى الجبهة في L1 ومن الأمام إلى الخلف في الخلايا L2 23،24. يعني الربط أيضا أن الخلايا العصبية L4 قد تلعب دورا حاسما في التواصل الأفقي بين خراطيش المجاورة 25،26. تم العثور على نقاط الاشتباك العصبي متبادلة بين الخلايا L2 و L4 تقع في نفس واثنين من خراطيش المجاورة. المصب، كل خلية L2 وثلاث خلايا L4 المرتبطة مشروعها المحاور الخاصة بهم إلى الهدف المشترك، والخلايا العصبية TM2 في النخاع، حيث يعتقد المدخلات من خراطيش المجاورة لتكون متكاملة لتجهيز الأمام إلى الخلف حركة 27. على الرغم من أن الخلايا العصبية L1 تلقي المدخلات من نفس خرطوشة L2s سواء عن طريق تقاطعات الفجوة ونقاط الاشتباك العصبي، فهي ليست مرتبطة مباشرة إلى خراطيش الصفيحة L4s وبالتالي المجاورة.

الطبقة = "jove_content"> يتم توفير تغذية مرتدة متشابك إلى محاور مبصرة R1-R6 فقط من الخلايا العصبية التي تنتمي إلى دوائر / L4 L2 لكن ليس L1 مسار 1،2 (1D الشكل). بينما صلات نفس خرطوشة هي انتقائي من L2 لR1 و R2 ومن L4 لR5، تتلقى جميع المستقبلات الضوئية R1-R6 ردود الفعل متشابك من L4 من أحدهما أو كليهما خراطيش المجاورة. وعلاوة على ذلك، هناك اتصالات متشابك قوية من صباحا إلى R1، R2، R4 وR5، والخلايا الدبقية أيضا على اتصال synaptically إلى الشبكة، وبالتالي يمكن أن تشارك في معالجة الصور العصبي 6. وأخيرا، محور عصبي الفجوة تقاطعات، وربط R1-R6 وبين R6 وR7 / R8 المستقبلات الضوئية المجاورة في الصفيحة، والمساهمة في تمثيل المعلومات غير المتماثلة والمعالجة في كل خرطوشة 14،20،28.

تسجيلات الجهد داخل الخلايا من خلايا مستقبلة للضوء الفردية وinterneurons البصرية في ذبابة الفاكهة سليمة تقريبا توفر عالية ص الإشارة إلى الضوضاءالبيانات ATIO في قرار ميلي ثانية واحدة الفرعي 3،5،7-10،29، وهو أمر ضروري لجعل الشعور الحسابية العصبية السريعة بين الخلايا العصبية المتصلة. هذا المستوى من الدقة أمر مستحيل من خلال تقنيات التصوير الضوئية الحالية، والتي هي ضجيج كبير وتعمل عادة في 10-100 قرار مللي ثانية. وعلاوة على ذلك، لأن أقطاب لديها نصائح صغيرة جدا وحادة، لا يقتصر على طريقة لأجسام الخلايا، ولكن يمكن أن توفر التسجيلات المباشرة من الهياكل العصبية نشطة الصغيرة؛ مثل أشجار شجيري من LMCs "أو المحاور العصبية مستقبلة للضوء، والتي لا يمكن الوصول إليها من قبل نصائح أكبر بكثير من الأقطاب الكهربائية التصحيح، المشبك. الأهم من ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا هيكليا أقل الغازية وضررا من معظم التطبيقات التصحيح، المشبك، وذلك يؤثر على أقل الوسط والمعلومات أخذ العينات داخل الخلايا الخلايا درس. وهكذا، وقد ساهمت التقنيات مسرى مكروي حادة التقليدية، والحفاظ على المساهمة والاكتشافات الأساسية والبصيرة الأصلي إلى تقنية المعلومات العصبيةمعالجة املعلومات في نطاق الوقت المناسب. تحسين فهمنا الآلية الرؤية 3-10.

توضح هذه المقالة كيفية في التسجيلات داخل الخلايا المجراة من ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء R1-R6 وLMCs تتم في المختبر Juusola. وهذا البروتوكول يصف كيفية بناء تلاعب الكهربية مناسبة، وإعداد الطاير، وإجراء التسجيلات. ويرد بعض البيانات تمثيلا، وتتم مناقشة بعض القضايا المشتركة والحلول المحتملة التي قد تواجهها عند استخدام هذا الأسلوب.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتوافق بروتوكول التالية مع جميع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة شيفيلد وجامعة بكين للمعلمين.

1. الكواشف وإعداد المعدات

  1. تسجيل وإعداد الخفيفة تحفيز معدات
    1. اختيار ما لا يقل عن منطقة تسجيل 2.5 × 2.5 م لإجراء التجارب الكهربية في الغرفة التي يوجد تكييف الهواء مع الرطوبة التنظيم والوسائل لتوفير ظروف التسجيل المظلمة. تأكد من أن هذه المنطقة هي كبيرة بما يكفي لتناسب بشكل مريح على: (أ) 1 × 1 م الجدول الاهتزاز والعزل الذي يضم تلاعب [يطير التحفيز وأجهزة تسجيل]، مجهر تشريحي ومصدر ضوء بارد مع اثنين من رقاب أوزة، كل محاطة داخل كبيرة> 180 سم قفص فاراداي. (ب) معدات 38U رف للسكن جهاز كمبيوتر شخصي مع شاشات الكريستال السائل المسطحة، مكبر للصوت مسرى مكروي، والسائقين الصمام، والمرشحات، ووحدات التحكم في درجة الحرارة، الذبذبات وغيرها من الأدوات الكهربائية المطلوبة؛ و (ج) لمكتب صغير وكرسي للمحقق.
    2. وضع تلاعب بعيدا عن مصادر الضوضاء الكهربائية والميكانيكية، مثل الثلاجات وأجهزة الطرد المركزي والمصاعد. استخدام حماة تصاعد منفصلة لحماية الأجهزة الكهربائية تلاعب من الجهد المسامير التي تحدث في التيار الكهربائي. من الناحية المثالية، ربط تلاعب لالخاصة إمدادات الطاقة غير المنقطعة (UPS البطارية) للحد من الضوضاء.
    3. بناء مخروطي يطير حامل من النحاس والبلاستيك الأسود (الشكل 2). حفر حفرة صغيرة مستدق من خلال وحدة النحاس الأصفر مع حافة تضييق الخارجي إلى ~ 0.8 مم (مطابقة عرض الصدر ذبابة نموذجي).
      ملاحظة: هذا الثقب يحتاج إلى تفتق نحو غيض من ذبابة حامل بحيث أكبر من متوسط ​​ذبابة الفاكهة، والذي من المتوقع من أدناه عن طريق تدفق الهواء، فإن واجهتك مشكلة في الكتف العميق على حافة العليا.
    4. تصميم وبناء ميكانيكيا قوية، بعد دقيقة، ويطير التحفيز وجهاز تسجيل (الشكل 3). بناء من سو الألمنيوم أو النحاس (المعادن عالية الموصلية) ذبابة منصة إعداد قطب وحوله نظام كاردان الذراع، مع الكرات جزءا لا يتجزأ، لتوفير س سلسة ودقيقة، ذ لتحديد المواقع وقفل التحفيز خفيفة.
      ملاحظة: هذا التصميم مركب متكامل يقلل الاهتزازات الميكانيكية، والتي يمكن أن إزاحة إلا غيض القطب تسجيل الخروج من الخلية التي شملتها الدراسة. ويمكن مواصلة إدماج وثيقة حلقة نظام التحكم في درجة الحرارة استنادا بلتيير عنصر، وتمكين المحققين على استخدام التركيبات الوراثية حساسة للحرارة، مثل shibire TS، لتقييم حسابات الدوائر متشابك 9،30. أنودة الجهاز أو رسمه الأسود لتقليل ضوء مبعثر التحفيز.
      1. إصلاح تحفيز الطيران وأجهزة التسجيل على اللوح الجدول مضادة للاهتزاز؛ و على سبيل المثال عن طريق M6 البراغي، وذلك باستخدام الثقوب لها المسمار متري. استخدام اللوح الأسود أو تغطية ذلك مع قماش سوداء لتقليل الضوء المبعثر خلال التجارب.
      2. Positioن وقفل (باستخدام المسمار تأمين) وقابل للتعديل عموديا منصة القطب إعداد ذبابة في مركز نظام كاردان الذراع. وضع ذبابة إعداد (داخل ذبابة حامل، راجع الخطوة 2) على القطب منصة بحيث مصدر الضوء تعلق على كاردان الذراع يشير شعاعيا على رأس الذبابة. ضمان أن مركز عيون الذبابة بالضبط عند نقطة تقاطع (0، 0) من X- في كاردان الذراع و-y محاور، وهذا يتيح س دقيقة، ذ-المواقع من التحفيز الضوء إلى أي نقطة داخل الذبابة المجال البصري.
        ملاحظة: هذه الوظيفة ضرورية لرسم خرائط خصائص استجابة الخلايا الفردية إلى مواقع العين محددة؛ على سبيل المثال، عند البحث عن أدلة الكهربية لالتكييف الهيكلي، مثل المناطق مشرق أو الحادة، التي من شأنها أن تظهر زيادة حساسية أو قرار، على التوالي 31.
    5. تركيب مجهر تشريحي وراء تحفيز الطيران وتسجيل الجهاز على الطاولة مضادة للاهتزاز حتىأنه يوفر مريحة مشاهدة عالية التكبير للعين الذبابة.
    6. جبل مصدر الضوء البارد على رأس المجهر مع شبه جامدة أدلة ضوء معقوفة الرأس المزدوج مصدر الضوء لافتا إلى أسفل نحو حامل إعداد الطاير. منقولة بحرية اثنين شعاع الإضاءة يجعل من الاسهل لتصور القطب تسجيل معلومات سرية أثناء القيادة من خلال فتحة صغيرة في العين الطاير.
    7. إرفاق س، ص، مجموعة ض micromanipulator المناسب (خشن وناعم) عن القطب تسجيل والمرحلة الرأس على الطاولة مضادة للاهتزاز، في الجانب الأيمن من جهاز تحفيز الطيران والتسجيل، وذلك باستخدام M6 البراغي أو المغناطيسي تقف.
      ملاحظة: في المختبر Juusola، وقد تم تجهيز منصات مختلفة المتلاعبين مختلف؛ لمزيد من التفاصيل انظر جدول المواد والكواشف. كل هذه توفر تسجيلات داخل الخلايا ذات جودة عالية.
    8. جبل صغير اليدوي 3-محور micromanipulator لصاحب المرجعية القطب على و قابل للتعديل عموديالاي برنامج إعداد القطب. توجيه القطب المرجعية بحيث يشير نحو إعداد الطاير.
    9. بناء محمية ضوء قفص فاراداي قائمة بذاتها من الفولاذ فريقي حول الطاولة مضادة للاهتزاز، المحيطة جهاز تحفيز الطيران والتسجيل، لمنع التدخل الخارجي الكهرومغناطيسي. ترك الجزء الأمامي من القفص مفتوحا، وتوفير الوصول لنقل إعداد الطيران للتجارب. تعلق الستائر السوداء النسيج (وجود نحاسية أو الألومنيوم شبكة مزروع بداخلها عن التأريض) في الجزء الأمامي لحماية من الضجيج والضوء. الطلاء الداخلية للقفص الأسود للحد من الضوء المبعثر والترباس القدمين من القفص على الأرض لمنع الاهتزازات.
    10. توصيل التيار الكهربائي والنواتج الحالية لمقاومة عالية مسرى مكروي الخلايا مكبر للصوت المدخلات اثنين من مرشحات تمرير منخفض منفصلة (بسل أو ما شابه ذلك) باستخدام BNC كابلات. وبالمثل، وربط مخرجات مرشح في القنوات المناسبة للالمفكره AD-موصلCKS / ألواح لنظام الحصول على البيانات (بطاقات DA / م). ربط DA / بطاقة ميلادي (ق) في أجهزة الكمبيوتر الشخصية عن طريق كابلات المتخصصة، وفقا لأدلة المورد.
    11. تثبيت برنامج الحصول على المناسب لنظام الحصول على البيانات من خيار في أجهزة الكمبيوتر الشخصية. تأكد من أن السائقين الحصول على البيانات متوافقة مع نظام التشغيل على أجهزة الكمبيوتر الشخصية.
    12. الأرض كهربائيا تحفيز الطيران وأجهزة التسجيل، قفص فاراداي، شبكة النحاس (داخل الستائر)، المجهر، micromanipulators، مصدر ضوء بارد، المعدات 38U الرف مع كافة أدواته (مكبر للصوت داخل الخلايا، والمرشحات، وحدة التحكم في درجة الحرارة، وأجهزة الكمبيوتر وشاشات الكريستال السائل الخ) إلى نقطة الأرض مركزية واحدة باستخدام الأسلاك المعدات أسس وM6 تجعيد ينتهي حلقة التأريض. استخدام متعدد الكهربائية لاختبار أن جميع الأجزاء في نفس الأرض.
      ملاحظة: لتحقيق أفضل ظروف التسجيل منخفضة الضوضاء الممكنة، في تكوينات أسس عادة تختلف جيئة وذهابام مجموعة واحدة إلى مركز آخر.
      1. إذا لزم الأمر، قم بتوصيل نقطة الأرض المركزية أيضا على أرض الواقع بناء و / أو الأرض المركزية مكبر للصوت مسرى مكروي ل. بعد اختبار النظام يعمل بشكل كامل خلال التجارب الكهربية حقيقية، تكون على استعداد لتغيير تكوين أسس حسب الحاجة للحد من الضوضاء في التسجيلات.
    13. تكوين التضخيم البرمجيات (1 - 10X)، تصفية إشارة (عادة مرشحات تمرير منخفض وضعت في 500 هرتز، الذي هو مناسبة لكلا بيانات R1-R6 ومركز إدارة السيولة المالية)، ومعدل أخذ العينات (على الأقل 1 كيلو هرتز). تأكد من أن الإعدادات طاعة مبرهنة الاستعيان 32؛ على سبيل المثال، عند الحصول على البيانات التي الاسعار المنخفضة تمرير تصفيتها في 500 هرتز، استخدم تردد أخذ العينات من 1 كيلو هرتز أو أعلى لتقليل الآثار التعرج.
      1. كما الردود الجهد مميزة من المستقبلات الضوئية R1-R6 هي 40 - 65 فولت، وتلك من LMCs 20-45 بالسيارات، تعيين والتضخيم، وعرض جداول وفقا لذلك لتمكين عالية الدقة sampliنانوغرام والبيانات التصور.

figure-protocol-1
الشكل 2. مخروطي يطير حامل يتكون حامل يطير من قطعتين: وحدة النحاس المركزية ومخروطي الشكل معطف أسود من البلاستيك. ثقب مركزي داخل وحدة النحاس التناقص التدريجي لقطرها صغير يتيح بالكاد الطاير من خلال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الرقم 3. لمحة عامة عن تلاعب الكهربية. ويتضمن انشاء ومحمية ضوء قفص فاراداي قائمة بذاتها، الجدول مضادة للاهتزاز، وجهاز التحفيز الطاير والتسجيل، ونسيج الستائر السوداء مع نحاسية أو الألومنيوم شبكة داخل ل التأريض. خصوصياترف trument متصل بالكهرباء لنفس الأرض المركزية مع جميع المعدات داخل قفص فاراداي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. افتعال الميكروية
    1. سحب مسرى مكروي إشارة من البورسليكات الخيطية (القطر الخارجي: 1.0 مم؛ القطر الداخلي 0.6 ملم) أو زجاج الكوارتز (القطر الخارجي: 1.0 مم؛ القطر الداخلي 0.5، 0.6 أو 0.7 مم) أنابيب باستخدام أداة ماصة مجتذب. في محاولة لتحقيق تفتق تدريجي قصيرة.
      ملاحظة: تختلف الضبط الدقيق للبرنامج ماصة مجتذب من أداة لالصك؛ مزيد من التفاصيل في الجدول المواد والحكام. حجم المسام في الطرف ليس حاسما لأن غيض من القطب إشارة وسيتم تقسيم قبل أن يتم إدراجها في إعداد الطاير.
    2. سحب مسرى مكروي تسجيل من الخيطية البورسليكات (القطر الخارجي: 1.0 مم؛ القطر الداخلي 0.6 ملم) أو زجاج الكوارتز (القطر الخارجي: 1.0 مم؛ القطر الداخلي 0.5، 0.6 أو 0.7 مم) أنابيب باستخدام أداة ماصة مجتذب. في محاولة لتحقيق طويلة (10-15 ملم) تفتق تدريجي غرامة.
    3. تفقد مع المجهر الخفيفة التي تظهر الأقطاب تسجيل مستدق الصحيح. جبل القطب على شريحة زجاجية مع لاصق قابل للتشكيل واستخدام هدف الهواء 40X لتفقد طرفها.
      ملاحظة: القطب جيد التناقص التدريجي بسلاسة حتى طرفها صغيرة غير مرئية، وتجمع حولها أكثر قتامة موازية مستمرة وأنماط التدخل أخف وزنا ويمكن رؤية. بعض الإعدادات مجتذب توليد كهربائية مقاومة عالية، والتي لا يمكن أن تسفر عن اختراقات خلية ناجحة لنصائحهم تشبه "الأبواق". وبالتالي، الفحص البصري من الأقطاب الكهربائية مهم.
    4. نعلق الأقطاب أفقي على كبير بيتري الطبق مع الصلصال (أو لاصق قابل للتشكيل مماثل) لحفظها والنقل إلى تلاعب الكهربية. تأكد من أن نصائح القطب لإعادة دائما في الهواء وليس عن طريق الخطأ لمس أي شيء.
    5. الخلفية ملء تسجيل وإشارة كهربائية قبل التجربة مع محلول الملح المناسب. استخدام صغيرة حقنة 5 مل متصلة مرشح الجسيمات الصغيرة مع طرف من البلاستيك على ما يرام (مثل microloader).
      1. للتجارب خلايا مستقبلة للضوء، وملء القطب تسجيل حتى الشبع (تتشكل قطرات في نهايته كبيرة) مع 3 M بوكل لأن هذا الحل يقلل من تأثير إمكانية تقاطع السائلة إلى الجهد المسجل.
      2. للتحقيق في LMCs هيستاميني الفعل، التي تستجيب لإدخال متشابك من المستقبلات الضوئية R1-R6 بالتغيرات كلوريد تصرف، وملء أقطاب تسجيل مع 3 M خلات البوتاسيوم و 0.5 ملي بوكل، وهذا الحل له تأثير أقل على بطارية كلوريد الخلية. ملء القطب المرجعية مع ذبابة قارع الأجراس، التي تحتوي في ملي: 120 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 10 TES (C 6 H 15 NO 6 S)، 1.5 CaCl 2 و 4 MgCl 2، و 30 السكروز
    6. اختبار مقاومة القطب تسجيل سحبت حديثا في نظام التسجيل.
      1. تأكد من أن أسلاك الفضة داخل أصحاب الكهربائي والمغلفة بالتساوي مع كلوريد الفضة (تظهر الأرجواني والرمادي - وليس فضي لامع) للحد من القطع الأثرية تسجيل (مثل الانجراف في إمكانية تقاطع). إذا لم يكن كذلك، استبدالها بأسلاك chloridized بشكل صحيح.
      2. إذا لزم الأمر، chloridize أسلاك الفضة جديدة. بعناية تنظيف الأسلاك (عن طريق تمريرها بسرعة من خلال لهب) بحيث تظهر هذه الفضة مشرق في اللون. تجنب لمسها بالأصابع، من أجل لإيداع على مستوى واحد طبقة من أجكل. نقع الأسلاك في كامل قوته التبييض المنزلية ل15-30 دقيقة حتى تظهر الأرجواني اللون الرمادي. بدلا من ذلك، بالكهرباء كل سلك (بجعله إيجابية فيما يتعلق محلول يحتوي على 3 M بوكل وتمرير تيار من خلال ذلك بمعدل 1 مللي أمبير / سم 2 من المساحة السطحية) لمدة 10 - 15 ثانية حتى المغلفة بشكل كاف. ربط تسجيل المليئة الظهر وأقطاب المرجعية لأصحاب القطب الخاصة بهم. ضع حمام حل لقارع الأجراس الصغيرة حول تعديل عموديا منصة القطب إعداد الطاير. دفع نصائح الكهربائي في حل رينغر وقياس المقاومة طرف القطب تسجيل في.
        ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة إلا عند اختبار خصائص مقاوم من الأقطاب الكهربائية التي يتم سحبها من دفعة جديدة من أنابيب الزجاج، أو عند تحقيق الاستفادة المثلى من برامج أداة مسرى مكروي مجتذب من خلال التكرار.
      3. قبل تنفيذ قياسات المقاومة، وقراءة التعليمات في دليل المستخدم تصنيع مكبر للصوت لضبط القياس المناسبة. لتسجيل الكهربائي جيد، لديها مقاومة غيض من ~ 100-220 MΩ.

2. إعداد ذبابة الفاكهة

  1. جمع 5-10 أيام الذباب القديمة (بعد eclosion) ووضعها في أنبوب ذبابة نظيفة تحتوي على شارعالغذاء andard. فمن الممكن لتحقيق تسجيلات جيدة من الذباب الأصغر سنا أيضا، حتى من "حديثي الولادة". ولكن بسبب ليونة أعينهم، وقطع فتحة القرنية للالقطب تسجيل أكثر صعوبة.
  2. بناء أنبوب ذبابة صيد وإعداد ذبابة تقف (الشكل 4). انظر الشكل 4 لفكرة عامة عن كيفية وضع هذه الأدوات عصامي معا.
    1. لجعل أنبوب ذبابة صيد، وقطع غيض من قاع مخروطي 50 مل من البلاستيك أنبوب الطرد المركزي ل. ثم، تضاف والغراء نهاية كبيرة من 1 مل ماصة على هذا الانفتاح الجديد.
    2. وأخيرا، وقطع صغيرة من نهاية ماصة إلى الحجم الذي يسمح بسهولة ذبابة على المشي من خلال. استشارة ورشة ميكانيكية لتجميع مرحلة إعداد ذبابة صغيرة تمكن دوران 2-محاور وقفل الطاير حامل في مناصب مختلفة.

figure-protocol-3
شملت رقمه 4. أدوات ويضع اللازمة لاتخاذ إعداد يطير. يطير يتم اصطياد أنبوب من قبل الإلتصاق 1 مل ماصة بلاستيكية تلميح إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. مفصل موقف إعداد ذبابة يتيح دوران حر وقفل الطاير حامل في الموضع المفضل لإعداد الطاير. يتم إصلاح ذبابة بواسطة شمع العسل، وذلك باستخدام الشمع الكهربائية سخان. يتم تطبيق الفازلين بواسطة قضيب صغير مصنوع من خلال ربط الشعر نوع سميك على التعامل معها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. جمع ذبابة للتجربة في تلميح ماصة 1 مل، والتي تمكن بالكاد ذبابة لتناسب من خلال. إرفاق ذبابة صيد أنبوب، مع طرف ماصة على ذلك، إلى أنبوب الطاير. في اصطياد ذبابة، والاستفادة من ميلها المتأصل لتسلق صعودا (antigravitaxis) في تلميح ماصة. يفضل اختيار أكبر من الإناث، كما يهم الحجمالصورة في الكهربية.
    ملاحظة: أكبر الطاير، وأكبر خلاياه وأفضل فرص للتسجيلات داخل الخلايا ذات جودة عالية. الذباب أصغر (الإناث والذكور على حد سواء) ويمكن أيضا أن توفر تسجيلات ممتازة، ولكن إعداد أكثر صعوبة لجعل. بمجرد المحاصرين الطاير في طرف ماصة كبير، تذكر لإغلاق أنبوب الطيران لمنع الذباب أخرى من الهرب.
  2. توصيل حقنة 100 مل مع خرطوم البلاستيك المرن لافتتاح أكبر من طرف ماصة - مع الذبابة لا تزال فيه.
  3. وضع نهاية الضيقة على الطرف ماصة كبير، والتي يتم تكبير فقط السماح لذبابة الفاكهة من خلال لفتحة في الجزء السفلي من ذبابة حامل ويسجل كمية صغيرة من الهواء من الحقنة لإخراج الطيران في ذبابة حامل .
    1. ننظر من خلال مجهر تشريحي وإدارة بلطف مزيد من الهواء حتى رأس الذبابة وجاحظ من نهاية مخروطية من ذبابة حامل. ضمان الطاير محصور بقوة من الصدر لفي مكتب مستشار رئيس الوزراء صغيرنينغ على رأس ذبابة حامل.
  4. استخدام سخان الشمع لربط الطاير مع شمع العسل من على "أكتاف" لذبابة حامل. ضبط درجة حرارة سخان الشمع لتكون في أدنى مستوى ممكن بعد ذوبان الشمع نظيفة.
    ملاحظة: عندما تكون درجة الحرارة الصحيحة، يظهر الشمع الشفاف. عالية جدا من الحرارة يجعل الشمع "تحرق". منخفض جدا يبقي قاسية الشمع. عند تحديد الطاير، أن تكون دقيقة ومختصرة قدر التعرض للحرارة لفترة طويلة قد يسبب ضررا. عن طريق الشفاء ضوء الغراء الأسنان لا ينصح هنا كان تطبيقه بطيء جدا.

figure-protocol-4
الرقم 5. إعداد يطير لفي فيفو التجارب. اليسار، يتم وضع رأس ذبابة الفاكهة الصورة مباشرة في الطيران حامل وثابتة من خرطوم لها، العين اليمنى والكتفين إلى الطاير حامل مع تكون ساخنةeswax. الحق، ويتم قطع فتحة صغيرة في الجزء السميكة من العين، فقط فوق خط الاستواء، وفقط عدد قليل من ommatidia بعيدا عن بشرة الظهر، وذلك باستخدام الحلاقة حافة حادة. تتم إزالة قطعة من القرنية بلطف ووختم الحفرة مع الفازلين لمنع العين من الجفاف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. شل رأس الذبابة. تطبيق شمع العسل للخرطوم (الشكل 5) وزاوية العين اليمنى، وتجنب القرنية، وإصلاح الرأس من هذه النقاط على الطاير حامل.
  2. إنتاج سكين الصغيرة. المشبك على razorblade غير الفولاذ المقاوم للصدأ مع اثنين من حاملي شفرة / قواطع (على حد سواء مع قبضة شقة) والكراك شريط صغير من حافته حادة. للصحة والسلامة، واستخدام نظارات واقية لحماية العين (على الرغم من أنه من غير المرجح أن القطع سوف النبو عندما مشققة الحلاقة). من الناحية المثالية،إنتاج الحلاقة حافة حادة تشبه مستدقة. تأكد من أن هذا "عشب" وترتبط بقوة مع شفرة حامل، ولكن يجب الحرص على تجنب أي إيذاء الذات!
  3. باستخدام سكين الصغيرة، وإعداد حجم فتحة صغيرة من عدد قليل من ommatidia في العين اليسرى الذبابة - في حوالي 4-5 ommatidia من إهاب الظهرية فقط فوق خط الاستواء العين لتوفير ممر لمسرى مكروي تسجيل. أداء تحت مجهر تشريحي، وعرض إعداد مع التكبير عالية.
    ملاحظة: نظرا لأن عين الذبابة يشعر مرنة ومقاوم للتحقق، وثقب هو أفضل قطع مع -knife "عشب". تقنية القطع هي صعبة جدا، لذلك إيلاء اهتمام وثيق للمظاهرة الفيديو. يمكن الحفاظ على ذبابة حامل في بعض التوجهات (في إعداد موقف ذبابة) جعل تشريح أسهل. في البداية، قد يشعر المجهرية من الصعب معرفة، ولكن مرة واحدة ملتزمة، التكيف العصبي يحسن تدريجيا 3D التصور المحقق والبراعة.
  4. Remove بعناية قطعة صغيرة من القرنية من فتح التي قطعت للتو، وفضح الشبكية تحتها. تغطية بسرعة ثقب في العين مع فقاعة صغيرة من الفازلين باستخدام شعر ناعم من قضيب الفازلين.
    ملاحظة: يخدم الفازلين الأدوار المتعددة هنا. ويمنع جفاف الأنسجة وتخثر الدملمف التي من شأنها كسر القطب تسجيل المدرجة. انها المعاطف أيضا بالمناسبة مسرى مكروي، والحد من السعة التي جماعية. هذا يمكن أن يحسن من استجابة التردد من نظام التسجيل، وذلك القرار الزمني للإشارات العصبية المسجلة. تجنب تلطخ الفازلين على بقية العين لأن هذا يطمس البصريات.

3. تسجيل من R1-R6 خلايا مستقبلة للضوء أو LMCs

  1. دائما أن أرضي عند تشغيل مكبر للصوت مسرى مكروي (على سبيل المثال عن طريق لمس سطح معدني من قفص فاراداي أو الجدول مضادة للاهتزاز)، وهذا يحول دون واحد من تقديم عن طريق الخطأجي تهمة ثابتة إلى مرحلة الرأس، والتي يمكن أن تلحق الضرر الدوائر.
  2. إلقاء الضوء على منصة القطب إعداد يطير من فوق من قبل اثنين من المرشدين ضوء أوزة الرقبة (الشكل 6A) (مع مصدر ضوء بارد داخل قفص فاراداي) بحيث حامل ذبابة يمكن وضعها على قطب في موقف المفضل تحت المراقبة البصرية وثيقة .

figure-protocol-5
الشكل 6. تحديد المواقع يطير حامل ويتم وضع حامل ذبابة على منصة التسجيل الذي يوفر أيضا التحكم في درجة الحرارة عن طريق عنصر بلتيير (A: منصة دائرية بيضاء في الوسط) وأقطاب للتجارب (AB). وكاردان الذراع يتيح المواقع الدقيقة للتحفيز الضوء على مسافة متساوية (عبر X، Y-دوران) حول ذبابة، مع مصدر الضوء (نهاية الباقة السائلة أو الكوارتز الألياف الضوئية) لافتا مباشرة إلى عينيها. في كثير من أوومنصات ص، يتم إنشاء التحفيز ضوء المصابيح التي كتبها (مع الخطية برامج التشغيل الحالية) أو عن طريق مستوحد اللون. وهكذا، المحفزات التي تحمل محددة (-مرت الفرقة) محتوى الطيفية، اختار بين 300-740 نانومتر، وتغطي 4-6 سجل مجموعة وحدة كثافة (كما الموهن من مرشحات الكثافة محايدة مستقلة). (C) اثنين الميكروية، التي تسيطر عليها micromanipulators منفصل، يتم وضعه في الرأس الطيران: القطب المرجعية (أعلاه) من خلال ocelli. القطب تسجيل (يسار) من خلال فتحة صغيرة في العين اليسرى. (D) للحصول على الحد الأقصى لعدد التسجيلات مبصرة، هو الدافع وراء مسرى مكروي تسجيل في حفرة، موازية للمحور خرطوم-ocellus. عندما تخترق القطب طرف والأختام لمستقبلة للضوء، يتم إصلاح مصدر الضوء تدوير بحرية إلى موقف حيث تنتج الخلايا استجابة الجهد القصوى لحافز ضوء معين. هذه النقطة في الفضاء تقع في وسط الميدان تقبلا للخلية. إذا كنت حفرةق على مقربة من إهاب، الاختراقات مركز إدارة السيولة المالية يمكن أن تزيد من تحقيقه مع هذه الزاوية القطب نفس (يسار). إذا كان الثقب هو أبعد عن بشرة، مفيدة زاوية النهج القطب أخرى للحصول على تسجيلات مركز إدارة السيولة المالية يظهر أيضا (إلى اليمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. جبل الذبابة حامل (مع الذبابة في ذلك!) على القطب ذبابة منصة إعداد. تدوير الطاير حامل بحيث عينه اليسرى الذبابة يواجه مباشرة المحقق (الشكل 6B).
  2. إدراج القطب إشارة حادة بلطف من خلال occelli الذبابة في الكبسولة رئيس باستخدام micromanipulator الخشنة الصغيرة مع مراعاة إعداد من خلال مجهر تشريحي (الشكل 6C). لا تدفع القطب عميق جدا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الدماغ ذبابة.
    1. بدلا من ذلك، إدراج القطب إشارة إلى الجزء الخلفي من القفص الصدري. دائما، تأكد من أن يطير يبدو heathy (يتحرك هوائيات) وعينيه وسليمة. لم تتضرر بطريق الخطأ. إذا كان إعداد يبدو أقل من طاهر، وإعداد ذبابة جديد للتجارب.
  3. دفع تسجيل مسرى مكروي حاد في العين اليسرى خلال الفازلين غطت فتحة صغيرة أعدت في وقت سابق. استخدام التكبير العالية في مجهر تشريحي ونقل أدلة الخفيفة وطائرة الوصل بحيث يصبح موقع القطب طرف واضح في 3D من أنماط الانعكاس لها.
    ملاحظة: يبين الشكل 6D كيف ينبغي وضع رأس الذبابة بشكل مختلف قليلا (فيما يتعلق زاوية ومسرى مكروي تسجيل يدخل إلى العين) لمستقبلة للضوء والتسجيلات مركز إدارة السيولة المالية. القيادة الكهربائي في العين دون كسرها هي المرحلة الأكثر صعوبة التجربة. إذا كان طرف القطب يغفل فتحة صغيرة في العين، لتصل إلى القرنية، فإنه يكسر عادة.
  4. تشغيل مكبر للصوت مسرى مكرويمرة واحدة كل من الأقطاب الكهربائية هي بقوة داخل الإعداد، في اتصال الكهربائية مع سوائل جسم الذبابة.
  5. إيقاف مصدر الباردة ضوء (داخل قفص فاراداي) وفصله من التيار الكهربائي. ربط المكونات لها على الأرض المركزية للحد من الأرض حلقة يسببها الضجيج الكهربائي، ونقل أدلة ضوء أوزة الرقبة بعيدا حتى أن النظام كاردان الذراع يمكن نقلها بحرية في جميع أنحاء الطاير. إيقاف تشغيل أضواء الغرفة للتأكد من أن إعداد الذبابة الآن في الظلام النسبي.
  6. قياس مقاومة القطب تسجيل في العين (وفقا للتعليمات في دليل المستخدم مكبر للصوت). استخدام تسجيل فقط الأقطاب الكهربائية التي المقاومة 100-250 MΩ.
    ملاحظة: من المستحيل عمليا لتحقيق تسجيلات داخل الخلايا عالية الجودة من خلال <70 MΩ الكهربائي. إذا كانت المقاومة هي <80 MΩ، فمن المرجح أن الطرف الكهربائي مكسورة. في هذه الحالة، إيقاف تشغيل مكبر للصوت وتغيير القطب تسجيل.
    1. مرة واحدة في القطبيتم استبدال وفي العين، والتبديل على مكبر للصوت لقياس مقاومته. في بعض الأحيان، وغيض الكهربائي يمكن أن تصبح سدت بعض المخلفات كما أنه يدخل في الأنسجة. هذا لا يمكن علاجه باستخدام الطنانة بالسعة ونبض الحالية وظائف مكبر للصوت التي عادة واضحة من قبل resonation السريع أو تنافر.
  7. تعيين مكبر للصوت المشبك الحالي (CC) أو طريقة التسجيل الجسر. يلغي أي فرق الجهد التعسفي بين تسجيل وإشارة كهربائية، لأن كلا منهم يستريح الآن في الفضاء خارج الخلية المترابط كهربائيا، من خلال وضع إشارة الإزاحة (تسجيل الجهد) إلى الصفر. متابعة التغيرات إشارة يقابلها باستخدام قراءات عرض مكبر للصوت أو شاشة الذبذبات.
  8. الانتظار 2-3 دقائق للعين الذبابة إلى dark-التكيف.
  9. دفع طرف القطب تسجيل أعمق تدريجيا في العين مع صغيرة 0،1-1 الخطوات ميكرون. هل هذا مع محور س بيزو السائر من micromanipulator للتحكم عن بعد أو بذ الدورية بلطف القرار مقبض غرامة تتلاعب اليدوي.
  10. تحفيز العين الطاير مع باختصار (1 - 10 ميللي ثانية) ومضات الضوء كما يتم متقدمة القطب تسجيل في الأنسجة.
    ملاحظة: إذا تم وضع القطب تسجيل في شبكية العين وظائف العين بشكل طبيعي، فإن كل ومضة ضوء يسبب انخفاض موجز وبسيط في الجهد (0،2-5 بالسيارات فرط الاستقطاب)، ويسمى مخطط كهربية (أرج). يحدث هذا التغيير في إمكانية مجال الفضاء خارج الخلية من الاستجابة الجماعية للخلايا الشبكية "للضوء. ومع ذلك، وبمجرد أن يدخل طرف القطب الصفيحة، ليغلق على LMCs، وأرج عكس، والتي تبين ردود depolarizing.
  11. نقل مصدر الضوء حول العين الطيران باستخدام نظام كاردان الذراع والعثور على موقف حيث ضوء تثير أكبر رد أرج.
    ملاحظة: هذا الموقف يمثل منطقة صغيرة في المساحة المرئية حيث خلايا مستقبلة للضوء (أو LMCs)، والتي تقع بالقرب من غيض من القطب تسجيل، نموذج إدخال ضوءها.
  12. اختراق خلية مع القطب تسجيل.
    ملاحظة: يمكن أن يحدث الاختراق بشكل عفوي، أو عندما يكون القطب هو الصغير صعدت إلى الأمام. ويمكن كذلك سهلت من خلال استغلال بلطف نظام micromanipulator أو باستخدام وظيفة شرب حتى الثمالة من مكبر للصوت. هذه الأعمال صدى طرف القطب في الأنسجة. عندما يخوزق القطب غشاء مبصرة، دخول مجالها داخل الخلايا، وفرق الجهد بين التسجيل والقطب المرجع يسقط فجأة من 0 بالسيارات إلى ~ -65 بالسيارات (بين -55 و -75 فولت)؛ بينما خلال الاختراقات مركز إدارة السيولة المالية، هذا الانخفاض هو عادة أقل (ما بين -30 و -50 فولت). وتمثل هذه الاختلافات الجهد إمكانات الراحة السلبية لخلايا معينة. اعتمادا على نوعية القطب تسجيل (حدته)، وعملية الخلوية اخترقت، القراءة الجهد من القطب تسجيل يمكن تحقيق الاستقرار بسرعة أو تدريجيا إلى إمكانية يستريح، وغشاء الخليةالأختام إلى الطبقة الخارجية من القطب. ولكن إذا كان الاختراق هو جزئي فقط أو الفقراء، القطب زلات عادة خارج الخلية مع تسلق المحتملين المسجلة نحو الصفر.
  13. توطين وسط الميدان تقبلا الخلية اخترقت عندما يظهر القطب محكمة الغلق، والتي تبين إمكانية غشاء مستقرة (المظلمة يستريح المحتملة). نقل التحفيز ضوء وامض حول العين الطيران، وذلك باستخدام نظام كاردان الذراع، للعثور على نقطة في الفضاء البصري، حيث تثير ومضة ضوء استجابة الجهد القصوى للخلية. قفل كاردان الذراع عندما يواجه التحفيز الضوء مباشرة (نقطة في) وسط الميدان تقبلا.
    ملاحظة: في الظلام، مبصرات ذبابة الفاكهة الاستجابة لنبضات الضوء الساطع مع 40-65 بالسيارات الردود depolarizing الجهد 4،5، في حين تشير التسجيلات مركز إدارة السيولة المالية مستقرة 20-45 بالسيارات hyperpolarizing الردود 9،10،14. قد يحدث اختراقات الدبقية نادرا، وأشار <-80 بالسيارات إمكانات الراحة وأبطأ بكثيروأصغر (~ 5 فولت) المشبعة اللاإستقطابات depolarizations الناجم عن الضوء. خلايا مستقبلة للضوء في ذبابة الفاكهة مع تصبغات العين المختلفة، مثل البيض العين 7 وكبريتيد، تظهر الأحجام استجابة مماثلة لمن النوع البري.
  14. عن طريق وضع مكبر للصوت الحالي المشبك (CC)، تعويض السعة القطب تسجيل عن طريق حقن صغيرة 0.1 غ وجيزة - البقول الحالية (100 200 ميللي ثانية) في الخلية درس للحد من القطع الأثرية التسجيل أثناء الشحن الغشاء.
    ملاحظة: يتم شرح هذا الإجراء المهم بالتفصيل في دليل المستخدم مكبر للصوت، ويجب أن يمارس مع نموذج الخلية الكهربائي قبل التجارب الفعلية.
  15. ردود سجل الجهد لنبضات الضوء وغيرها من المحفزات من الفائدة، مع اختلاف الصفات الإحصائية أو الجسدية (مثل طبيعي السلاسل الزمنية شدة الضوء أو أنماط النقيض عشوائي). اختبار، على سبيل المثال، كيف تتغير ردود سجلت مع ضوئية أو داكنة التكيف.
    ملاحظة: يمكن للمرء أن بدقة لىGHT-التكيف مع الخلية التي يدرسها ضوء مستمر من شدة انتقاؤه من خلال إضافة مرشحات الكثافة محايدة في مسار الضوء 4،5. بدلا من ذلك، لفترة طويلة داكنة التكيف إيقاف التحفيز خفيفة بعد انتهاء وقت معين. بسبب الاستقرار الميكانيكي للنظام التسجيل، والجودة العالية للتسجيل أقطاب وintactness من إعداد ويمكن ظروف التسجيل مستقرة تستمر أحيانا لعدة ساعات. وهكذا، في يوم جيد، فمن الممكن أن يحصل على كمية كبيرة من البيانات في ظروف التكيف المختلفة من خلية واحدة. عندما ينزلق القطب خارج الخلية، ردود سجلت تتضاءل ويبدأ الجهد المتوسط ​​للاقتراب الصفر.
  16. دفع بعناية القطب تسجيل مع سيطرة محور س غرامة من micromanipulator حتى القطب يجعل الاتصال وتخترق الخلية التالية (هذا هو عادة أقرب جار العصبي). لا تتحرك القطب على طول Y- أو ض محور حيث أن هذه المناورات من شأنه أن يجعل القطب إلى "ررough النسيج "جانبية، وإلحاق أضرار الهياكل العين!
    ملاحظة: مع القطب جيد وإعداد صحي، يمكن للمرء أن يسجل الاستجابات ذات جودة عالية من العديد من المستقبلات الضوئية (ولكن نادرا ما من العديد من LMCs) في نفس ذبابة على مدى عدة ساعات. في بعض الأحيان، على مدى يوم عمل كامل (> 8 ساعات) دون تدهور إشارة واضحة.
  17. حفظ ملفات البيانات بشكل دوري مع تحديد المعلومات، مثل التاريخ وراثى، ونوع من الخلايا المسجلة. ونظرا لكمية كبيرة من البيانات التي يمكن جمعها في تسجيل الدورة ناجحة، والحفاظ على سجلات مكتوبة جيدة في المختبر الكتاب لتحليل البيانات في المستقبل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة الحاد تسجيل مسرى مكروي، وتكييفها هنا للعين ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها لقياس موثوق أخذ العينات العصبية المعلومات ومعالجتها في خلايا شبكية العين والصفيحة، والاتصالات بينهما 4،5،7،8،10،33. عن طريق استخدامه لدراسة الترميز في مختلف الأسهم من النوع البري، المسوخ أو سلالات ذبابة المعدلة وراثيا، وقد ثبت أن الطريقة قيمتها. ليس فقط في قياس آثار الطفرة، ودرجة الحرارة، والنظام الغذائي، أو في المختارة التعبير 3،4،6،9،10،14،30،34، ولكن أيضا في الكشف عن الأسباب الميكانيكية لسلوكيات البصرية المتغيرة 14،34. طريقة ينطبق أيضا بسهولة إلى الاستعدادات الحشرات الأخرى 35،36، وتمكين دراسات رؤية neuroethological. بعد ذلك قمنا بعرض بعض الأمثلة على تطبيقاته الناجحة.

figure-results-1
الرقم 7. الجهد ردود على ذبابة ثمار R1-R6 مبصرة لنبض الضوء في 20 و 25 درجة مئوية بسبب الاختراقات مسرى مكروي حادة غالبا ما تكون مستقرة جدا، فمن الممكن لتسجيل استجابات الجهد من نفس مبصرة R1-R6 لحافز خفيفة معينة في درجات الحرارة المحيطة مختلفة عن الاحترار أو التبريد الطاير. في لدينا مجموعة عمليات، يتم وضع الطيران حامل على نظام التحكم في درجة الحرارة حلقة قريبة أساس بلتيير عنصر. وهذا يمكننا من تغيير الذبابة درجة حرارة الرأس في ثوان. ارتفاع درجة الحرارة يسرع الردود الجهد ومميز يقلل من إمكانات يستريح من المستقبلات الضوئية R1-R6 (كما يتبين من السهام الحمراء). اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

دراسة تأثير درجة الحرارة على الناتج مبصرة

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> مع مصممة تصميما جيدا ونظام تسجيل معزولة الاهتزاز، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لقياس تأثير درجة الحرارة على الانتاج العصبية خلية فردية من قبل ارتفاع درجات الحرارة أو التبريد الطاير. يوضح المثال المعطى الردود الجهد لنبضة 10 ميللي ثانية طويل مشرق، وسجلت في نفس مبصرة R1-R6 في 20 و 25 درجة مئوية (الشكل 7). كما كميا قبل 4،9، والاحترار يخفض احتمال يستريح على مستقبلة للضوء في الظلام، وتسارع ردود الجهد لها.

figure-results-2
الرقم 8. اشارة الأداء على ذبابة ثمار R1-R6 مبصرة يحسن مع شدة الضوء (A) الناتج مبصرة لقاتمة (أدناه) ومشرقة. (أعلاه؛ 10،000 مرات أكثر إشراقا ضوء) تتكرر الطبيعية شدة الضوء السلاسل الزمنية التي سجلتها نفسه مسرى مكرويفي نفس الخلية في 20 درجة مئوية. الردود على التحفيز مشرق أكبر، لأنها تدمج المزيد من العينات، ردود الابتدائية (المطبات) إلى الفوتونات واحدة 4،5،7،8. (ب) يتم فرضه 20 الردود الجهد متتالية ثانية واحدة طويلة. اتخذت الاستجابات الفردية (رمادي فاتح) بعد الاتجاهات التكيفية (السهم في A) قد انحسر (مربع منقط في A). وسائل الاستجابة المقابلة (الإشارات) هي آثار قتامة. الفرق بين إشارة والاستجابات الفردية هو الضجيج. "وكان كميا أداء الإشارات التي كتبها التسجيلات" (C) الخلايا نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNR) باستخدام الطرق القياسية 4،5،7،8. الناتج مبصرة لديها مجموعة وحوالي 64 هرتز أوسع من الإشارات الموثوق بها على التحفيز مشرق (SNR "≥1 مشرق، تصل إلى 84 هرتز) عما كانت عليه في قاتمة (SNR" خافت ≥1، تصل إلى 20 هرتز)، مع الصورةignal إلى نسبة الضوضاء تتحسن إلى حد كبير؛ من SNR خافت MAX = 87 إلى SNR برايت MAX = 1،868. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

دراسة التكيف والعصبية ترميز بواسطة المتكرر تحفيز

وnoninvasiveness الأسلوب، مما تسبب في أضرار طفيفة نسبيا في هياكل شبكية العين والصفيحة، يجعلها مثالية لدراسة أداء الإشارات من الخلايا الفردية للمؤثرات ضوئية مختلفة في القريب الحالة الفسيولوجية الطبيعية في الجسم الحي. الشكل 8 يظهر استجابات الجهد من R1- R6 مبصرة لضوء الوقت كثافة طبيعي سلسلة من الحوافز قاتمة ومشرق المتكررة عند 20 درجة مئوية، في حين أن الرقم 9 درجة مئوية. أجريت التسجيلات قبل وبعد المشبكي بشكل منفصل عن اثنين من الذباب مختلفة لأن التسجيلات داخل الخلايا في وقت واحد من قبل اثنين من الميكروية حادة في نفس الطيران، واحدة في شبكية العين، والآخر في الصفيحة، من الصعب جدا أن تكون قابلة للحياة 30.

figure-results-3
الرقم 9. الردود الجهد من ذبابة الفاكهة R1-R6 مبصرة ومركز إدارة السيولة المالية إلى تكرار طبيعي تحفيز على 25 درجة مئوية (A) R1-R6 (الرمادي) ومركز إدارة السيولة المالية (أسود) النواتج التي سجلتها الميكروية مختلفة من الذباب مختلفة. (ب) 20 ما قبل ضوء تكييفها بالكامل على التوالي (أعلاه) وبعد المشبكي (أدناه) الردود على نفس النمط التحفيز الطبيعي مع الاستجابات الفردية، كما هو موضح في ضوء رمادي لد وسائل المقابلة استجابة (الإشارات) على أنها آثار قتامة. الفرق بين إشارة والاستجابات الفردية هو الضجيج. "وكان كميا أداء الإشارات التي كتبها التسجيلات" (C) الخلايا نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNR). مركز إدارة السيولة المالية الانتاج لديها مجموعة وحوالي 10 هرتز أوسع من إشارات يمكن الاعتماد عليها (SNR "مركز إدارة السيولة المالية ≥1، تصل إلى 104 هرتز) من الناتج R1-R6 (SNR 'R ≥1، وتصل إلى 94 هرتز). كل من نسب الإشارة إلى الضوضاء مرتفعة (SNR مركز إدارة السيولة المالية MAX = 142، SNR R MAX = 752)، وكما كان الضجيج تسجيل منخفضة، وخلافاتهم تعكس الاختلافات الترميز حقيقية بين الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ظهور التحفيز، والتسجيلات نموذجيةلاي تظهر التكيف بسرعة الاتجاهات التي تهدأ إلى حد كبير داخل 5-6 ثانية. ومنذ ذلك الحين، والخلايا تنتج استجابات متسقة للغاية على كل 1 ثانية عرض الحوافز طويلة (كل مربع منقط يرفق 20 من هذه). والتكرار من الردود يصبح واضحا عندما يتم فرضه هذه (الشكل 8B والشكل 9B). الاستجابات الفردية هي آثار رمادية رقيقة، ويعني بها سمكا أكثر قتامة أثر. يتم أخذ استجابة يعني مثل إشارة العصبية، في حين أن الضجيج العصبي هو الفرق بين المتوسط ​​وكل 4،5،9،37،38 استجابة الفرد. وقد تم الحصول على نسب كل إشارة إلى الضوضاء في نطاق التردد (الشكل 8C والشكل 9C) من خلال فورييه تحويل الإشارة والضجيج قطع البيانات إلى أطياف السلطة، وتقسيم متوسط ​​طيف الطاقة إشارة مع ما يوازيها من متوسط ​​الضوضاء السلطة الطيف 4، 5،9،37،38. مميز، الحد الأقصى للنسب الإشارة إلى الضوضاء سو مخرجات العصبية المسجلة لتحفيز طبيعي مرتفعة (100 - 1000)، وفي الأعمال التحضيرية الأكثر استقرارا مع منخفضة جدا الضوضاء التسجيل يمكن أن تصل إلى القيم >> 1000 (على سبيل المثال، الشكل 8C). لاحظ أيضا أن الاحترار توسع الخلايا عرض النطاق الترددي من موثوق يشير 4 (SNR "برايت ≥ 1)؛ على سبيل المثال، والفرق النسبي بين اثنين R1-R6S في أرقام 8 و 9 على التوالي، هو 10 هرتز (84 في 20 درجة مئوية و 94 هرتز عند 25 درجة مئوية).

يمكن للمرء أن أبعد تقدير نسبة كل خلية من نقل المعلومات من لنسبة الإشارة إلى الضوضاء باستخدام معادلة شانون 32، أو عن طريق حساب الفرق بين معدلات الكون الكون والضوضاء الردود من خلال طريقة الاستقراء الثلاثي 39. مزيد من التفاصيل عن التحليلات النظرية المعلومات واستخدامها والحدق على وجه التحديد مع هذه الطريقة هي التي وردت في المنشورات السابقة 7،8،39.

figure-results-4
الرقم 10. الردود الجهد من القاتل ذبابة R1-R6 مبصرة ومركز إدارة السيولة المالية إلى تكرار طبيعي تحفيز على 19 درجة مئوية (A) R1-R6 (الرمادي) ومركز إدارة السيولة المالية (أسود) النواتج التي سجلتها نفسه مسرى مكروي من نفس ذبابة. postsynaptically أولا وبعد ذلك presynaptically، كما تقدمت القطب في العين. تم القبض على (ب) 20 ما قبل التوالي (أعلاه) وبعد المشبكي (أدناه) الردود (آثار رمادي فاتح) على نفس نمط التحفيز الطبيعي بعد التكيف الأولي (مربع منقط في A). وسائلهم هي إشارات (آثار قتامة على أعلى)، في حين أن الاختلافات كل منهما إلى الاستجابات الفردية تعطي الضوضاء. (ج) سينيا المقابلةتم حساب نسب لتر إلى الضوضاء (SNR) كما هو الحال في أرقام 8C و9C. مركز إدارة السيولة المالية الانتاج لديها نحو مجموعة 100 هرتز أوسع من إشارات يمكن الاعتماد عليها (SNR "مركز إدارة السيولة المالية MAX ≥1، وتصل إلى 234 هرتز) من الناتج R1-R6 (SNR 'R MAX ≥1، تصل إلى 134 هرتز). كل من نسب الإشارة إلى الضوضاء مرتفعة (SNR مركز إدارة السيولة المالية MAX = 137، SNR R MAX = 627)، وكما تم استخدام نفس مسرى مكروي في التسجيلات، خلافاتهم تعكس اختلافات حقيقية في مخرجات العصبية قبل وبعد المشبكي. وتعني هذه النتائج أن نظام تسجيل زيارتها انخفاض مستوى الضجيج، وكان تأثيره على التحليلات هامشية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Neuroethological الدراسات الرؤية

يمكن أن تستخدم أيضا طريقة لتسجيل استجابات قبل وبعد المشبكي الجهد من عيون مجمع أنواع الحشرات المختلفة 7،8،35،36 (الشكل 10)، والسماح الدراسات neuroethological النسبية لمعالجة المعلومات البصرية. لنظام تسجيل المقدمة، والتكيف المطلوب فقط هو أصحاب إعداد جديد، مع كل فتحة مناسبة الحجم لتلك الانواع. هذه التسجيلات المثالية هي من قاتل الإناث ذبابة (Coenosia attenuata). وهي تظهر استجابات الجهد داخل الخلايا لمبصرة R1-R6 ومركز إدارة السيولة المالية لمطابقة التحفيز ضوء المتكررة، كما تستخدم لنظرائهم ذبابة الفاكهة في الشكل 9، ولكن في 19 درجة مئوية. في هذه الحالة، وسجلت كل من قبل والبيانات بعد المشبكي من نفس ذبابة. واحدا تلو الآخر، مع نفس تسجيل الكهربائي (مليئة 3 M بوكل) تقدم لأول مرة من خلال الصفيحة الجانبية قبل الدخولجي الشبكية الأمامية. وبالمقارنة مع بيانات ذبابة الفاكهة في 25 درجة مئوية، والبيانات Coenosia - حتى في درجة حرارة أكثر برودة - يظهر استجابات مع ديناميات أسرع. توسيع نطاق إشارات موثوقة (نسبة الإشارة إلى الضوضاء >> 1) على نطاق وتردد على نطاق أوسع. هذه التكيفات الوظيفية في ترميز العصبي للمحفزات طبيعية تتماشى مع نمط الحياة Coenosia الصورة المفترسة 36، والتي تتطلب درجة عالية من الدقة المعلومات الزمانية المكانية لتحقيق سريع السلوكيات الصيد الجوي.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قدمنا الخطوات الرئيسية الأساسية لكيفية استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة التقليدية الحادة لتسجيل الاستجابات داخل الخلايا للمستقبلات الضوئية R1-R6 و LMCs في عيون الذباب السليمة. تم تحسين هذه الطريقة ، جنبا إلى جنب مع أدوات الأجهزة والبرامج المخصصة ، على مدار ال 18 عاما الماضية لتوفير تسجيلات عالية الجودة طويلة الأمد للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية. من خلال استثمار الوقت والموارد لبناء إعدادات تجريبية قوية ودقيقة ، وإنتاج أقطاب كهربائية دقيقة ذات خصائص كهربائية مواتية ، يمكن أن تصبح التسجيلات عالية الجودة هي القاعدة في أي مختبر يعمل على ذبابة الفاكهة الفيزيولوجيا العصبية البصرية. في حين أن أنظمة التسجيل وتحفيز الضوء المصممة جيدا مهمة للتنفيذ السريع للنماذج التجريبية المختلفة ، إلا أن هناك ثلاث خطوات إجرائية أكثر أهمية لتحقيق تسجيلات ناجحة: (1) تحضير الذبابة بأقل قدر من تلف العين ، (2) سحب الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الخصائص الكهربائية الصحيحة ، و (3) لدفع قطب التسجيل إلى العين دون كسر طرفه. في النهاية ، لتسجيل بيانات ذات مغزى ، يتعين على الباحث فهم الأساس الفيزيائي للفيزيولوجيا الكهربية وكيفية تصنيع أقطاب كهربائية دقيقة مناسبة لأنواع الخلايا المستهدفة.

لذلك ، يتم تحديد قيود هذه التقنية في المقام الأول من خلال صبر المحقق وخبرته وقدرته التقنية. نظرا لأن هذه التقنية قد تستغرق وقتا طويلا لإتقان خلايا ذبابة الفاكهة الصغيرة ، فمن المستحسن لأخصائيي الفيزيولوجيا الكهربية المتدربين أن يتدربوا أولا مع عيون الحشرات الأكبر ، مثل الذبابة36 أو الجراد35 ، باستخدام نفس الحفارة. بمجرد أن يصبح إجراء تسجيلات عالية الجودة داخل الخلايا من المستقبلات الضوئية الأكبر والخلايا العصبية الداخلية أمرا روتينيا ، فقد حان الوقت للانتقال إلى ذبابة الفاكهة . هناك قيد آخر لهذه التقنية يتعلق بتحديد الهوية الخلوية. يمكن تحميل خلايا ذبابة الفاكهة المخترقة كهربائيا بالأصباغ ، بما في ذلك لوسيفر الأصفر أو نيوروبيوتين. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم طرف الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، يعمل الرحلان الكهربائي بكفاءة أقل من الأقطاب الكهربائية ذات المقاومة المنخفضة ، مثل أقطاب التصحيح. علاوة على ذلك ، فإن الأقطاب الكهربائية الدقيقة المملوءة بالصبغة لها خصائص كهربائية أقل ملاءمة ، مما يجعل من الصعب جدا تسجيل استجابات عالية الجودة معها من ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية و LMCs.

المشكلة الفنية التي تحدث في بعض الأحيان هي إشارة الإدخال غير المستقرة ، أو النقص التام فيها. غالبا ما يرتبط هذا بإشارة الجهد إما الانجراف باستمرار أو أعلى / أقل من نطاق تسجيل مكبر الصوت. في معظم المناسبات ، يحدث هذا السلوك بسبب حظر قطب التسجيل (أو أن طرفه ناعم جدا - لديه مقاومة عالية جدا أو سعة داخلية - لإجراء تغييرات سريعة في الإشارة بشكل صحيح). على الرغم من أنه يمكن للمرء أن يحاول إلغاء حظر الطرف عن طريق أزيز سعة القطب ، والذي يعمل في بعض الأحيان ، إلا أنه غالبا ما يتم حل الموقف بشكل أفضل عن طريق تغيير قطب التسجيل. قد يتطلب ذلك أيضا تعديلات على المعلمات في أداة مجتذب القطب الكهربائي الصغير لتقليل مقاومة طرف الأقطاب الكهربائية الجديدة. يمكن أيضا أن يصبح طرف القطب الكهربائي مسدودا في المستحضرات ، والتي استغرق الأمر وقتا طويلا لتغطية ثقب القرنية بالفازلين. يمكن أن يؤدي التلامس المطول للهواء إلى تجفيف أنسجة الشبكية المكشوفة حديثا ، وتحويل الطبقة السطحية إلى مادة تشبه الغراء. إذا كان هذا هو الحال ، فعادة ما يرى المحقق فقاعة حمراء من الأنسجة عالقة على قطب التسجيل عند سحبها من العين. الحل الوحيد هنا هو إجراء إعداد جديد. قد يوفر الفازلين العديد من الفوائد للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية: (ط) يمنع تخثر الهيموليمف الذي يمكن أن يكسر طرف القطب. (ثانيا) يغطي طرف القطب الكهربائي مما يقلل من سعته الداخلية ، مما يقلل من ثابت وقت القطب ، وبالتالي لديه القدرة على تحسين الدقة الزمنية للإشارات العصبية المسجلة40،41 ؛ (ثالثا) يحافظ على نظافة طرف القطب الكهربائي ، مما يسهل الاختراقات ؛ وبعد الاختراق ، (رابعا) قد يساعد حتى في إغلاق طرف القطب الكهربائي لغشاء الخلية42.

يمكن أن تكون الإشارة غير مستقرة أو مفقودة عندما يتم كسر سلك كلوريد الفضة لحامل القطب الكهربائي أو إزالة الكلور. في هذه الحالة ، ما عليك سوى استبدال السلك القديم أو إعادة كلوريده. يمكن أن تنتج الإشارة المفقودة أيضا عن عدم توصيل أحد (أو كليهما) من حاملي الأقطاب الكهربائية بإحكام بمقابسهم. ومع ذلك ، فمن غير المعتاد للغاية أن تكون قطعة من المعدات معطلا. إذا كانت الإشارة غير قابلة للاكتشاف وتم استنفاد جميع الاحتمالات الأخرى ، فاختبر أن كل جزء من جهاز التسجيل ، بما في ذلك المسرح الرئيسي ومكبر الصوت ومرشحات التمرير المنخفض ومحولات AD / DA ، متصل بشكل صحيح ويعمل بشكل طبيعي. تتمثل إحدى طرق تحقيق ذلك في استبدال كل أداة بأخرى من منصة معروفة بأنها تعمل بشكل طبيعي. بدلا من ذلك ، استخدم مولد إشارة للتحقق من أداء المكونات الإلكترونية واحدة تلو الأخرى.

ولكن ربما تكون المشكلة التقنية الأكثر شيوعا التي تواجه أخصائي الفيزيولوجيا الكهربية هي مشكلة تسجيل الضوضاء. على نطاق واسع ، تسجيل الضوضاء هو النشاط الكهربائي الملحوظ بخلاف الاستجابة العصبية المباشرة لمحفز معين. نظرا لأن تحضير الذبابة ، عند القيام به بشكل صحيح ، يكون مستقرا للغاية ، فإن الضوضاء المرصودة (بما يتجاوز المتغير الطبيعي للاستجابات) غالبا ما تنتج عن حلقات أرضية في معدات التسجيل ، أو يتم التقاطها من الأجهزة الكهربائية القريبة. عادة ما تكون هذه الضوضاء 50/60 هرتز همهمة التيار الكهربائي وتوافقياتها. ولكن في بعض الأحيان تتكون من أشكال موجية أكثر تعقيدا. لمعرفة أصل الضوضاء ، قم بإزالة حامل تحضير الذبابة من الإعداد ، وقم بتوصيل أقطاب التسجيل والمرجع من خلال قطرة من ذبابة Ringer (أو ضعها في حمام محلول Ringer صغير ؛ انظر الخطوة 1.2.6) وسجل الإشارة في وضع CC أو الجسر. إذا كان من الممكن ملاحظة الضوضاء على الإشارة المسجلة ، فهذا يعني على الأرجح أن الضوضاء خارجية لإعداد الذبابة.

اختبار جيد آخر لتحديد أصل الضوضاء هو استبدال حاملات الأقطاب الكهربائية بنموذج خلية كهربائية متصل بمكبر الصوت. في الإعداد المثالي الذي تم تكوينه وتأريضه ، يجب أن تكون الإشارة المسجلة الآن خالية من الضوضاء عمليا ، وتظهر فقط ضوضاء بت عشوائية من محول AD (في أفضل الأحوال ليس حتى ذلك!). إذا كانت الضوضاء لا تزال موجودة ، فأعد التحقق من أن جميع معدات الحفارة مؤرضة بشكل صحيح. النهج المناسب للكشف عن الحلقات الأرضية هو: (ط) فصل جميع أسلاك التأريض عن جميع الأجزاء داخل الحفارة. (ثانيا) التأكد من أنه بعد القيام بذلك ، يتم عزل كل جزء بالفعل عن الأرض ، عن طريق أوم متر ؛ (ثالثا) توصيل الأجزاء ، واحدة تلو الأخرى ، بالأرض المركزية مباشرة ، وليس من خلال أي جزء آخر من الحفارة. حاول أيضا تغيير تكوينات المعدات. على سبيل المثال ، في بعض الأحيان ، يمكن أن يؤدي تحريك الكمبيوتر والشاشة بعيدا عن الحفارة إلى تقليل الضوضاء ؛ ومع ذلك ، في أوقات أخرى ، يؤدي تحريك الكمبيوتر داخل رف المعدات إلى تقليل الضوضاء. يجدر أيضا فصل المعدات القريبة لمعرفة ما إذا كانت الضوضاء قد انخفضت ، أو تحمي المكونات الإضافية. علاوة على ذلك ، حاول فصل أو استبدال المكونات المختلفة لمعدات التسجيل ، وخاصة كبلات BNC (التي يمكن أن تحتوي على توصيلات أرضية معيبة). إذا لوحظت ضوضاء البت فقط عند استخدام نموذج الخلية ، فإن مصدر الضوضاء الأولي هو إما الأقطاب الكهربائية أو تحضير الذبابة نفسه. على سبيل المثال ، قد يكون القطب المرجعي يلمس عن غير قصد عصبا حركيا أو ألياف عضلية نشطة داخل كبسولة الرأس (أو تزعج عضلات الطيران في الصدر - إذا تم وضعها هناك). عادة ما يكون من الأبسط تحضير ذبابة جديدة للتسجيل ، مع الحرص على تقليل الضرر الذي يلحق بالذبابة. ولكن إذا استمرت الضوضاء وكانت عريضة النطاق ، فمن المحتمل أن تكون الأقطاب الكهربائية دون المستوى الأمثل للتجارب. حاد جدا / غرامة (وبالتالي صاخبة جدا) أو مجرد خاطئ لهذا الغرض ؛ لقد رأينا حتى أقطاب كوارتز تعمل كهوائيات - تلتقط إشارات بث باهتة! على الرغم من أن تكرار إعدادات معلمات أداة السحب لإنشاء الأقطاب الكهربائية الدقيقة المناسبة تماما لتسجيلات متسقة عالية الجودة من أنواع خلايا معينة يمكن أن يستغرق الكثير من الجهد ، إلا أن الأمر يستحق ذلك. بمجرد تصميم أقطاب التسجيل بشكل جيد للتجارب ، يمكنها توفير تسجيلات طويلة الأمد بجودة فائقة.

يمكن تطبيق تقنيات تسجيل الأقطاب الكهربائية الدقيقة الحادة بالمثل لدراسة معالجة المعلومات العصبية في العديد من المستحضرات ، بما في ذلك طبقات المعالجة المختلفة في عيون الحشرات والدماغ43،44. نظرا لأن أطراف الأقطاب الدقيقة يمكن أن تكون دقيقة جدا ، فإنها عادة ما تلحق الضرر بالخلايا المدروسة أقل من معظم تطبيقات المشبك التصحيح. الأهم من ذلك ، أن مكبرات الصوت الحديثة ذات العينات والتثبيت تتيح التحكم الجيد في الخصائص الكهربائية للأطراف40،45-47. وبالتالي ، عند تطبيقها بشكل صحيح ، يمكن أن توفر هذه التقنية بيانات موثوقة من كل من المستحضرات في الجسم الحي3،5،7-10،44 أو في المختبر48 مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية بدقة أقل من المللي ثانية. ستكون هذه الدقة مستحيلة مع تقنيات التصوير البصري الحالية ، والتي هي أكثر ضجيجا وأبطأ. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الطريقة لتوصيف خصائص الغشاء الكهربائي للخلايا الصغيرة في كل من تكوينات المشبك الحالي والجهد5،29،33،36،40-42،49 ، مما يوفر بيانات قيمة لمناهج النمذجة الفيزيائية الحيويةوالتجريبية 7،8،11،33،49-54 التي تربط التجارب بالنظرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون ميك سوان وكريس أسكام ومارتن غوتري على مساهماتهم المهمة في تصميم وبناء العديد من المكونات الكهربائية والميكانيكية للحفارات. يتم دعم أبحاث MJ الحالية من قبل مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (منحة BBSRC: BB / M009564/1) ، ومختبر الدولة الرئيسي لصندوق البحث المفتوح لعلم الأعصاب المعرفي والتعلم (الصين) ، ومنحة الخبراء الأجانب الراقية (الصين) ، وزمالة مؤسسة جين وأتوس إركو (فنلندا) ، ومنحة Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر تكبير ستيريو لصنع إعداد الذبابةعدسات أوليمبوسSZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H / 22قادرة على تكبير ~ 150X مع مسافة عمل طويلة ؛ حامل جبل طاولة فولاذية ثقيلة حسب الطلب
مجهر مجسم في الإعداد داخل الخلايا& middot ؛   أوليمبوسأوليمبوس SZX7 ؛ العدسات: العدسات WHN30x-H / 2230X مطلوبة لرؤية انعكاسات طرف القطب الكهربائي جيدا عند قيادتها عبر ثقب القرنية الصغير في العين مجهر
نيكوننيكون SMZ645 ؛ العدسات: C-W30x / 7
طاولة مضادة للاهتزازMelles Griotمع فتحات مترية M6 على اللوحتحتوي حفاراتنا المخصصة على ثقب كبير محفور من خلال لوح التجارب السميك الذي يسمح بدخول عمود منصة تحضير الذبابة (يضم غرفة تبريد نحاسية مع إلكترونيات) من أسفل
Newport
MicromanipulatorsNarishige NarishigeNMN-21في إعداداتنا داخل الخلايا ، يتم استخدام أنظمة معالجة دقيقة مختلفة لدفع أقطاب تسجيل التشكيل في عين الذبابة. جميع المتلاعبين المدرجين يقدمون بنجاح تسجيلات مستقرة طويلة الأمد من ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية و LMCs.
Huxley BertramHuxley xyz-axis مع التحكم
SensapexSensapex ثلاثي المحور
M & auml ؛ rzh ä مستخدمMä rzh ä المستخدم DC-3K مع السائر بيزو المحور X الإضافي ووحدة تحكم
تقف مغناطيسية أيقاعدة مغناطيسية مع مفتاح تشغيل / إيقاف ستفعلعلى سبيل المثال ، لإدارة الكابلات داخل قفص فاراداي
حاملي القطبالكهربائي هارفارد جهازESP / W-F10N
الأسلاك الفضيةالعالمية أدوات الدقة   ؛AGW15100.3 - 0.5 مم قطرها ؛ يحتاج إلى الكلور لحاملي الأقطاب
الكهربائية مصدر ضوء الألياف البصريةالعديد من الأشكال المختلفة ، بما في ذلك Olympus
Fiber Optic Bundlesتقنيةلتوصيل محفز ضوء LED إلى نظام ذراع كاردان. نحن نستخدم كلا من أدلة الضوء السائل والكوارتز (تتراوح من الأشعة فوق البنفسجية إلى الأشعة تحت الحمراء)
Thorn Labs
Fly Cathing TubeP80-50P 50ml Cent. Tube PP. ، عبوة من 100 قطعةقطع الجزء السفلي المخروطي من أنبوب الطرد المركزي البلاستيكي سعة 50 مل وقم بلصق طرف ماصة سعة 1 مل عليه.
نظام الاستحواذ الرقميالأدوات
مضخم القطب الكهربائي الصغير ذو التيار الكهربائي / الجهد المشبكأحادي القطب npi SEC-10LXhttp://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.htmlأداء متميز!
مرحلة الرأس(+/- 150 nA)npi SEC-10LX
LEDLED ثنائية القناة OptoLED (Cairn Research Ltd. ، المملكة المتحدة)العديد من أنظمة التحفيز لدينا مدمجة داخليا.
برامج الاستحواذ والتحليلات
الكمبيوتر الشخصي أو Macالتأكد من أن الكمبيوتر الشخصي أو Mac متوافق مع نظام الحصول على البيانات والبرامج
مصممة ذاتيا وبنيتتوفير تحديد المواقع بدقة x ، y ، z لمحفزات الضوء
نظام التحكم في درجة الحرارة Peltier   ؛مصمم ذاتيا ومصنوع
حماية من الضوضاء الكهرومغناطيسية الخيط
0.7 مم
ماصة مجتذبأداة Sutter Instrument شركةموديل P-2000 مجتذب ليزر مشتعل / براون مجتذب ماصة دقيقةلأقطاب البورسليكات المرجعية ، استخدم البرنامج المحدد مسبقا # 11 (أقطاب التصحيح): الحرارة = 350 ؛ خيوط = 4 ؛ السرعة 36 ؛ التأخير = 200).1.2.1). بالنسبة لأقطاب تسجيل البورسليكات ، استخدم البرنامج المحدد مسبقا # 12 (هذا عادة ما يسحب الأدوات الحادة التقليدية الجيدة لتسجيلات المستقبلات الضوئية): الحرارة = 355 ؛ خيوط = 4 ؛ السرعة 50 ؛ التأخير = 225 ؛ سحب = 150. بالنسبة لتسجيلات LMC ، التي تتطلب أقطاب كهربائية ذات أطراف أدق ، يجب تعديل هذه القيم. لسحب الشعيرات الدموية الكوارتز ، يقترح دليل P-2000 برامج للأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الرؤوس الدقيقة. هذه البرامج تعمل المعلمات المحددة مسبقا كنقاط انطلاق مفيدة للتعديلات المنهجية لتوليد أقطاب كهربائية بنجاح اختراق جيد وضوضاء تسجيل منخفضة.
محلول رنجر خارج الخلية للكيماويات الكهربية المرجعيةمن 10326390 فيشر العلمي، كلوريد الصوديوم 10010310 ، KCl 10147753 ، TES 10161800 ، CaCl2 10159872 ، MgCl2 10000430 ، السكروزانظر الوصفة في قسم البروتوكول
3 M KCl لملء أملاح القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل الخيطيةمن 10010310 فيشر العلمي، KCl
الفازلينفاسيلين
شفرات حلاقة غير من الفولاذ المقاوم للصدأ
اليدوي الدقيقMS 314 UltraFine الوطنيةمعيار لمصادر وبرامج تشغيل المصممة ذاتيا والمبنية العديد من الشركات للاختيار من بينها Biosyst; نظام مكتوب مخصص على أساس Matlab للعمل التجريبي والنظري في مختبر Juusola نظام ذراع كاردان قفص فاراداي ذاتيا الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات القطر الخارجي: 1 مم القطر الداخلي: 0.5 - 0.7 مم الشعيرات الدموية الزجاجية الكوارتز الخيطية القطر الخارجي: 1 مم القطر الداخلي: 0.5 - حامل شفرة / قواطع أدوات العلوم الدقيقة من Dumont 10053-09 9 سم Blu-tack Bostik بدلا من ذلك ، استخدم أدوات العلوم الدقيقة من ملقط الطين من Dumont 11252-00#5SF (أطراف فائقة الدقة)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
  2. Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
  3. Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
  4. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
  5. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
  6. Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
  7. Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
  8. Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
  9. Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
  10. Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
  11. Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
  12. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
  13. Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
  14. Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
  15. Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
  16. Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
  17. Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
  18. Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
  19. Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
  20. Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
  21. Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
  22. Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
  23. Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
  24. Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
  25. Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
  26. Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
  27. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
  28. Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
  29. Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
  30. Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
  31. Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
  32. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
  33. Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
  34. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
  35. Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173(2008).
  36. Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
  37. Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
  38. Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
  39. Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
  40. Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
  41. Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
  42. Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
  43. Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
  44. Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
  45. Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
  46. Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
  47. Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
  48. Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
  49. Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
  50. Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
  51. Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
  52. French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
  53. Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
  54. Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة