الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي

Kathryn A. Ramsey; Zachary L. Rushton; Camille Ehre

doi:10.3791/54153

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي

27K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54153

⸱

يونيو 14, 2016

Kathryn A. Ramsey¹^,² , Zachary L. Rushton¹ , Camille Ehre¹^,³

¹Marsico Lung Institute/CF Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Telethon Kids Institute, University of Western Australia, ³Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'>Mucins عبارة عن جليكوكونجوجات عالية الوزن الجزيئي ، يتراوح حجمها من 0.2 إلى 200 ميجادالتون (MDa). نتيجة لحجمها ، لا تخترق الميوسين المواد الهلامية التقليدية بولي أكريلاميد وتتطلب مسام أكبر للفصل. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا للرحلان الكهربائي لهلام الميوسين الاغاروز لتقييم القياس الكمي النسبي ودراسة تجميع البوليمر.

الملخص

Mucins، البروتينات بشكل كبير الغليكوزيلاتي بطانة الأسطح المخاطية، وقد تطورت باعتبارها عنصرا أساسيا للدفاع الفطرية عن طريق حماية البشرة ضد مسببات الأمراض الغازية. الدور الرئيسي لهذه الجزيئات هو تسهيل محاصرة الجسيمات والتخليص مع تعزيز تزييت من الغشاء المخاطي. خلال تخليق البروتين، mucins الخضوع الشديد O-بالغليكوزيل وmultimerization، مما يزيد بشكل كبير من كتلة وحجم هذه الجزيئات. هذه التعديلات بعد متعدية بالغة الأهمية بالنسبة لخصائص اللزجة من المخاط. ونتيجة لطبيعة الكيمياء الحيوية والبيولوجية الفيزيائية المعقدة لهذه الجزيئات، والعمل مع mucins يوفر العديد من التحديات التي لا يمكن التغلب عليها عن طريق أساليب تحليل البروتين التقليدية. على سبيل المثال، من ارتفاع الوزن الجزيئي يمنع الهجرة الكهربي عن طريق المواد الهلامية بولي أكريلاميد العادية وطبيعتها لزجة تسبب التصاق لأنابيب التجريبية. ومع ذلك، والتحقيق في دور mucins في الصحة(على سبيل المثال، الحفاظ على سلامة الغشاء المخاطي) ومرض (على سبيل المثال، hyperconcentration، mucostasis، السرطان) ويجري التحقيق اكتسبت في الآونة الأخيرة اهتماما وmucins كهدف علاجي. فهم أفضل للإنتاج ووظيفة الجزيئات الميوسين قد يؤدي إلى نهج الأدوية الجديدة، على سبيل المثال، مثبطات الميوسين إيماس الحبيبية و / أو وكلاء حال للبلغم. لذلك، بروتوكولات متسقة وموثوق بها للتحقيق في علم الأحياء الميوسين حاسمة للتقدم العلمي. هنا، نحن تصف الأساليب التقليدية لفصل الجزيئات الميوسين قبل الكهربائي باستخدام هلام الاغاروز، ونقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، وكشف عن إشارة مع الأجسام المضادة الميوسين محدد وكذلك الأشعة تحت الحمراء القارئ هلام الفلورسنت. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الميوسين الكميات، multimerization ولاختبار آثار المركبات الدوائية على mucins.

المقدمة

ويتم إنتاج Mucins عادة الأسطح المخاطية التي تبطن التجاويف يتعرض للبيئة الخارجية (على سبيل المثال، الجهاز التنفسي، الجهاز الهضمي، ومساحات الإنجابية، سطح العين)، وكذلك الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال، البنكرياس والمرارة والغدد الثديية). وجود هذه البروتينات السكرية يحافظ على ترطيب سطح ويشكل حاجز مادي ضد مسببات الأمراض. على الرغم من أن إنتاج الميوسين ضروري لالمخاطية الصحية، الميوسين hyperconcentration و / أو خصائص مخاط الشاذة يمكن أن يؤدي إلى انسداد القناة والاستعمار الجرثومي والتهاب مزمن، والذي يمكن أن يسبب تلف الأنسجة لا رجعة فيه. ويلاحظ وجود سلسلة مشابهة من الأحداث في العديد من الأمراض، على سبيل المثال.،<....