يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي

27K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54153

⸱

يونيو 14, 2016

 ,  , 
1Marsico Lung Institute/CF Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'>Mucins عبارة عن جليكوكونجوجات عالية الوزن الجزيئي ، يتراوح حجمها من 0.2 إلى 200 ميجادالتون (MDa). نتيجة لحجمها ، لا تخترق الميوسين المواد الهلامية التقليدية بولي أكريلاميد وتتطلب مسام أكبر للفصل. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا للرحلان الكهربائي لهلام الميوسين الاغاروز لتقييم القياس الكمي النسبي ودراسة تجميع البوليمر.

الملخص

Mucins، البروتينات بشكل كبير الغليكوزيلاتي بطانة الأسطح المخاطية، وقد تطورت باعتبارها عنصرا أساسيا للدفاع الفطرية عن طريق حماية البشرة ضد مسببات الأمراض الغازية. الدور الرئيسي لهذه الجزيئات هو تسهيل محاصرة الجسيمات والتخليص مع تعزيز تزييت من الغشاء المخاطي. خلال تخليق البروتين، mucins الخضوع الشديد O-بالغليكوزيل وmultimerization، مما يزيد بشكل كبير من كتلة وحجم هذه الجزيئات. هذه التعديلات بعد متعدية بالغة الأهمية بالنسبة لخصائص اللزجة من المخاط. ونتيجة لطبيعة الكيمياء الحيوية والبيولوجية الفيزيائية المعقدة لهذه الجزيئات، والعمل مع mucins يوفر العديد من التحديات التي لا يمكن التغلب عليها عن طريق أساليب تحليل البروتين التقليدية. على سبيل المثال، من ارتفاع الوزن الجزيئي يمنع الهجرة الكهربي عن طريق المواد الهلامية بولي أكريلاميد العادية وطبيعتها لزجة تسبب التصاق لأنابيب التجريبية. ومع ذلك، والتحقيق في دور mucins في الصحة(على سبيل المثال، الحفاظ على سلامة الغشاء المخاطي) ومرض (على سبيل المثال، hyperconcentration، mucostasis، السرطان) ويجري التحقيق اكتسبت في الآونة الأخيرة اهتماما وmucins كهدف علاجي. فهم أفضل للإنتاج ووظيفة الجزيئات الميوسين قد يؤدي إلى نهج الأدوية الجديدة، على سبيل المثال، مثبطات الميوسين إيماس الحبيبية و / أو وكلاء حال للبلغم. لذلك، بروتوكولات متسقة وموثوق بها للتحقيق في علم الأحياء الميوسين حاسمة للتقدم العلمي. هنا، نحن تصف الأساليب التقليدية لفصل الجزيئات الميوسين قبل الكهربائي باستخدام هلام الاغاروز، ونقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، وكشف عن إشارة مع الأجسام المضادة الميوسين محدد وكذلك الأشعة تحت الحمراء القارئ هلام الفلورسنت. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الميوسين الكميات، multimerization ولاختبار آثار المركبات الدوائية على mucins.

المقدمة

ويتم إنتاج Mucins عادة الأسطح المخاطية التي تبطن التجاويف يتعرض للبيئة الخارجية (على سبيل المثال، الجهاز التنفسي، الجهاز الهضمي، ومساحات الإنجابية، سطح العين)، وكذلك الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال، البنكرياس والمرارة والغدد الثديية). وجود هذه البروتينات السكرية يحافظ على ترطيب سطح ويشكل حاجز مادي ضد مسببات الأمراض. على الرغم من أن إنتاج الميوسين ضروري لالمخاطية الصحية، الميوسين hyperconcentration و / أو خصائص مخاط الشاذة يمكن أن يؤدي إلى انسداد القناة والاستعمار الجرثومي والتهاب مزمن، والذي يمكن أن يسبب تلف الأنسجة لا رجعة فيه. ويلاحظ وجود سلسلة مشابهة من الأحداث في العديد من الأمراض، على سبيل المثال.، والتليف الكيسي 1، التهاب الأذن الوسطى المزمن 2 وإصابة عنقي مهبلي 3. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم دور mucins في الصحة والمرض ووضع بروتوكولات روتينية لتحديد البروتين.

ان يذهب في موعد، وقد تم تحديد 19 mucins الجينات وترميز لسلاسل ببتيد كبيرة تتراوح ما بين 1200 (على سبيل المثال، MUC1) إلى 22000 (على سبيل المثال، MUC16) الأحماض الأمينية. ويمكن تقسيم الأسرة الجينات الميوسين إلى نوعين: وmucins غشاء المرتبطة، والمشاركة في الخلايا مما يشير الى سطح التدريع، وmucins تشكيل هلام، المسؤولة عن الخصائص اللزجة من المواد الهلامية المخاط. mucins غشاء المرتبطة هي في معظمها أحادى ونعلق على سطوح الخلايا عبر النطاق الذي يمتد الغشاء مسعور. في المقابل، mucins تشكيل هلام تمتلك العديد من عامل فون ويلبراند (VWF) تشبه والسيستين الغنية المجالات التي لا غنى عنها لتشكيل شبكات البوليمرية ديناميكية. وتعلق glycans كبيرة لسيرين والمخلفات ثريونين توزع في جميع أنحاء apomucin. ويمكن لهذه يغوساكاريدس كثيفة المرتبطة يا تساهم بما يصل إلى 80٪ من الوزن الجزيئي (4). داخل وبين الجزيئية السندات ثاني كبريتيد ربط أحادية الميوسين ضمان سلامة الشبكه هلام الميوسينك. ونتيجة لبالغليكوزيل الثقيلة وmultimerization، mucins هي من بين أكبر الجزيئات في عالم الحيوان ولا يمكن تحليلها من قبل الكهربائي للهلام قياسي باستخدام هلام SDS-PAGE بولي أكريلاميد التقليدية وسلالم البروتين القياسية. هذه الأساليب حل / البروتينات منفصلة مع الأوزان الجزيئية أقل من 250 كيلو دالتون في حين أحادية الميوسين يمكن أن تصل إلى 2 نجمة داود الحمراء في حالة MUC16. ومع ذلك، وارتفاع الوزن الجزيئي بروتين سلالم يمكن استخدامها لدراسة أحادية الميوسين صغيرة (أي، MUC1).

مجموعة متنوعة من التقنيات يمكن تطبيقها على دراسة الميوسين الحجم والتشكل والتفاعل. تقليديا، يتم إنجاز توصيف البيوكيميائية mucins من الميوسين العزلة عبر الإيزوبيكنيكي الطرد المركزي الكثافة التدرج في المخزن تغيير طبيعة، تليها اللوني الحجم الإقصاء ومناعي (على سبيل المثال، فتحة النشاف) 5. ديناميكية و / أو متعددة زاوية تشتت الضوء توفير معلومات عن حالة بلازميدة قليلة القسيمات العينات الميوسين غنية <سوب> 1. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام الطرد المركزي النطاقي المعدل جانب مناعي ونقل المجهر الإلكتروني عادة لتحديد التشكل لجزيئات mucins 6. يستخدم قياس الطيف الكتلي أيضا لتحديد mucins، كشف انشقاق بروتين وتحليل قليل السكاريد 1،7،8 التكوين. هذه التقنيات مكلفة ومستهلكة للوقت وغالبا ما تتطلب كميات كبيرة و / أو تركيزات عالية من العينة. منهجية وصفت هنا، أي، الميوسين الفاصل الكهربائي، غير قابلة للتكرار، منخفضة التكلفة، ويمكن استخدامها في دراسات الإنتاجية العالية لتوفير النسبية الكميات الميوسين والتحقيق التجمع البوليمر. ومع ذلك، هذا الاختبار يتطلب عالية تقارب وعالية الدقة-الميوسين الأجسام المضادة التي قد لا تكون متاحة للmucins نادرة (على سبيل المثال، MUC19) أو أنواع معينة (على سبيل المثال، خنزير، النمس).

النشاف الغربي الاغاروز مناسبة لحل مجموعة واسعة من عينات الميوسين غني مع concentraستعقد بدءا من 50 ميكروغرام / مل (على سبيل المثال، يغسل الخلية) إلى 5 ملغ / مل (على سبيل المثال، البلغم). وقدم هذا الاختبار في 1990s، وأجري إلا في عدد قليل من المختبرات المتخصصة 9،10. في البداية، وقد ساعدت هذه التقنية تحديد جزء من السكان أحادية الميوسين في إفرازات الجهاز التنفسي الإنسان 11،12 وأكدت عملية oligomerization في الخلايا الكأسية، والذي يتألف من تشكيل ديمر في الشبكة الإندوبلازمية تليها multimerization ديمر في جهاز جولجي 13. وفي الآونة الأخيرة، وتوليد الأجسام المضادة ضد mucins الفئران تسهيل دراسات على نماذج حيوانية صغيرة (على سبيل المثال، الميوسين ناقصة، نماذج الماوس βENaC، OVA تحدى) وفتح مجال جديد للبحث عن الدراسات قبل السريرية مركبات اختبار الدوائية تهدف إلى إزالة المخاط من الرئتين 14-17. ونتيجة لاهتمام متزايد في الميوسين البيولوجيا وتوليد رواية، والأجسام المضادة الميوسين أكثر تحديدا، وصفنا hereiن منهجية لفصل mucins بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز، ونقل فراغ لالنيتروسليلوز وهما لونا كشف الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد المخازن لالميوسين جل الغربية التنشيف

  1. إعداد 1 لتر من 50X تاي عازلة (تريس، خلات-EDTA).
    1. في 700 مل من الماء المقطر (DH 2 O) إضافة 242 غرام من قاعدة تريس (0.4 م)، 57.1 غرام من حامض الخليك الجليدي (وزن السائل) (0.2 م) و14.61 غرام من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (50 ملم).
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع DH 2 O.
  2. إعداد 10 مل من 10X العازلة تحميل.
    1. إعداد 5 مل من العازلة 1X تاي. للقيام بذلك، قم بإضافة 5 مل من الجلسرين (50٪)، و 25 ملغ من اللون الأزرق برموفينول (0.25٪)، و 100 ملغ من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) (1٪).
  3. إعداد 2 لتر من العازلة 20x والصوديوم المالحة سترات (SSC).
    1. في 1.5 لتر من O 2 درهم، إضافة 350.6 غرام من كلوريد الصوديوم (3 م) و176.4 غرام من سترات الصوديوم (نا 3 C 6 H 5 O 7) (0.3 م). ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 وجعل وحدة التخزين إلى 2 ليتر مع DH 2 O.
  4. إعداد 1 لتر من العازلة 1X تاي 0.1٪ SDS.
    1. إضافة 20 مل من 50X تاي إلى 980 مل من درهم 2 O. إضافة 1 غرام من SDS لجعل 0.1٪ SDS-تاي حل.

2. تاي-SDS إعداد جل الاغاروز

  1. (. أي 150 مل) صب كمية كافية من 1X تاي 0.1٪ عازلة SDS في دورق مخروطي ميكرووافابل لجعل 5-7 هلام مم. إضافة 0.8٪ (1.2 غرام) مسحوق الاغاروز.
  2. قارورة الميكروويف في 30 ثانية فترات متقطعة مع دوامات حتى الاغاروز يذوب تماما (عادة 1-3 دقائق). استخدام منصات يد الساخنة خلال هذه العملية. كن حذرا من الغليان البركانية في حين يحوم.
  3. يسمح الحل الاغاروز ليبرد ل5-10 دقيقة. ملاحظة: الحل الاغاروز جاهزة للسكب عند أسفل القارورة يمكن أن يترك على راحة لمدة 5 ثوان.
  4. تحضير صينية الصب الكهربائي (10 × 15 سم) عن طريق ختم حواف مع الشريط ووضع جيد تمشيط في الموقف.
  5. صب الحل الاغاروز ببطء في تيانه صب علبة لتجنب تشكيل فقاعات. إزالة الفقاعات باستخدام طرف ماصة. انتظر هلام لتبرد وترسيخ تماما. مرة واحدة عزز، إزالة المشط ببطء لتجنب انهيار الآبار عن طريق الشفط وإزالة الشريط من حواف الدرج.
  6. وضع الجل الاغاروز في مربع هلام وملء وحدة الكهربائي مع٪ عازلة 1X 0.1 تاي SDS حتى يتم تغطية جل تماما.

3. تحميل عينة والكهربائي الفصل

ملاحظة: في المختبر لدينا، ونحن عادة استخدام عينات من كل من الفأر والإنسان، بما في ذلك السائل قصبي سنخي غسيل (BALF، وكلاهما الأنواع)، الغسيل خلية من الخلايا البشرية القصبية الظهارية (HBE)، واللعاب والبلغم العينات البشرية. عينات يمكن التشويه والتحريف في 6 M اليوريا على جمع أو تخزينها لفترات قصيرة من الزمن (6 ساعات) وذلك بإضافة بروتين كوكتيل المانع.

  1. إعداد نماذج للتحميل من خلال إضافة 10٪ من صبغ تحميل على كل عينة (أي 30 ميكرولتر من العينة و3ميكرولتر من صبغ). التجانس عينات من قبل pipetting صعودا وهبوطا. تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب عند 5000 دورة في الدقيقة لجمع قطرات.
  2. تحميل بعناية حجم مساو من عينات في الآبار.
    1. نصائح ما قبل الرطب و / أو استخدام ماصات الإزاحة الموجبة لتسهيل تحميل عينات لزجة جدا. ببطء نضح 80-90٪ من محلول العينة صبغ (أي 27 - 30 ميكرولتر) لتجنب الفقاعات pipetting ل.
    2. تحميل ببطء في الجزء السفلي من الآبار والانتقال تدريجيا إلى طرف الماصة التصاعدي. للعينات التي لا تزال تعلق على طرف ماصة، الاستغناء في زاوية 45 درجة واستطال مباشرة فوق البئر أو بلطف استخدام الجانب من البئر لكسر مخاط لزج. لا تفرط في الآبار.
  3. قم بتوصيل أقطاب كهربائية من مربع هلام لمولد الطاقة الكهربائي. ضمان توصيل الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح (أي والرصاص الأحمر توصيله إلى الناتج الإيجابي للمولد) للسماح سلبا اتهم mucins لتشغيل نحو إيجابي القطب.
  4. تشغيل هلام في 80 فولت لمدة 90 دقيقة لجل مشط واحد، أو 60-75 دقيقة لجل مشط مزدوج لمنع التداخل بين صفين.
  5. تحويل مولد OFF السلطة وقطع الأقطاب من مصدر الطاقة.
  6. إزالة بعناية الجل من مربع هلام مع يد واحدة على كل جانب من جانبي الدرج الصب لضمان يبقى جل في المكان.

4. تقليل الاغاروز جل لكفاءة نقل الميوسين

  1. وضع بعناية شقة هلام في وعاء زجاجي. شطف الجل مع DH 2 O لإزالة آثار عازلة تاي-SDS.
  2. إعداد 1 لتر من العازلة 4X SSC بإضافة 200 مل من 20x وSSC إلى 800 مل من درهم 2 O. جعل 200 مل من 10 ملي dithiothreitol (DTT) 4X SSC الحل بإضافة 309 ملغ من DTT جديدة في 200 مل من العازلة 4X SSC.
  3. نقع هلام مع العازلة DTT-4X SSC والغطاء. صخرة بلطف لمدة 20 دقيقة (10 التناوب في الدقيقة الواحدة). شطف هلام مع العازلة 4X SSC DTT خالية.
"> 5. فراغ الجمعية النشافة ونقل العينة إلى النيتروسليلوز غشاء

  1. إعداد فراغ نشافة للنقل.
    1. قطع بعناية غشاء النيتروسليلوز في أبعاد أوسع قليلا من الجل (أي 10 × 15 سم).
    2. حصيرة مسامية الرطب مع DH 2 O ووضعه على نحو سلس جنبا حتى في ورق نشاف.
    3. الرطب النيتروسليلوز غشاء العازلة مع SSC 4X DTT خالية ووضعه في وسط حصيرة التي يسهل اختراقها.
    4. تغطية حصيرة التي يسهل اختراقها مع طوقا المطاط، وترك افتتاح طوقا الانحياز على وجه التحديد مع غشاء النيتروسليلوز. إذا حصيرة مسامية لا تزال واضحة، وضبط بعناية الغشاء لضمان تزال توجد فجوة بين طوقا والغشاء.
  2. وضع بعناية agarose هلام على رأس الغشاء. ضمان أشكال هلام يتم وضع ختم ضيق مع طوقا والآبار من هلام على الغشاء لنقل.
    1. تجنب تشكيل فقاعات بين الغشاء وهلام. للحد منتشكيل فقاعات، بخ بضع قطرات من 4X SSC العازلة على الغشاء، وحرك جل من أعلى إلى أسفل لطرد أي فقاعات تشكيلها. تجنب تحريك الجل على الغشاء كما ستبدأ البروتينات إلى وصمة عار على الفور.
  3. تغطية بعناية هلام مع العازلة 4X SSC.
  4. بدء نقل الميوسين عن طريق الشفط.
    1. تحويل نشافة فراغ على والضغط وضعت في 40 - 50 ميللي بار. إضافة بضع قطرات من العازلة 4X SSC على هلام كل 5-10 دقيقة لمنع جل من الجفاف. نقل تشغيل لمدة 90 دقيقة. اختياري: عند الانتهاء، بمناسبة الآبار مع قلم رصاص للتوجيه.
  5. التخلص من هلام واسترجاع غشاء النيتروسليلوز باستخدام الملقط البلاستيك على حافة الغشاء.

6. حجب غشاء وكشف

  1. شطف الغشاء فورا مع المياه المالحة الفوسفات-1X (PBS). لا تدع غشاء تجف.
  2. تزج الغشاء في 50 مل من 3٪ الحليب PBS عازلة تمنع ومكان على ريال عمانيCKER في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد الحضانة، وتجاهل المخزن المؤقت الحجب.
  3. تزج الغشاء في 1٪ الحليب PBS حل الأجسام المضادة الأولية. احتضان الغشاء في حل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. بعد الحضانة، وتجاهل حل الأجسام المضادة الأولية. تمييع الأجسام المضادة الأولية لنسبة 1: 2000 من حل الأجسام المضادة لعرقلة العازلة. ملاحظة: للحصول على عينات القادمين من الفئران، ونحن نستخدم UNC 222 أرنب مكافحة Muc5b والماعز البروتين مكافحة الفلوري الأخضر (GFP). للعينات التي تنشأ من البشر، ونحن نستخدم مكافحة MUC5B و45M1 مكافحة MUC5AC الأجسام المضادة الأولية H300.
  4. غسل غشاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة على الكرسي الهزاز.
  5. تزج الغشاء في 1٪ الحليب PBS حل الضد الثانوية. تمييع الأجسام المضادة الثانوية إلى نسبة 1: 7500 من حل الأجسام المضادة لعرقلة العازلة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز (على سبيل المثال، 700 المضادة للأرنب و 680 المضادة للماعز). يحفظ بعيدا عن الضوء التي يحتضنها في التعاون غير شفافةNTAINER. تجاهل الحل الضد الثانوية بعد 1 ساعة.
  6. غسل غشاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. شطف الغشاء مع DH 2 O لإزالة الملح.
  7. قراءة غشاء على نظام مضان الأشعة تحت الحمراء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتبين لنا نتائج ممثل من الميوسين التعبير التالي الكهربائي للهلام الاغاروز في BALF من رئات الفئران (الشكل 1). في هذا المثال، استخدمنا هلام الاغاروز لإظهار upregulation من الميوسين إنتاج التالية IL-13 معاملة نموذج الفأر TG-Muc5ac. وتبين لطخة غربية تمثيل مرئي من الميوسين التعبير، والتي يمكن استخدامها لتحليل كمي متعدد القسيمات أو الفرقة مونومر شدة إشارة (الشكل 2). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإظهار تعبير عن mucins...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول الميوسين النشاف الغربي هو موضح في هذا الفيديو يجمع بين التقنيات التقليدية المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية لفصل ونقل الجزيئات الكبيرة، مثل الحمض النووي، مع التقنيات العادية للكشف عن البروتين، أي، immunoblotting. ويمكن تطبيق نفس التقنية لدراسة بيولوجيا الجليكوسامينوجليكان المعقدة، مثل انهيار عالية الوزن الجزيئي حمض الهيالورونيك 18. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من فحوصات، يعتمد نجاح الغرب النشاف الاغاروز على عدد وافر من الخط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم الصراع في الكشف عنها.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جون شيهان والدكتورة لبنى عبد الله على توجيههم وتوجيههم اللذين كان لهما دور محوري في إنجاز هذا العمل. تم دعم هذا العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (P01HL108808 ، UH2HL123645) ومؤسسة التليف الكيسي العلاجات، Inc. (EHRE07XX0). كاثرين رامزي مدعومة من قبل زمالة NHMRC Early Career Research.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تريس بيسسيجماT6060-1 كجم1 كجم
حمض الخليك الجليديسيجماARK2183-1 لتر1 لتر
EDTASigmaEDS-100 جم100 جم
جلسرينفيشرBP229-11 لتر
بروموفينول بلوسيجما114391-5 جم5 جم
SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)سيجماL6026-50 جم50 جم
20x SSC (سترات الصوديوم المالحة) العازلةPromegaV42611 لتر
كلوريد الصوديومفيشرS271-11 كجم
سترات ثلاثي الصوديوم (Na3< / sub>C6H5O7)SigmaW302600-1kg1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)  سيجماD063225 جم
حليب مجففساكوحليب جاف فوري خالي الدسم
دولبيكو فوسفات محلول ملحي مخزن (D-PBS)جيبكو لايف تكنولوجيز14200-025500 مل
الأجسام المضادة للماعز الأولية المضادة للجبن الكريم (عينات الفئران)الأجسام المضادة والمقايسات من روكلاند600-101-2151 مجم
UNC 222 الأجسام المضادة الأولية للأرانب المضادة للمخاط 5b (عينات الفئران)UNC
H300 الأجسام المضادة الأولية المضادة ل MUC5B (عينات بشرية) سانتاكروزsc-20119200 &# 956 ؛ ز
45M1 الأجسام المضادة الأولية المضادة ل MUC5AC (عينات بشرية)Abcamab3649100 &# 956 ؛ ز
الحمار المضاد للأرانب 800CW صبغة الأشعة تحت الحمراءLI-COR Biosciences926-322130.5 ملغ الحمار
المضاد للفأر 680LT صبغ الأشعة تحت الحمراءLI-COR Biosciences926-680220.5 ملغ
جل الرحلان الكهربائي وصينية الصبأنظمة
صندوق إمداد الطاقةBioradنموذج 200/20
نشاف الغشاءAmersham & nbsp ؛10600016 
ورق Whatman وغشاء النيتروسليلوز جنرال إلكتريك 10 439 196
Boekel / Appligene Vacuum Blotter 230 vExpotech USA230600-2
نظام مضان الأشعة تحت الحمراء OdysseyLI-COR Biosciences
صندوق فصل البومة ورق

المراجع

  1. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  2. Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
  3. Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
  4. Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
  5. Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
  6. Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
  7. Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
  8. van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
  9. Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
  10. Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
  11. Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
  12. Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
  13. Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
  14. Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
  15. Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
  16. Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
  17. Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
  18. Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
  19. Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الترحيل الكهربائي للموسين على أغاروزتقدير كمية الموسينالارتباط السكري من النوع Oالنقل إلى غشاء النيتروسليلوزالأسطح المخاطيةالعينات ذات اللزوجة المرنةالحالة البوليمريةنوعية الأجسام المضادة
الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.