مقالة منهجية

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

DOI:

10.3791/54161

⸱

يوليو 13, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديد الدقيق والمكان من الخلايا الظهارية على طول بطانة مخاطية الأمعاء ضرورية لتحديد الأنساب مختلفة من الخلايا. التصوير السليم للأنسجة الأمعاء هو أمر حاسم لتحديد أنماط التعبير البروتين مع قرار الحد الأقصى. وتهدف هذه الدراسة لتحديد الأساليب والظروف المثلى لأنسجة الأمعاء معالجة الماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المهم فهم دور العوامل التي تنظم التوازن الظهاري المعوي والاستجابة للإصابة والتجديد. تصف الأدبيات الحالية العديد من الأساليب المنهجية المختلفة للحصول على صور لأنسجة الأمعاء للتحقق من صحة البيانات. في هذه الورقة ، نحدد بروتوكولا مشتركا يتعلق بشتقاق ومعالجة أنسجة الأمعاء في الفئران. تتم مناقشة التثبيت الصحيح لأنسجة الأمعاء وتقنيات Swiss-roll التي تعزز مورفولوجيا الظهارة المعوية. تعد المعالجة اللاحقة للاستئصال وإعادة توجيه الأنسجة المعوية المدمجة أمرا بالغ الأهمية في الحصول على كتل مدمجة في البارافين تعرض سمات هيكلية معوية سليمة بعد التقسيم. تساعد تقنية الدرفلة السويسرية في التقييم النسيجي للأقسام المعوية أو القولون الكاملة التي تم فحصها. يمكن أن تكون القدرة على التمييز بين السمات الهيكلية المعوية حيوية في القياسات الكمية لالتهاب الأمعاء وتكوين الأورام على طول الطول. أخيرا ، تعتبر الأقسام المدمجة في البارافين مثالية للمعالجة القوية باستخدام كل من طرق الكشف عن الكيمياء المناعية والفلورية المناعية. توفر الأقسام الكيميائية المناعية غير الفلورية صورة نابضة بالحياة للأنسجة توضح بالتفصيل السمات الهيكلية الخلوية المختلفة ولكنها لا توفر المرونة لتجارب التوطين المشترك داخل الخلايا. يمكن استخدام قنوات الفلورسنت المتعددة بشكل مناسب مع الكشف عن الفلورسنت المناعي لتجارب التوطين المشترك ، مما يوفر الدعم للدراسات الميكانيكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتألف ظهارة الأمعاء الثدييات طبقة واحدة من الخلايا عمودية. في الأمعاء الدقيقة، تقتصر الخلايا التكاثري إلى الخبايا في حين تحتل خلايا متمايزة منطقة زغابة. ومع ذلك، بسبب عدم وجود الزوائد في الأمعاء الغليظة، يتم ترجمة الخلايا التكاثري إلى الجزء السفلي من الخبايا والخلايا المتمايزة تحتل المنطقة العليا من الخبايا. ظهارة الأمعاء يخضع تجديد السريع (حوالي 3-5 أيام) التي يقودها الانقسام المستمر للخلايا التكاثري داخل الأقبية. خلايا التكاثري من الخبايا ليست متجانسة السكان وتنقسم الى مزيد من الخلايا الجذعية و(TA) العبور تضخيم الخلايا 1. الخلايا الجذعية الموجودة في الجزء السفلي من سرداب، خلال أول 4-5 خلايا من الجزء السفلي جدا 2. النموذج الحالي يدعم وجود نوعين من الخلايا الجذعية: الخلايا الجذعية سرداب قاعدة عمودي (CBC) والاحتياطي الخلايا الجذعية هادئة. سي بي سي قخلايا تيم تنتشر بنشاط ويتم وضع علامة كل يسين الغنية التي تحتوي على تكرار G-بروتين بالإضافة مستقبلات 5 (Lgr5) 3، Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 و Achaete ترس مثل 2 (Ascl2) 5. من ناحية أخرى، وصفت الاحتياطي الخلايا الجذعية الساكنة التي كتبها B مولوني الفئران الموقع خلية محددة فيروس اللوكيميا التكامل 1 (Bmi1) 6، التيلوميراز الماوس عكس الناسخ (mTert) 7، HOP علبة مثلية (Hopx) 8، Doublecortin على غرار وكام كيناز تشبه 1 (Dclk1) 9، ويسين الغنية يكرر والمناعي، مثل مجالات 1 (Lrig1) 10. الخلايا الجذعية بنشاط تكاثر تثير خلايا TA ثم الخضوع لمزيد من التمايز إلى خلايا الاستيعابية (المعوية) والخلايا الإفرازية (enteroendocrine، كأس، خلايا بانيت، والخصلة). انقسام الخلايا المستمر في منطقة التكاثري النتائج في الحركة الصعودية للخلايا الظهارية على طول محور سرداب-زغابة حتى تصل إلى أعلى من الزغب، حيث أنها تخضع لموت الخلايا المبرمج، وهيتنفصل عن سطح البشرة. يتم وضع علامة على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية في الأمعاء عن طريق التعبير عن بروتينات مميزة (على سبيل المثال، الخلايا الكأس المعوية يمكن التعرف عليه بواسطة تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد Muc2 وبانيت الخلايا مع الأجسام المضادة ضد الليزوزيم). نقوم بدراسة دور العوامل Krüppel مثل (KLFs) في التوازن والبيولوجيا المرضية من ظهارة الأمعاء 11-13. وتستند النتائج المعروضة هنا تدعم جدوى تقنية السويسري المتداول تعديل على الدراسات السابقة لدور عامل Krüppel مثل 5 (KLF5) في الحفاظ على بنشاط تكاثر الخلايا الجذعية المعوية الظهارية 14. KLF5 هو عامل النسخ الزنك والإصبع التي يتم التعبير غاية في جذع الأمعاء نشطة وخلايا TA 12. وأظهرت دراسات سابقة أن KLF5 وشارك في التعبير عنها كي-67، علامة التكاثري المعروفة في الخبايا المعوية.

آر الهضمي فعل ليس الأنسجة متجانسة من الناحية الهيكلية أو وظيفيا. يتم تقسيم الأمعاء الدقيقة العفج والصائم واللفائفي والأمعاء الغليظة إلى الأعور والقولون، مع مزيد من الأخير ينقسم إلى القريبة والمتوسطة والبعيدة أجزاء. كل من هذه الأقسام لديها ميزات فريدة من نوعها النسيجية ويلعب أدوار متميزة (15). على هذا النحو، وآثار الشتائم ودرجة الاستجابة للظهارة الأمعاء قد تعتمد على المنطقة من الأنسجة درس 16. بالإضافة إلى ذلك، العديد من سلالات الفئران تثبت التنوع في الاستجابة على الصعيد النسيجي على أساس نوع من الإهانة المستخدمة في الدراسات 16. وهكذا، يليق إعداد الأنسجة ضروري للسماح النسيجية المناسبة والتحليل الجزيئي للأنسجة الأمعاء. على هذا النحو، والسويسرية لفة تحليل المنح تقنية طول الكامل للظهارة الأمعاء في وقت واحد، وبالتالي أيقن استنتاجات مطلعة على أساس معلومات شاملة.

e_content "> تقنية السويسري لفة ذكر لأول مرة من قبل ماغنوس 17، ووصف بالتفصيل Moolenbeck وRuitenberg وبارك وآخرون باعتبارها طريقة لتحضير الأنسجة وأداء النسيجية يحلل من القوارض الأمعاء 18،19 على التوالي. البروتوكول المحددة في هذا المنشور تقدم نسخة محسنة من الأسلوب الأصلي الذي يسمح لإعداد الأنسجة في الوقت المناسب وموثوق بها لأغراض التشخيص. وتتيح هذه التقنية المعدلة لمجموعات فعالة وإعداد ظهارة الأمعاء عن التقنيات المستخدمة عالميا، مثل المناعية، المناعي، وكذلك كما (الفلورية ومولد اللون 20) التهجين. وعلاوة على ذلك، والأنسجة تعديل عينة طريقة التحضير تستخدم الكواشف متوفرة وغير مكلفة نسبيا في حين تقدم وسيلة لتثبيت الأنسجة السريع، ويسمح للانتعاش من البروتين، والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي لتقييم إضافي. المحصلة معا، ثيالصورة التقنية ممتازة لتقييم شامل من المظاهر التشريحية المرضية، المرضية، والجزيئية للظهارة الأمعاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الفئران

  1. تمت الموافقة على جميع الدراسات على الفئران لجنة جامعة ستوني بروك المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). واستمرت الفئران على دورة ضوء الظلام 0:12 ساعة.
    1. تجاريا الحصول C57BL / 6 الفئران. الحصول على C57BL / 6 الفئران تحمل أليل Klf5 يحيط بها مواقع loxP (Klf5 و ل / و ل). وقد وصفت هذه الفئران قبل 21 وقدمت تكرم الدكتور Ryozo ناغاي.
  2. شراء C57BL / 6 الفئران يحمل محرض لجنة المساواة العرقية recombinase الجينات تحت تنظيم المروج Lgr5 (Lgr5-EGFP / CreERT2 الفئران).
  3. لإنشاء Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 و ل الفئران / و ل، عبر Klf5 فلوريدا / و الفئران لتر مع Lgr5-EGFP / الفئران CREER T2 ثم متصالب رجعي ذرية لKlf5 فلوريدا / و ل الفئران.
  4. الفئران في علاج بعقار تاموكسيفين وفقا للبروتوكول وصفها سابقا 22. حقن عمرها 8 أسابيع السيطرة على الفئران التجريبية وداخل الصفاق (IP) مع 1 ملغ من عقار تاموكسيفين (10 ملغ / مل)، وحلت في زيت الذرة العقيمة، لمدة 5 أيام متتالية.
  5. في يوم 14 بعد أول حقن تاموكسيفين، التضحية الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الاختناق عن طريق وضعها في غرفة متصلة ثاني مصدر للغاز 2. تسمح للغاز في التدفق إلى الغرفة حتى الفئران هي فاقدا للوعي وتوقف عن الحركة. لضمان القتل الرحيم أداء خلع عنق الرحم.

2. الأنسجة إعداد والسويسري المتداول

  1. باستخدام ملقط تشريح ومقص، وقطع شق في الجلد في الجانب البطن. مع زوج من ملقط، مع الاستمرار على الجلد في شق وسحب بلطف بعيدا عن النسيج العضلي في البطن. استخدام زوج من مقص لقطع الجلد في منطقة البطن وفضح عضلات البطن.
  2. عقد وسحب ما يصل بيritoneum مع ملقط. تأكد من عدم الكشف عن عقد وسحب في الأمعاء. جعل بعناية شق في الأنسجة البريتوني ومواصلة قطع بعيدا الجلد لفضح عضلات البطن. جعل بعناية شق في عضلات البطن ومواصلة قطع بها بعيدا لفضح الأمعاء.
  3. تحديد القولون وتتبع إلى نهاية البعيدة حيث ينضم المستقيم / الشرج. مع زوج من مقص، وقطع أقرب إلى فتحة الشرج ممكن.
  4. تحديد المعدة وتتبع حيث ينضم مع الأمعاء الدقيقة. مع زوج من مقص، وقطع سراح الأمعاء حوالي 1 سم بعيدا عن المعدة. نقل طول الأمعاء الدقيقة الافراج عن والقولون إلى طبق بيتري نظيفة تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  5. مع جهة واحدة أو زوج من ملقط، مع الاستمرار على النهاية البعيدة من القولون واستخدام اليد الأخرى لكشف بلطف على طول القولون من أي نوع من الأنسجة الضامة و / أو الدهون المساريقي.
  6. تحديد الأعور(الحقيبة الصغيرة بين الأمعاء الدقيقة والغليظة) وخفض حيث الأعور والقولون انضمام (نهاية القريبة من القولون) لتحرير القولون.
  7. مع جهة واحدة أو زوج من ملقط، عقد الأمعاء الدقيقة واستخدام اليد الأخرى لكشف بلطف على طول الأمعاء الدقيقة من أي نوع من الأنسجة الضامة و / أو الدهون المساريقي. قطع الأعور وتجاهل إذا لم يكن هناك حاجة لذلك.
    ملاحظة: يمكن أن تتوقف هذه العملية التي يحتضنها هنا الأمعاء تشريح في تعديل تثبيتي بوان (50٪ من الإيثانول / 5٪ حمض الخليك في DH 2 O) بين عشية وضحاها، ومواصلة الإجراءات في اليوم التالي.
  8. التعامل مع جزء واحد من الأمعاء (الأمعاء الدقيقة أو القولون)، وملء حقنة 10 مل مع تثبيتي تعديل بوان ونعلق إبرة أنبوب تغذية لذلك. ادخال الإبرة حوالي نصف سنتيمتر في افتتاح الأمامي للجزء الأمعاء.
  9. عقد إبرة أنبوب تغذية داخل قطاع الأمعاء عن طريق الضغط ثابت بصكعلى القطعة الأمعاء. مع اليد الأخرى يمسك حقنة، وتطبيق ضغط لطيف ولكن ثابت لمسح محتويات الشريحة المعوية باستخدام مثبت تعديل بوان. هذه الخطوة تسمح التنظيف في وقت واحد للجزء الأمعاء والتثبيت على الفور. استخدام طبق بتري لجمع النفايات من خلال تدفق. تثبيت يمكن ملاحظتها من خلال لون القولون تحول مبهمة.
    ملاحظة: تأكد من عدم تطبيق الكثير من الضغط أثناء التنظيف أو جزء الأمعاء قد تنفجر مفتوحة.
  10. باستخدام مقص، وقطع فتح جزء الأمعاء بشكل طولي على طول الخط المساريقي. لأنه عقد مع زوج من الملقط وشطف لفترة وجيزة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    1. قطع الأمعاء الدقيقة إلى 3 شرائح متساوية: الداني، منتصف، والقاصي. في الجزء الأقرب هو واحد مباشرة بعد المعدة، والجزء القاصي هو واحد مباشرة قبل القولون. الجزء الداني ما يعادل الاثني عشر، منتصف لالصائم، والقاصي لالدقاق.
    2. لكل جزء بمناسبة الداني والقاصي نهاية. نهاية القريبة هي التي كان يشير في الأصل نحو المعدة، والقاصي وأشار نحو القولون.
  11. استخدام الجزء العلوي من طبق بيتري لوضع شريحة الأمعاء تنظيفها وفتح. ضع شريحة الأمعاء مع الجانب اللمعية تواجه التصاعدي.
    1. لالقولون، وتحديد الجانب اللمعية من قبل variegations / التلال يمر عبر العرض والموجودة في نهاية الداني. المناطق المتوسطة والبعيدة لديها بعض variegations التي تعمل بشكل طولي. لالأمعاء الدقيقة، وتحديد الجانب اللمعية عن سطح الظهور الخام، الذي يصادف الزغب.
      ملاحظة: للحصول على الأمعاء الدقيقة، لا توجد ترسيم الحدود التشريحية العيانية الخارجية القريبة والمتوسطة والبعيدة المناطق. ولكن هذه المناطق يمكن أن تحدد في أقسام تحت المجهر. الزغابات هي أطول في المنطقة القريبة وتصبح أقصر تدريجيا بشكل أقصى أين همأقصر في الطول. المجهر، الخبايا القولون هي أقصر في المنطقة القريبة والتي يمكن أيضا الكشف عن هويته بسبب وجود التلال. الخبايا القولون هي الأطول في القسم الوسطي وأقصر في المنطقة البعيدة حتى الآن لا يزال أطول مما كانت عليه في المنطقة القريبة.
  12. المضي قدما السويسري المتداول القولون:
    1. إبقاء القولون مفتوحة شقة وتسحبه مع ملقط من نهاية القريبة تجاه حافة طبق بيتري.
    2. حافظ على الجانب اللمعية مواجهة مع الاستمرار على نهاية القريبة مع ملقط مع يد واحدة مع جهة أخرى عقد مسواك.
    3. التفاف على حافة نهاية الداني حول مسواك باستخدام ملقط وقرصة قليلا على حافة ملفوفة ضد مسواك ليثبت في مكانه.
    4. بلطف وببطء بدء المتداول مسواك مع الأصابع للفة القولون حول المسواك لتشكيل لفة السويسرية.
    5. مرة واحدة وقد توالت على طول القولون بأكمله حتى، استخدام زوج من ملقط لالشريحة بعناية جolon سويس رول قبالة مسواك وإلى معالجة الأنسجة / -embedding كاسيت. وضع الكاسيت في 10٪ مخزنة الفورمالين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  13. المضي قدما السويسري المتداول الأمعاء الدقيقة:
    1. التعامل مع جزء واحد في وقت واحد، والحفاظ على شريحة مفتوحة شقة مع الجانب اللمعية صعودا وتسحبه مع ملقط من نهاية القريبة تجاه حافة طبق بيتري.
    2. المضي قدما المتداول السويسري كما هو موضح في القولون.
  14. المضي قدما في معالجة الأنسجة الثابتة الفورمالين لتضمين البارافين. استكمل كما يلي:
    ملاحظة: استخدام معالج الآلي (انظر المواد والمعدات ولمزيد من التفاصيل).
    1. بينما الأنسجة في الكاسيت، وشطف الأنسجة مع PBS حتى تتم إزالة تثبيتي تماما.
    2. يذوى الأنسجة باستخدام الإيثانول في التسلسل التالي: 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 80٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة و100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة.
    3. صرف الإيثانول مع زيلين في التسلسل التالي: 2: 1 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، 1: 1 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، 1: 2 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، و 100٪ الزيلين لمدة 10 - 15 دقيقة، و 100 زيلين٪ لمدة 10 - 15 دقيقة، و 100 زيلين٪ لمدة 10 - 15 دقيقة. تنبيه: الزيلين يشكل خطرا صحيا، وبالتالي يجب أن تكون مجهزة مكان العمل مع تهوية العادم المحلية مع غطاء محرك السيارة المناسبة ومعدات الوقاية المناسبة يجب أن ترتدي من قبل الموظفين.
    4. صرف زيلين مع البارافين. نفذ الخطوات التالية في فراغ وضع الفرن لمدة 54-58 درجة مئوية: 2: 1 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، 1: 1 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، 1: 2 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، و 100٪ من النفط الأبيض لل 1-2 ساعة، و 100٪ للالبارافين 1-2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: لا تدع البارافين تتجاوز 60 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن لأن هذا سوف تحط من البوليمرات البارافين وتجعل من الصعب وهشة.
    5. تضمين في طازجة جديدة البارافين وتوجيه الأنسجة كما ديانجب قبل يصلب البارافين. لفات السويسرية، بعد paraffinization الأنسجة، فمن المهم أن يعيد كل لفة على جانبها خلال تضمين البارافين. وهذا يضمن أنه خلال عدة قطاعات، وسيتم إنتاج أجزاء من طول كل لفة.
  15. لتلطيخ، وقطع الفروع السميكة 5 ميكرون باستخدام مشراح. جمع المقاطع على الشرائح المشحونة وتجفيفها (خبز) في الفرن 65 درجة مئوية خلال الليل. السماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، واستخدامها في وقت لاحق لهم لتلطيخ.
    ملاحظة: يمكن تقصير الوقت الخبز 1 - 2 ساعة اعتمادا على كيفية طازجة قطع هي الشرائح. إذا كانت أقل من شهر منذ باجتزاء، فمن المستحسن أن تخبز بين عشية وضحاها. إذا كان قد مر أكثر من شهر، ثم 1-2 ساعة من الخبز تكفي لتوفير الوقت. إذا نفاد الوقت، يمكن دائما بدعم ليلة وضحاها أن تستخدم.

3. تحليل النسيجي والمناعي تلطيخ

لتحليل النسيجي وimmunofluorescence تلطيخ كما هو موضح سابقا 23،24، مع بعض التعديلات. لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) المناعي:

  1. خبز الشرائح في الفرن 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الذاتية النشاط الفوسفاتيز القلوية وdeparaffinize في وقت لاحق في زيلين.
  2. احتضان المقاطع في حمام من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمنع مستخلصات الأنسجة المحلية؛ ثم ترطيب قبل الحضانة في سلسلة خفض حمام الكحول (100٪، 95٪، 70٪)، يليه استرجاع مستضد في حل العازلة سيترات (10 ملي سيترات الصوديوم، 0.05٪ توين-20، ودرجة الحموضة 6.0) في 125 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة باستخدام غرفة decloaking.
  3. رسم دائرة حول أقسام الأنسجة باستخدام العلامات القلم الذي يوفر حاجز مسعور واحتضان المقاطع مع عازلة تمنع (2.5٪ البقري ألبومين المصل [BSA] في TBS-توين) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وبعد ذلك مع الأجسام المضادة الأولية ضد EGFP (تخفيف 1 : 500) في 4 درجات مئوية خلال الليل في غرفة ترطيب حين تهز بلطف.
  4. غسل أقسام واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري الموسومة في تركيز مناسب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. غسل الشرائح بعد العلاج بالاجسام المضادة وصمة عار نوى الثانوية مع هويشت وجبل مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
    1. لKlf5 / EGFP / كي 67 شارك في تلطيخ، والشرائح عملية كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،3 وأداء Klf5 تلطيخ التي يحتضنها مع Klf5 الأجسام المضادة (التخفيف 1: 150) بين عشية وضحاها.
    2. تطبيق أرنب ا ف ب كشف البوليمر إلى شرائح حسب البروتوكول.
    3. كشف Klf4 تلطيخ باستخدام تلطيخ المناعى مولد اللون حسب بروتوكول الشركة الصانعة.
    4. أداء شطف الأجسام المضادة باستخدام بروتوكول سبق وصفها 25. احتضان الشرائح عند 50 درجة مئوية في جليكاين-SDS (درجة الحموضة 2.0) حل مع الانفعالات لمدة 1 ساعة.
    5. غسل الشرائح جيدا بالماء المقطر واحتضان مع عازلة تمنع (2.5٪ BSA في TBS-توين) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. إضافة كي-67 (التخفيف 1: 500) وEGFP (تخفيف 01:500) الأجسام المضادة في وقت واحد، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. أداء الكشف الفلوري مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة قبل تلطيخ مع هويشت (لا تظهر البيانات) وجبل مع تصاعد المتوسطة.
  6. مراقبة التشكل النسيجي للأنسجة على تلطيخ أقسام 5 ميكرومتر مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) 26. للصور الفلورسنت، واستخدام موجات انبعاث 535، 646، و 700 لتصور EGFP، Klf5، وكي-67 تلطيخ، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المتداول السويسرية في تركيبة مع تلطيخ المناعى يتيح المجال لتحليل شامل من الأنسجة المعوية صغيرة أو كبيرة. على سبيل المثال من H & E تلطيخ من الأمعاء الغليظة من C57BL / 6 الماوس (الشكل 1) هو مثال على جدوى وفعالية هذه التقنية. كما هو مبين في الشكل 1، والصورة هي قادرة على التقاط جميع أجزاء من القولون: الداني، والمتوسطة، والبعيدة. وهكذا، فإنه يسمح لتقييم النسيجي شامل. المتداول السويسري والقدرة على التقاط الصور ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المتداول السويسري هو وسيلة قوية لإعداد الأنسجة المعوية لتقييم النسيجي والصرفي على نطاق واسع. وعلى النقيض من تقنية السويسري المتداول سبق وصفها، والتي وضعت أصلا لإعداد أقسام المجمدة 18،19، الإجراء المقدمة هنا يسمح إعداد الأنسجة المعوية الفوري وتثبيت لتثبيت الفورمالين وتضمينها البارافين (FFPE). مقارنة مع الأنسجة المجمدة، FFPE الأنسجة لديها أطول مدة الصلاحية وهو النوع المفضل من الأنسجة للتحليل النسيجي بسبب سلامة الأنسجة أفضل. الأجزاء الهامة من بروتوكول السويسرية المتد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر Ainara Ruiz de Sabando على توفير صور H&E. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (DK052230 و DK093680 و CA172113) الممنوحة للدكتور فنسنت دبليو يانغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطقم تشريح الفولاذ المقاومVWR25640-002
غرفة إزالةالكلام Biocare MedicalDC2012
10 ملVWR89215-218
كاسيت تضمين / معالجة الأنسجة Swingsette مع غطاءSimportM515
Superfrost Plus Slides [الحجم: 25 × 75 × 1 مم]VWR48311-703
مجموعة تلطيخ الشرائح اليدويةTissue-Tek / Sakura4451
طبق تلطيخ الأنسجة الخضراء-Tek/ Sakura4456
طبق تلطيخ مناديلبيضاء-Tek / Sakura4457
منزلق 24 شريحة بمقبض قابل للفصلمناديل الورق-Tek / Sakura4465
فرنThermo Scientific6243لشرائح الخبز عند 65 درجة
مجهر تشريحZeissStemi 2000C
مجهر مضاننيكونEclipse 90iضوء ساطع وذو ذو اهتداف: 10X ، 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
الإيثانول 200 دليلAAPR111000200
الميثانولVWRBDH1135-4LP
حمض الخليك الجليديAAPR281000ACS
زيلينفيشر ScientificX5P-1GAL
بيروكسيد الهيدروجين 25٪ في الماءACROS202465000
10٪ فورمالين متراكمفيشر Scientific22-026-213
جزء مصل البقر V ، صدمة حراريةروش3116956001
توين 20سيجما ألدريتشP7949
سترات الصوديومفيشر ScientificS279
إبرة التزقيمVWR20068-624
الأرانب المضادة للجسم المضاد Klf5سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-22797التخفيف 1:150
الدجاج المضاد للجسم المضادEGFP MilliporeAB16901التخفيف 1:500
الأرنب المضاد للجسمالمضاد Ki67Biocare MedicalCRM325Bالتخفيف 1: 500
Mach3 أرنب AP مجموعة الكشف عن البوليمرBiocare MedicalM3R533L
Warp طقم كروموجين أحمرBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP / CreERT2< / sup> الفئران  مختبرات جاكسون008875 
المعالج الآليلايكالايكا TP1020
للصدأ حقنة حامل محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة