التحقيق في التفاعلات بين مسببات الأمراض البكتيرية ومضيفيهم هو مجال هام من مجالات الأبحاث البيولوجية. هنا، نحن تصف التقنيات اللازمة لقياس النبات المستجيب من الكوكسيلا البورنيتية أثناء سيرنا إسكات الجينات باستخدام BlaM الركيزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكوكسيلا البورنيتية، العامل المسبب للحمى Q، هو الممرض داخل الخلايا التي تعتمد على الرابع نقطة / آي سي إم نظام إفراز نوع لتأسيس مكانة تنسخي. وtranslocated فوج من المؤثرات من خلال هذا النظام إلى داخل الخلية المضيفة للتلاعب عمليات المضيفة والسماح بإنشاء فجوة المستمدة يحلول فريدة للنسخ المتماثل. الطريقة المعروضة هنا يشمل الجمع بين اثنين من التقنيات راسخة: إسكات الجينات المحددة باستخدام سيرنا وقياس النبات المستجيب باستخدام الركيزة القائم على الحنق التي تعتمد على النشاط β-اكتاماز. تطبيق هذين النهجين، يمكننا أن نبدأ في فهم دور العوامل المضيفة في البكتيرية وظيفة نظام إفراز والنبات المستجيب. في هذه الدراسة درسنا دور Rab5A وRab7A، سواء منظمات هامة لمسار الاتجار التقامي. علينا أن نبرهن على إسكات التعبير عن أي نتائج البروتين في انخفاض في translocatio المستجيبكفاءة ن. هذه الأساليب يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مسببات الأمراض داخل الخلايا وخارج الخلية الأخرى التي تستخدم أيضا أنظمة إفراز. وبهذه الطريقة، صورة عالمية من العوامل المضيفة المعنية في النبات المستجيب البكتيرية يمكن الكشف عنها.
المقدمة
الكوكسيلا البورنيتية هو الممرض داخل الخلايا الفريدة التي تسبب الحيوانية المصدر العدوى البشرية بالحمى. ويرتبط هذا المرض مع طائفة واسعة من العروض السريرية تمتد من الانقلاب المصلي بدون أعراض للعدوى تهدد الحياة المزمن الذي غالبا ما يظهر عن سنوات التهاب الشغاف بعد التعرض 1. تحدث العدوى البشرية في المقام الأول من خلال استنشاق هباء ملوثة المجترات الخزان الرئيسي للعدوى، ولا سيما، الأبقار والأغنام والماعز. على الرغم من أن العدوى الكوكسيلا في هذه الحيوانات عادة تحت الإكلينيكي، والعدوى قد تسبب الإجهاض والحمل البكتيري كبير داخل السائل الولادة والمشيمة يمكن أن تلوث البيئة المحلية 1. مثال على مثل هذا ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على النمو أو التلاعب الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII في مستوى الاحتواء الجسدي 2 مختبر وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في الامتثال للمبادئ التوجيهية المحلية. ويرد رسم تخطيطي للالعكسي ترنسفكأيشن والفحص النبات سير العمل هو موضح أدناه في الشكل 2.
1. إعداد C. البورنيتية الثقافة تعرب عن CBU0077 تنصهر لبيتا لاكتاماز (pBlaM-CBU0077) (DAY 1)
- إعداد 1X ACCM-2 6:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لهذه الدراسة، وC. تم اختيار البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة كما CBU0077 ثبت سابقا أن يكون المستجيب translocated من نظام إفراز الكوكسيلا نقطة / آي سي إم 17. قبل الإصابة، فإن العدد الإجمالي للجينوم / مل في سبعة أيام C. وقد عددت ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 باستخدام QPCR الشكل 4 يوضح مثال على عتبة دورة (CT) القيم المتوقعة من كل من معايير ونماذج التالية QPCR. تم تصدير القيم ط (تم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظم إفراز، والبروتينات المستجيب البكتيرية هذه أنظمة النقل في سيتوبلازم الخلايا المضيفة، هي عنصر الفوعة المهم أن تستخدم العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض إنشاء العدوى داخل محاريب تنسخي فريدة من نوعها. وكانت محورا للعديد من المجموعات البحثية لتحقيق التفاعل بين المؤثرات البكتيرية والبروتينات المضيف وتأثير هذه المؤثرات لها على مسارات الخلوية المضيف. بحوث محدودة جدا، إن وجدت، وبحث إمكانية بروتينات المضيف ليكون من الضروري لنجاح النبات المستجيب البكتيرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) (معرف المنحة 1062383 و 1063646) الممنوحة ل HJN. يتم دعم EAL من خلال جائزة الدراسات العليا الأسترالية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| حامض الستريك | سيجما | C0759 | ACCM-2 مكون متوسط |
| سترات الصوديوم | سيجما | S4641 | ACCM-2 مكون متوسط |
| فوسفات البوتاسيوم | سيجما | 60218 | ACCM-2 مكون متوسط |
| كلوريد المغنيسيوم | كالبيوكيم | 442611 | ACCM-2 متوسط مكون |
| كلوريد الكالسيوم | Sigma | C5080 | ACCM-2 مكون متوسط |
| كبريتات الحديد | فيشر | S93248 | ACCM-2 مكون متوسط |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S9625 | ACCM-2 مكون متوسط |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 مكون متوسط |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 متوسط مكون |
| أحماض الكازامينو | فيشر | BP1424 | ACCM-2 مكون متوسط |
| ميثيل بيتا سيكلودكسترين | سيجما | C4555 | ACCM-2 مكون متوسط |
| RPMI + غلوتاماكس | ثيرموفيشر Scientific | 61870-036 | ACCM-2 مكون متوسط |
| الكلورامفينيكول | سيجما | C0378 | للثقافة البكتيرية |
| ON-TARGETplus التحكم في عدم الاستهداف تجمع (OTP) | دارماكون | D-001810-10-05 | التحكم غير المستهدف |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | يسبب موت الخلايا ؛ قياس كفاءة التعداء |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5x siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | استخدم الماء المعقم الخالي من RNase لتخفيف 5x siRNA buffer إلى 1x siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 كاشف التعداء | Dharmacon | T-2001-01 | للتعداء |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | وسط مصل منخفض يستخدم في التعداء |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | لزراعة الخلايا والعدوى |
| مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | يمكن استخدام منتج مكافئ بديل |
| DMSO | Sigma | D8418 | لتخزين سلالة Coxiella |
| PBS | لزراعة الخلايا | ||
| 0.05٪ Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | لزراعة الخلايا |
| dH2< / sub>O | لتخفيف العينات والمعايير الخاصة ب qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | يمكن استخدام منتج مكافئ بديل لاستخراج gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | يمكن استخدام منتج مزيج qPCR الرئيسي المكافئ البديل لتفاعل qPCR |
| طقم تحميل LiveBLAzer FRET-B / G مع CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | لقياس الإزاحة باستخدام التألق وتوليد محلول التحميل 6X (يحتوي على الحل A و B و C و DMSO) |
| هيدروكسيد الصوديوم | Merck | 106469 | مكون محلول Probenicid |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | Sigma | 71505 | مكون محلول Probenicid |
| ثنائي الصوديوم هيدروجين أورثوفوسفات | Merck | 106586 | محلول Probenicid مكون |
| Probenicid | Sigma | P8761 | الحل المضاد |
| DRAQ5 محلول مسبار الفلورسنت (5 ملم) | النوى ThermoFisher Scientific | 62251 | لتحديد حيوية الخلية. استخدم 1: 4000 مخفف في PBS. |
| محلول 4٪ PFA (بارافورمالدهايد) في PBS | Sigma | P6148 | محلول تثبيت لخلايا HeLa 229 |
| 25 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجة بغطاء تنفيس | Corning | 430639 | لنمو السلالة البكتيرية |
| 96 ألواح دقيقة معالجة بالبوليسترين الأسود TC ذات القاع المسطح بشكل جيد ، ملفوفة بشكل فردي ، مع غطاء ، معقمة | Corning | 3603 | |
| 75 سم 2< / sup> قارورة لزراعة الأنسجة مع غطاء تنفيس | Corning | 430641 | لنمو HeLa 229 خلية |
| 175 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجة بغطاء تنفيس | Corning | 431080 | لنمو HeLa 229 خلية |
| الدم | لقياس خلايا HeLa 229 | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR | لوحات 4titude | 4ti-0750 / TA | ل qPCR سلسلة تفاعل |
| 8 أغطية ، مسطحة | Sarstedt | 65.989.002 | لتفاعل qPCR |
| Name< / strong> | Company< / strong> | Catalog Number< / strong> | Comments |
| Equipment | |||
| bench top microfuge | |||
| مقعد أعلى دوامة | |||
| خلاط | |||
| الطرد المركزي | Eppendorf | 5810 R | لتكوير الثقافة البكتيرية |
| Nanodrop | لقياس gDNA | ||
| Mx3005P QPCR آلة | Aligent Technologies | 401456 | لتقدير جينومات Coxiella في ثقافة 7 أيام |
| ClarioSTAR microplate القارئ | BMG LabTech | لقياس التألق |
المراجع
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
