تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل الكوكسيلا البورنيتية أثناء سيرنا إسكات

الكوكسيلا البورنيتية هو الممرض داخل الخلايا الفريدة التي تسبب الحيوانية المصدر العدوى البشرية بالحمى. ويرتبط هذا المرض مع طائفة واسعة من العروض السريرية تمتد من الانقلاب المصلي بدون أعراض للعدوى تهدد الحياة المزمن الذي غالبا ما يظهر عن سنوات التهاب الشغاف بعد التعرض ^1. تحدث العدوى البشرية في المقام الأول من خلال استنشاق هباء ملوثة المجترات الخزان الرئيسي للعدوى، ولا سيما، الأبقار والأغنام والماعز. على الرغم من أن العدوى الكوكسيلا في هذه الحيوانات عادة تحت الإكلينيكي، والعدوى قد تسبب الإجهاض والحمل البكتيري كبير داخل السائل الولادة والمشيمة يمكن أن تلوث البيئة المحلية ^1. مثال على مثل هذا التلوث عبء هائل يمكن أن يكون على وحظ الصحة العامة والزراعة والصناعة مؤخرا في اندلاع حمى Q التي وقعت في هولندا ^2. بين عامي 2007 وعام 2010، تم تشخيص أكثر من 4000 حالة إصابة بشرية بالحمى وترتبط هذه الفاشية إلى تلوث كبير من مزارع الماعز ^3. بالإضافة إلى ذلك، الكوكسيلا هو سلاح بيولوجي محتمل، حسب تصنيف المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها، ويرجع ذلك إلى الاستقرار البيئي للبكتيريا والجرعة المعدية منخفضة اللازمة ليسبب الاعتلال والوفيات ⁴ الشديد.

يوجد الكوكسيلا على مرحلتين: أنا الكائنات المرحلة، المعزولة من المصادر الطبيعية، وضراوة للغاية والمرحلة الثانية الكائنات الحية والموهن للغاية في الجسم الحي. على سبيل المثال، وبعد عدة في ممرات المختبر من الكائنات الكوكسيلا البورنيتية تسعة مايل المرحلة الأولى، تم إنتاج المرحلة الثانية البكتيريا التي تحتوي على حذف الكروموسومات لا رجعة فيه مما أدى إلى lipopolysaccharide في اقتطاع (LPS) ^5. هذه السلالة، C. البورنيتية NMII، يشبه ظاهريا إلى المرحلة الأولى في نماذج زراعة الأنسجة ويوفر طريقة أكثر أمانال للباحثين لدراسة المرضية الكوكسيلا في مختبرات ^5. في السنوات الأخيرة عدة اختراقات تقدمت بسرعة مجال علم الوراثة الكوكسيلا. وأبرزها، وتطوير وسائل الإعلام ممحوضة (يحمض المتوسطة السيستين سترات - ACCM-2) سمحت النمو خالية من الخلايا من الكوكسيلا في كل من السائل وعلى وسائل الاعلام الصلبة ^6،7. وأدى ذلك إلى تحسينات مباشرة من الأدوات الجينية المتاحة للالكوكسيلا بما في ذلك نظام التعبير الجيني محرض، ناقلات المكوك وأنظمة ينقول عشوائية ^8-11. وفي الآونة الأخيرة، كما تم تطوير طريقتين لتثبيط الجين المستهدف، مما يمهد الطريق لفحص المرشحين الجينات الفوعة محددة ^12.

وبعد استيعاب من قبل البلاعم السنخية، الكوكسيلا يعيد إلى أرقام عالية داخل حجرة بغشاء يسمى Coxiella- تحتوي على فجوة (لجنة تنسيق المفردات). لجنة تنسيق المفردات يتطلب الاتجار التقامي المضيف عشرالخام الإندوسومات المبكرة والمتأخرة حتى ينضج إلى المستمدة يحلول عضية ^13. وطوال هذه العملية، لجنة تنسيق المفردات تستحوذ على العوامل المضيفة إما أن تظهر بشكل عابر أو تظل مرتبطة فجوة، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، Rab5، Rab7، CD63 ^وLAMP-13-15 يناير. تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة يعتمد كليا على نقطة / آي سي إم نوع IVB نظام إفراز تعمل بكامل طاقتها (T4SS) ^8،16،17. هذا النظام إفراز هو بنية متعددة البروتينية ذات العلاقة أجدادهم لأنظمة التصريف وتمتد كل من الأغشية البكتيرية وفجوي لتقديم البروتينات البكتيرية، ووصف المؤثرات، في السيتوبلازم المضيف ^(18). والكوكسيلا T4SS وظيفيا تشبه الى حد بعيد نوع IVB نقطة / نظام إفراز آي سي إم تتميز كذلك من البكتيريا المستروحة ^19،20. ومن المثير للاهتمام، لا تحدث تفعيل T4SS ولاحق المستجيب النبات حتى يصل الكوكسيلا والحمضية-يحلول المشتقةعضية، ما يقرب من 8 ساعات بعد العدوى ^17،21. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 130 المؤثرات نقطة / آي سي إم ^{9،17،22-24.} العديد من هذه المؤثرات على الأرجح تلعب أدوارا هامة خلال تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة؛ ومع ذلك، سوى عدد قليل من المؤثرات تم التعرف على وظيفيا ^25-29.

في هذه الدراسة يمكننا الاستفادة من مضان أساس النبات فحص يعتمد على الانقسام الركيزة CCF2-AM الحنق (المشار إليه فيما بعد الركيزة BlaM) عن طريق النشاط β-اكتاماز داخل سيتوبلازم الخلية المضيفة (الشكل 1). وتنصهر في الجينات التي تهم تيم-1 β-اكتاماز (BlaM) على البلازميد المراسل أن يوفر التعبير التأسيسي. وتتألف الركيزة BlaM اثنين fluorophores (الكومارين وفلوريسئين) التي تشكل زوج الحنق. الإثارة من نتائج الكومارين في الحنق من فلوريسئين والانبعاثات مضان أخضر في غياب النبات المستجيب. ومع ذلك، إذا كان بلوخينتقل إلى M-المستجيب البروتين الانصهار في السيتوبلازم المضيف، الناتجة β-اكتاماز يشق نشاط عصابة β لاكتام الركيزة BlaM، يفصل الزوج الحنق إنتاج الانبعاثات مضان الأزرق بعد الإثارة. وقد تم هذا الاختبار النبات ثبت كذلك نهج لتحديد البروتينات المستجيب من مجموعة واسعة من مختلف البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية، بما في ذلك جيم البورنيتية، L. المستروحة، L. اللونغبيشية، الكلاميديا، ممرض للأمعاء E. القولونية والسالمونيلا والبروسيلا ^17،30-35.

لتحديد دور العوامل المضيفة محددة بشأن الكوكسيلا المستجيب النبات نحن نستخدم طريقة راسخة لإسكات الجينات المعروفة تدخل الحمض النووي الريبي، وخاصة الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). حددت أصلا في ايليجانس انواع معينة، تدخل الحمض النووي الريبي هو عملية الخلوية الذاتية الحفظ المستخدمة لdefe الفطريةNSE ضد الفيروسات وكذلك الجين تنظيم ^36،37. بعد ربط تسلسل معين سيرنا، وتدهور مرنا يحدث من خلال RISC (الناجم عن الحمض النووي الريبي مجمع إسكات) مما أدى إلى إسكات الجينات المحددة أو ضربة قاضية ^38. في هذه الدراسة، تم استخدام سيرنا لاستهداف اثنين من البروتينات المضيفة، Rab5A وRab7A، وهي منظمات هامة لمسار التقامي. تم التأكد من تأثير إسكات Rab5A وRab7A على النبات المستجيب باستخدام C. البورنيتية pBlaM-CBU0077. وقد تم اختيار CBU0077 كما تبين أنه سبق أن translocated من قبل النظام إفراز نقطة / آي سي إم من الكوكسيلا ^17.

الاستفادة من كل سيرنا إسكات الجينات وفحص النبات fluorescencebased الموصوفة هنا، بدأنا في إنشاء دور للعوامل المضيف في النبات البروتينات المستجيب من الكوكسيلا. ويمكن تطبيق هذا النهج إلى مجموعة واسعة من كل من البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية التي تمتلك secretio مماثلأنظمة ن المسؤولة عن النبات من البروتينات المستجيب.

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على النمو أو التلاعب الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII في مستوى الاحتواء الجسدي 2 مختبر وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في الامتثال للمبادئ التوجيهية المحلية. ويرد رسم تخطيطي للالعكسي ترنسفكأيشن والفحص النبات سير العمل هو موضح أدناه في الشكل 2.

1. إعداد C. البورنيتية الثقافة تعرب عن CBU0077 تنصهر لبيتا لاكتاماز (pBlaM-CBU0077) (DAY 1)

1. إعداد 1X ACCM-2 ^6:
   1. الجمع بين المكونات المدرجة في الجدول 1. ضبط درجة الحموضة إلى 4.75 مع 6 M هيدروكسيد الصوديوم وفلتر تعقيم (لا الأوتوكلاف). ACCM-2 غير مستقرة لنحو ثلاثة أسابيع تخزينها في 4 درجة مئوية.
2. توليد C. الأسهم البورنيتية pBlaM-CBU0077.
   1. تصيب هيلا 229 الخلايا التي تحتوي على C. سلالة البورنيتية تحمل pBlaM-CBU0077 والمرور حتى vacuol كبيرةويلاحظ وفاق في معظم الخلايا.
      1. زراعة C. سلالة البورنيتية تحمل pBlaM-CBU0077 في 20 مل ACCM-2 التي تحتوي على 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 75 سم ² الأنسجة قارورة الثقافة مع غطاء تنفيس لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، 2.5٪ O _2.
      2. الطرد المركزي C. ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
      3. إعادة تعليق بيليه في 20 مل DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) + 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (وسائل الإعلام الصيانة). إزالة وسائل الاعلام من 50٪ متموجة 75 سم ² قارورة من هيلا 229 الخلايا. إضافة جيم إعادة علقت البورنيتية إلى هيلا 229 الخلايا. احتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ للسماح للإصابة هيلا 229 الخلايا لإنشاء.
      4. تقسيم الخلايا إلى 175 سم ² نسيج الثقافة قارورة.
         1. إزالة وسائل الاعلام من قارورة 75 سم ^2، ويغسل أحادي الطبقة مرتين مع 10 مل قبل تحسنت برنامج تلفزيوني.
         2. إضافة 1 مل سو 0.05٪ التربسين-EDTA حل ومكان الخلايا عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ ل3-5 دقيقة لفصل الخلايا.
         3. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام الصيانة. إضافة 2 مل من الخلايا إعادة علقت في 175 سم ² قارورة تحتوي على 38 مل من وسائل الاعلام الصيانة.
         4. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمزيد من 3-5 أيام حتى يتم التوصل إلى 100٪ confluency ولوحظ فجوات كبيرة.
   2. جمع طاف من سم ² قارورة 175، إضافة 10 مل O ₂ درهم لتغطية الخلايا المصابة هيلا 229 واحتضان لمدة 15 دقيقة لليز الخلايا المصابة.
   3. الجمع بين طاف والخلايا هي lysed وبيليه في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
   4. اعادة تعليق بيليه في 10 مل درهم ₂ O. خلايا ليز مزيد عن طريق تمرير مرارا وتكرارا على اعادة تعليق من خلال إبرة 23G تعلق على حقنة 10 مل 20 مرات على الأقل. بيليه في 500 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
   <لى> إزالة وبيليه طاف في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT لجمع C. البورنيتية.
3. إعادة تعليق C. البورنيتية في DMEM + 10٪ FCS وتحديد عدد من البكتيريا وفقا ل4. تمييع إلى 1 × 10 ⁹ جينوم / مل باستخدام DMEM + 10٪ FCS + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، قسامة 50 سهما ميكرولتر في أنابيب microfuge ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. عكسي ترنسفكأيشن سيرنا والبذر من هيلا 229 خلايا (DAY 4)

1. عند استخدام سيرنا التجريبية لأول مرة إعدادوسيرنا على النحو التالي:
   1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في سيرنا مجفف بالتجميد للتأكد من أن بيليه سيرنا يتم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب.
   2. إعادة تعليق سيرنا مكعبات إلى تركيز المخزون النهائي من 20 ميكرومتر من قبل pipetting حجم مناسب من العازلة 1X سيرنا (الجدول 2).
   3. ماصة الحل صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط ومكان على خلاط المداري لمدة 30 دقيقة في RT، أنبوب عكس كل 5-10 دقيقة.
   4. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب لضمان أن يتم جمع سيرنا في الجزء السفلي من الأنبوب.
   5. قسامة سيرنا في 50 مكل في أنابيب microfuge ومخزن في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
   6. لتوليد 1 ميكرومتر تركيز سيرنا العمل، ماصة 950 ميكرولتر من 1X سيرنا العازلة في 50 ميكرولتر الأسهم قسامة (20 ميكرومتر) عند الضرورة. ملاحظة: هذا التركيز عمل 1 ميكرومتر يمكن تجميد إذابة عدة مرات لتعداء المتكررة.
2. وضع DMEM + 10٪ FCS،، 0.05٪ التربسين-EDTA وبرنامج تلفزيوني في حمام 37 درجة مئوية الماء (أو ما يعادلها) لمدة 30 دقيقة لتسخين قبل الاستعمال.
3. إعداد مكونات ترنسفكأيشن:
   ملاحظة: لقد تم تحسين البروتوكول التالي لهيلا 229 الخلايا في صفيحة 96-جيدا مع الجدران السوداء ومسطحة، أسفل شفافة. تعظيم الاستفادة من كمية كاشف ترنسفكأيشن، قد يكون من الضروري لخطوط مختلفة من الخلايا تركيز سيرنا والبذر كثافة الخلايا.
   1. لكل بئر، واستخدام 0.1 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن، 15.9 ميكرولتر المتوسطة انخفاض المصل (وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المستخدمة لتعداء، الرجوع إلى جدول المواد) و 4 ميكرولتر من 1 ميكرومتر سيرنا (مما أدى إلى تركيز سيرنا النهائي من 40 نانومتر). استخدام أنابيب microfuge منفصلة عن مكتب المدعي العام، PLK1، Rab5A وRab7A. قياس كل حالة فحص في ثلاث نسخ. ويرد مثال على تخطيط لوحة 96-جيدا في الشكل (3).
      ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول استخدام اثنين من الضوابط: مكتب المدعي العام وPLK1. مكتب المدعي العام هوتتألف من أربعة سيرنا المجمعة التي تم الأمثل للحد من خارج الهدف آثار، وبالتالي يستخدم مكتب المدعي العام كوسيلة لمراقبة سلبية، وعدم استهداف. سارعت سيرنا ويمكن أيضا أن تستخدم لمراقبة سلبية. ويؤدي فقدان التعبير PLK1 في موت الخلايا واسعة في عدد من خطوط الخلايا عن طريق الحث على مسارات الموالية لأفكارك وبالتالي يستخدم PLK1 سيرنا كما تحكم إيجابية للترنسفكأيشن حيث يرتبط موت الخلايا لكفاءة ترنسفكأيشن.
      1. لكل ترنسفكأيشن سيرنا التجريبية، والجمع بين 0.4 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن و 63.6 ميكرولتر المتوسطة انخفاض المصل في microfuge أنبوب الفردية. دوامة جميع أنابيب microfuge وتسمح المكونات إلى مجمع لمدة 5 دقائق على RT.
      2. إضافة 16μl من كل سيرنا التجريبية لأنابيب microfuge المقابلة التي تحتوي على مجمع ترنسفكأيشن. دوامة واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. ملاحظة: من المهم ألا تتجاوز 30 دقيقة، وكفاءة ترنسفكأيشن ستنخفض.
4. خلال المؤتمر الوطني العراقي 20 دقيقةubation (2.3.1.2) إضافة 20 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن + متوسطة خفض المصل + سيرنا خلط في الآبار الملائمة للأسود أسفل علبة معقم، مسطحة واضحة 96-جيدا.
5. بمجرد أن فترة الحضانة 20 دقيقة كاملة، بذور هيلا 229 الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3.92 × 10 ³ خلايا / جيد.
   1. حصاد هيلا 229 الخلايا من متموجة أو شبه متموجة 75 سم ² الأنسجة الثقافة قارورة في DMEM قبل حرارة + 10٪ FCS وإعادة تعليق الخلايا إلى الكثافة النهائية من 4.9 × 10 ⁴ خلية / مل وفقا لأساليب القياسية. لضمان ترنسفكأيشن عدم المساس الكفاءة، وإعداد الخلايا خلال فترة الحضانة 20 دقيقة (2.3.1.2).
      1. غسل أحادي الطبقة من هيلا 229 الخلايا مرتين مع 10 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني.
      2. إضافة 1 مل من 0.05٪ حل التربسين-EDTA ومكان هيلا 229 الخلايا في CO ₂ 37 ° C + 5٪ عن 3-5 دقيقة لفصل الخلايا.
      3. جمع الخلايا في 9 مل من قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCس عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم وإعداد الخلايا لكثافة النهائية من 4.9 × 10 ⁴ خلية / مل باستخدام DMEM + 10٪ FCS.
   2. ماصة 80 ميكرولتر من هيلا 229 الخلايا في كثافة 4.9 × 10 ⁴ خلية / مل في كل بئر الذي يحتوي على كاشف ترنسفكأيشن + انخفاض المصل المتوسطة + سيرنا المزيج. وهذا يتوافق مع كثافة خلية من 3.92 × 10 ³ خلايا / جيد.
      ملاحظة: مطلوب الطرح الخلفية لالركيزة BlaM.
      1. لا تقم بإضافة خلايا أو سيرنا إلى "فارغة" آبار (الشكل 3). بدلا من ذلك، إضافة 80 ميكرولتر من DMEM + 10٪ FCS لهذه الآبار أقيمت في ثلاث نسخ.
   3. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية + 5٪ CO _2.

3. تغيير وسائل الإعلام (DAY 5)

1. بعد 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام باستخدام محول متعدد القنوات تعلق على مصدر فراغ أو يدويا مع ماصة متعدد القنوات، واستبدالها مع 100 ميكرولتر من prewarm جديدةإد DMEM + 10٪ FCS.
2. احتضان لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO _2.
3. في هذه المرحلة، والتحقق من سلامة الخلايا بصريا باستخدام المجهر الضوئي العادي. إذا كان ترنسفكأيشن العكسي ناجحا، سوف يلاحظ موت الخلايا كبيرا في الآبار التي تحتوي PLK1 سيرنا مقارنة مع مكتب المدعي العام سيرنا.

4. الكمي لالكوكسيلا البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة باستخدام QPCR (DAY 7)

1. بعد 7 أيام من النمو في ACCM-2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، 2.5٪ O ₂ (1.3)، الطرد المركزي 10 مل C. ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
2. إعادة تعليق بيليه الجرثومي في 10 مل من قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS. إعداد 1:10 و 1: 100 التخفيفات الثقافة (عينة) باستخدام درهم ₂ O.
3. إعداد المكونات المطلوبة لQPCR.
   ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها استخراج gDNA مقدما وتخزينها في -20 درجة مئوية الاتحاد الوطني للعمالمطلوب ايل.
   1. إعداد المعايير:
      1. استخراج gDNA من الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII نوع السلالة البرية التي تزرع في ACCM-2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، 2.5٪ O ₂ لمدة 7 أيام باستخدام مجموعة استخراج gDNA، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. قياس تركيز gDNA (ز / ميكرولتر) باستخدام معمل NanoDrop (أو ما يعادلها) في أحد الامتصاصية من 260 نانومتر.
      3. حساب عدد النسخ الجينوم في ميكرولتر باستخدام الصيغة التالية أدناه، وتحويله إلى عدد من العوامل الوراثية / مل.
         
      4. ضبط عدد من العوامل الوراثية / مل إلى 10 ⁹ / مل (في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر) في أنبوب microfuge جديدة باستخدام درهم ₂ O. وهذا يمكن أن يكون المغلي لمدة 10 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      5. في يوم من العدوى، وتوليد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من 10 ⁸ جينوم / مل إلى 10 ⁵ جينوم / مل من الجينوم 10 ⁹ق / الأسهم مل.
         1. ماصة 10 ميكرولتر من 10 ⁹ جينوم / مل إلى 90 ميكرولتر من O ₂ درهم لتوليد 10 ⁸ جينوم / مل. دوامة لخلط. ماصة 10 ميكرولتر من 10 ⁸ جينوم / مل إلى 90 ميكرولتر من O ₂ درهم لتوليد 10 ⁷ جينوم / مل. دوامة وتكرار حتى 10 ⁵ جينوم / مل.
   2. إعداد رد فعل QPCR. خلق مزيج الرئيسي ل25 بئرا لحساب أي أخطاء pipetting ل. لكل بئر، استخدم 10 ميكرولتر QPCR ميكس ماجستير. 2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ompA (4.3.2.2) و 3 ميكرولتر من درهم ₂ O.
      ملاحظة: OmpA هو بروتين الغشاء الخارجي، من C. وقد تم اختيار البورنيتية ^"39 والباب 82 قاعدة الزوج ضمن منطقة الحفظ جدا لاستخدامها بوصفها التحقيق كما هو موضح سابقا ^40.
      1. إعداد كل مستوى (O ₂ درهم، 10 ^5، 10 ^6، 10 ^7، 10 ^8، 10 ⁹ جينوم / مل) وعينة (1:10 و 1: 100 تمييع) في 96-جيدا PCR المسيل للدموع بعيدا لوحة (غير متجنب) في نسختين أو ثلاث نسخ، على التوالي. إضافة 5 ميكرولتر من عينة أو معيار في آبار المناسبة.
      2. باستخدام درهم ₂ O، وتمييع كل من التمهيدي إلى الأمام ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') وompA عكس التمهيدي (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر والجمع في نفس microfuge أنبوب.
         ملاحظة: مزيج التمهيدي ompA يمكن إعداد مقدما وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      3. الجمع بين 250 ميكرولتر QPCR ميكس ماجستير، 50 ميكرولتر ompA مزيج التمهيدي، 75 ميكرولتر درهم ₂ O ودوامة لخلط. إضافة 15 ميكرولتر من هذا المزيج الرئيسي إلى الآبار التي تحتوي إما معايير أو العينات.
      4. وضع 8-غطاء قبعات الشريط PCR على الآبار المناسبة وأجهزة الطرد المركزي نبض أنابيب PCR لضمان كل شيء يتم جمعها في الجزء السفلي من الأنابيب.
      5. إعداد البرنامج التالي على ماجستير PCR الكميعمود فقري: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 1 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية (الشكل 4A).
   3. تحليل ط م (عتبة دورة) القيم من QPCR:
      1. نقل القيم ط م إلى جدول بيانات باستخدام وظيفة التصدير البرنامج.
      2. إنشاء مخطط التشتت من المعايير 10 ⁵ جينوم / مل حتى 10 ⁹ جينوم / مل (كنسبة القيم السجل). تجاهل أي القيم المتطرفة واضحة بين العينات ثلاث نسخ. توليد خط اتجاه لوغاريتمي وتحديد معادلة الرسم البياني.
      3. حساب العدد الإجمالي للجينوم / مل في العينة باستخدام المعادلة ولدت في 4.3.3.2. لا ننسى لحساب التخفيف الأولي (01:10 و 1: 100) من العينات.

5. إصابة عكسي Transfected الخلايا (DAY 7)

1. بعد احتساب العوامل الوراثية الكلية / مل في C. حافة خشنةثقافة netii pBlaM-CBU0077 لاستخدامها للعدوى، وضبط إعادة علقت ثقافة البكتيرية لتصيب الخلايا في وزارة الداخلية من 300 في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر / جيدا باستخدام prewarmed DMEM + 10٪ FCS.
   ملاحظة: الكثافة المتوقعة للخلايا هيلا 229 المصنفة في زمن مضاعفة الطبيعي بعد 72 ساعة هو 3.136 × 10 ⁴ خلايا / جيد. كمية البكتيريا اللازمة لنقل العدوى في وزارة الداخلية 300 هو 9.408 × 10 ⁶ في 50 ميكرولتر، وهو ما يعادل 1.88 × 10 ⁸ بكتيريا / مل.
   1. باستخدام القيمة المحسوبة من QPCR (جينوم / مل) (4.3.3.3)، يخفف من إعادة علقت البكتيريا باستخدام قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS في الحجم النهائي من 2 مل لتصيب الخلايا العكس transfected.
2. إزالة وسائل الإعلام الموجودة من الفراغ وعكس الخلايا transfected.
3. إضافة 50 ميكرولتر من البكتيريا المخفف (1.88 × 10 ⁸ بكتيريا / مل) إلى الآبار المناسبة. إضافة 50 ميكرولتر من DMEM + 10٪ FCS إلى كل من الفراغ وشآبار ninfected.
4. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية + 5٪ CO _2.

6. إضافة BlaM الركيزة لتحديد مستوى من إزفاء (DAY 8)

1. إعداد الحلول لBlaM الركيزة حل 6X التحميل.
   ملاحظة: يتم توفير حلول A و B و C ضمن عدة الركيزة BlaM (انظر الجدول المواد). الحل B قد تشكل راسب في RT. تسخين هذا الحل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ويعجل يجب أن تذوب.
   1. عند استخدام عدة لأول مرة، إضافة 185 ميكرولتر من DMSO (مرفق مع عدة الركيزة BlaM) إلى الحل المجفف A. وفي وقت لاحق، وتخزين إعادة علقت الحل وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   2. إعداد 0.1 حل M بروبينسيد مقدما وتخزينها في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      1. تحضير 0.4 M هيدروكسيد الصوديوم (1.6 غرام في 100 مل O ₂ درهم).
      2. إعداد 100 ملي نا العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 8 (1.56 غ ناه ₂ ص ₄ .2H 2 هبو ₄ في 100 مل O ₂ درهم).
      3. حل 1.25 غرام من بروبينسيد في 22 مل من 0.4 هيدروكسيد الصوديوم M من الانفعالات قوية.
      4. إضافة 22 مل من 100 ملي نا العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 8 (الحل سوف تتحول غائم) ويحرك المزيج حتى يذوب الراسب أن الأشكال.
      5. ضبط درجة الحموضة إلى 8 (إذا لزم الأمر) باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك.
      6. يقلب بقوة وحرارة معتدلة (<50 درجة مئوية) حتى يكون الحل واضحا في الغالب.
      7. فلتر (0.2 ميكرون حجم المسام) وقسامة في 1 مل وحدات التخزين. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
2. لكل بئر، استخدم 0.06 ميكرولتر الحل A، 0.54 ميكرولتر الحل B، 7.9 ميكرولتر الحل C و 1.5 ميكرولتر 0.1 M بروبينسيد. خلق مزيج الرئيسي ل30 بئرا من خلال الجمع بين الأول 1.8 ميكرولتر من الحل وو 16.2 ميكرولتر من الحل B معا في أنبوب microfuge. تخلط جيدا باستخدام الدوامة. إضافة 237 ميكرولتر من الحل مئوية و 45 ميكرولتر من 0.1 M بروبينسيد. دوامة من الجمع بين كل componenالخبر.
   ملاحظة: الحل 6X تحميل مستقرة لمدة تصل إلى 4 ساعات (في الظلام) ولكن ينبغي أن تكون مستعدة في أقرب وقت ممكن قبل الاستخدام.
3. إضافة 10 ميكرولتر من الحل 6X تحميل مباشرة في جميع الآبار فارغة وعكس transfected دون إزالة وسائل الإعلام الحالية.
4. احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة في الظلام.
5. لتحديد مستوى النبات، قياس كمية من مضان باستخدام قارئ صفيحة.
   ملاحظة: الإجراء التالي غير محددة للقارئ ClarioSTAR صفيحة. ويمكن أيضا أن القراء صفيحة أي ما يعادل استخدامها.
   1. إنشاء بروتوكول كثافة مضان جديد باستخدام نقطة النهاية في وضع القراءة.
   2. ضبط المعايير الأساسية على النحو التالي:
      1. اختر صفيحة 96-جيدا.
      2. ضمن إعدادات البصرية، حدد 2 multichromatics مع إعدادات المعرفة التالية: (1) المدخلات 410-10 الإثارة نانومتر و 520-10 الانبعاثات نانومتر. (2) إثارة الإدخال 410-10 نانومتر و 450-10 الانبعاثات نانومتر. ضمان المزيد الصورة جيدايتم تحديد ichromatics.
      3. اختر المتوسط ​​المداري التي يبلغ قطرها 3 مم.
      4. تحت البصرية، وتحديد البصرية السفلي.
      5. تحت السرعة والدقة، حدد دقة. وهذا يتوافق مع ثماني مناطق لكل بئر.
   3. ضبط تخطيط لوحة عن طريق تحديد الآبار المناسبة كما العينات.
   4. حدد قياس البداية.
   5. إزالة الغطاء ووضع صينية في قارئ لوحة. لتجنب الوصول إلى القيم مضان القصوى، وضمان يتم تعديل قيمة الربح. للقيام بذلك، إجراء تعديل ربح إحدى الآبار المصابة التي تم transfected العكس مع مكتب المدعي العام سيرنا. وهذا يتوافق مع أعلى النبات المتوقع.
   6. حدد قياس بداية لقياس جميع الآبار المناسبة باستخدام مضان السفلي في الإثارة من 410 نانومتر، وانبعاث كلا 450 نانومتر و 520 نانومتر لمضان الأزرق والأخضر، على التوالي.

7. تحليل النتائج:

1. حساب نسبةمن 450 نانومتر إلى 520 نانومتر (الأزرق إلى اللون الأخضر) لجميع العينات بعد تقليل فارغة والتعبير بالنسبة للعينة مكتب المدعي العام غير المصابة.
   ملاحظة: يتم توفير الخطوات التحليل التالي لبرنامج جدول بيانات بسيطة.
   1. باستخدام وظيفة التصدير على القارئ صفيحة، ونقل القيم مضان الخام التي تم الحصول عليها لكل 520 نانومتر و 450 نانومتر انبعاث موجات (6.5) في جدول بيانات.
   2. حساب متوسط ​​قراءات "على بياض" (وسائل الإعلام فقط، أي الخلايا) لطول موجي 520 نانومتر بإضافة الخام 520 نانومتر القيم مضان وقسمة الناتج على عدد الآبار (3). تكرار استخدام فارغة 450 نانومتر قيم الطول الموجي. وتمثل هذه القيم مضان الخلفية نظرا لوحة 96 جيدا وسائل الإعلام.
   3. طرح مضان الخلفية. باستخدام القيم التي تم الحصول عليها في 7.1.2 طرح متوسط ​​فارغ الطول الموجي 520 نانومتر من كل القيم نانومتر مضان العينة 520. تكرار للقيم نانومتر طول موجي 450.
   4. للحصول على 450: نسبة نانومتر 520 تستخدم القيم تصحيح فارغة (7.1.3). تقسيم كل عينة من 450 نانومتر قيمة مضان من قبل في المقابلة 520 قيمة نانومتر.
   5. حساب متوسط ​​المعافين قيم النسبة مكتب المدعي العام بإضافة 450: 520 قيم نسبة نانومتر (من 7.1.4) وبقسمة عدد الآبار (3).
   6. حساب نسبة العينات النسبية لغير مصاب مكتب المدعي العام بقسمة 450: نسبة نانومتر 520 المحسوبة في 7.1.4 من متوسط ​​قيمة النسبة مكتب المدعي العام غير المصابة المحسوبة في 7.1.5.

8. إضافة نوى وصمة عار لتحديد ما عدد الخلايا بعد إزفاء الفحص (DAY 8)

1. بعد الكمي لمضان، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على حل تحميل 6X من جميع الآبار باستخدام محول متعدد القنوات تعلق على مصدر فراغ أو يدويا مع ماصة متعدد القنوات.
2. إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ PFA (امتصاص العرق) حلفي برنامج تلفزيوني لجميع الآبار المناسبة لإصلاح الخلايا. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
3. إزالة 4٪ PFA PBS الحل (كما في 8.1) وغسل خلايا مرتين مع 75 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
4. إضافة 50 ميكرولتر من خلية وصمة عار النووية قابلة للاختراق، على سبيل المثال دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، إلى كل بئر. الحصول على صور مع المجهر الفلورسنت وتحديد عدد النوى الموجودة في كل بئر بعد العلاج سيرنا باستخدام برمجيات تحليل الصور المناسبة، مثل يماغيج ^41.

لهذه الدراسة، وC. تم اختيار البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة كما CBU0077 ثبت سابقا أن يكون المستجيب translocated من نظام إفراز الكوكسيلا نقطة / آي سي إم 17. قبل الإصابة، فإن العدد الإجمالي للجينوم / مل في سبعة أيام C. وقد عددت ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 باستخدام QPCR الشكل 4 يوضح مثال على عتبة دورة (CT) القيم المتوقعة من كل من معايير ونماذج التالية QPCR. تم تصدير القيم ط (تمثيلها بيانيا في تضخيم قطعة أرض (الشكل 4B) وعدديا (الشكل 4C)) وتحليلها كما هو موضح في 4.3.3. واستنادا إلى بيانات تمثيلية مبين، كان هناك 2.31 ​​× 10 8 جينوم / مل في 10 مل إعادة علقت ثقافة البكتيرية (الشكل 4D). لتوليد تخفيف البكتيريا المناسب (1.88 × 10 8 جينوم / مل طن 2 مل)، 1.63 مل من البكتيريا معلق أضيف إلى 370 ميكرولتر من جديد، قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS. أصيب الخلايا عكس transfected مع سيرنا في وقت لاحق مع C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 في وزارة الداخلية من 300 لمدة 24 ساعة.

بعد مرور فترة الحضانة من العكس transfected الخلايا المصابة مع BlaM الركيزة الكمي من النبات المستجيب يمكن تحديد باستخدام قارئ لوحة مضان. بعد تحليل كما هو موضح في 7، كل القيم النسبة التي تم تطبيع إلى غير مصاب مكتب المدعي العام كما يمكن تطبيع للمصاب مكتب المدعي العام. ويمكن تصنيف مستوى النبات المستجيب بعد إسكات الجينات المضيف إلى ثلاث نتائج بعد مقارنة المصابة سيطرة مكتب المدعي العام: (1) لم يطرأ أي تغيير. (2) زيادة المستجيب النبات. (3) انخفاض المستجيب النبات. التحليل الإحصائي لاحق، على سبيل المثال الطالب اختبار (ت)، ويمكن استخدامها لتحديد أهمية أي اختلاف ر احظس المصابين سيطرة مكتب المدعي العام. يظهر نتيجة لإسكات أي Rab5A أو Rab7A على النبات المستجيب من ثلاث تجارب مستقلة في الشكل 5A. حدث انخفاض كبير في مستوى BlaM-CBU0077 النبات خلال إسكات كل من Rab5A وRab7A مقارنة للسيطرة مكتب المدعي العام (قيمة ص = 0.0088 (Rab5A) وقيمة ص = 0.0059 (Rab7A)، وإرفاقها، طالبة ر اختبار). وأنشئت أيضا تأثير العلاج سيرنا على بقاء الخلية. بعد فحص النبات، تم إصلاح الخلايا، ملطخة وصمة عار النوى وكميا في وقت لاحق. كما هو مبين في الشكل 5C، على الرغم من أن العلاج إما Rab5A أو Rab7A النتائج إلى انخفاض في بقاء الخلية مقارنة مع الشاهد مكتب المدعي العام (12٪ و 31٪ على التوالي)، هذا التخفيض ليس بالحدة التي PLK1 (97٪)، جين معروف أن يسبب موت الخلايا (ع القيمة = 0.0102 (Rab5A)؛ ف قيمة = 0.0081 (Rab7A)؛ ف قيمة <0.0001 (PLK1)، وإرفاقها، طالبة اختبار t). هذه النتائج تثبت كيف إسكات المضيف جنرال الكتريكالأخبار باستخدام سيرنا يمكن أن يغير سلبا على مستويات النبات المستجيب البكتيرية.

الشكل 1. آلية عمل BlaM الركيزة من خلال العدوى. C. والمنضوية البورنيتية بواسطة الخلايا المضيفة وتشكل فجوة المستمدة يحلول وصفته فجوة المحتوية الكوكسيلا. 24 ساعة بعد الإصابة، يتم تحميل الخلايا مع غشاء نفاذية الركيزة BlaM أن تمتلك اثنين fluorophores تشكيل الزوج الحنق (A). وفي غياب β-اكتاماز أي لا النبات من المستجيب BlaM-CBU0077، الإثارة من الكومارين في 410 النتائج نانومتر في الحنق إلى فلوريسئين، يحتفل به بوصفه مضان إشارة خضراء (520 نانومتر) (B). وفي حالة وجود نظام إفراز نقطة / آي سي إم الوظيفي، سيتم نقل البروتين الانصهار BlaM-CBU0077 في الخلية المضيفة وسوف CLإيف الركيزة BlaM، عبر النشاط β-اكتاماز، مما تسبب في فصل الأصباغ اثنين وأدى إلى الحنق الفوضى وإشارة مضان الأزرق (450 نانومتر) بعد الإثارة في 410 نانومتر (C). ويمكن لكل من إشارات مضان الأخضر والأزرق يكون الكشف باستخدام قارئ لوحة مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الشكل 2. تخطيطي لمحة عامة عن عكسي ترنسفكأيشن وإزفاء الفحص سير العمل يوم 1: إعداد C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة يوم 4: transfect عكسي باستخدام 40 نانومتر سيرنا والبذور هيلا 229 الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية من 3.92 × 10 3 خلايا / جيد في صينية 96-جيدا يوم 5: الفصلوسائل الإعلام أنج يوم 7: قياس مجموع العوامل الوراثية / مل من C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة باستخدام QPCR وبالتالي تصيب خلايا transfected العكس مع وزارة الداخلية من 300. يوم 8: إضافة 6X صبغ التحميل وقياس مضان وتحديد عدد الخلايا الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. تخطيط لوحة 96-جيدا تستخدم لإعداد ترنسفكأيشن عكسي والبذر من هيلا 229 خلايا. آبار "على بياض" (كما هو موضح باللون الأحمر) تحتوي على وسائل الإعلام فقط، وليس في حاجة إلى إضافة أي سيرنا أو هيلا 229 الخلايا. يستخدم مكتب المدعي العام سيرنا (كما هو موضح باللون الأزرق الفاتح للآبار غير المصابة والأزرق الداكن للآبار المصابة) كوسيلة لمراقبة عدم استهداف، نظرا لأنه تم الأمثل للديهم عدد أقل من الآثار بعيدا عن الهدف. والمارون وآبار خضراء تمثل Rab5A وRab7A سيرنا، على التوالي. يستخدم PLK1 سيرنا (كما هو موضح باللون الأصفر) كمقياس للكفاءة ترنسفكأيشن عن فقدان التعبير PLK1 يمكن أن تحدث مسارات الموالية لأفكارك وموت الخلايا واسعة النطاق في الغالبية العظمى من خطوط الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. القيم الممثل QPCR ط المستعملة ل quantitate إجمالي عدد جينوم / مل في C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة. (A) الشروط دورة المستخدمة في QPCR تعداد عدد من العوامل الوراثية / مل في الثقافات الكوكسيلا. يتم تمثيل القيم ط لكل المعايير والعينات في رسومية (ب) والعددي (C)الأشكال. (D) وبلغ متوسط ​​قيم ط م القياسية، رسوم بيانية، وحسب خط اتجاه لوغاريتمي. باستخدام المعادلة ومتوسطات عينة ط م تقدر العدد الكلي للجينوم / مل في C. تم تحديد ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 لتكون 2.31 ​​× 10 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. إزفاء من نقطة / آي سي إم المستجيب BlaM-CBU0077 أثناء سيرنا إسكات Rab5A وRab7A. هيلا 229 الخلايا و transfected العكس مع سيرنا محددة لRab5A (الحانات المارون)، Rab7A (أشرطة خضراء)، مكتب المدعي العام (أشرطة زرقاء) أو PLK1 (أشرطة صفراء) وحضنت لمدة 72 ساعة قبل الإصابة مع C. سلالة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في وزارة الداخلية من 300 لمدة 24 ساعة. بعد رانه إضافة الركيزة BlaM، وقد تم قياس مضان باستخدام قارئ صفيحة (أ) يوضح الجدول القيم مضان الخام تم الحصول عليها من تجربة واحدة جنبا إلى جنب مع 450: 520 نانومتر نسبة نسبة إلى سيطرة مكتب المدعي العام غير المصابة بعد الطرح القيم الفارغة (وسائل الإعلام فقط، أي الخلايا). يتم عرض مستوى النبات (ب) وبقاء الخلية (C) كنسبة مئوية يعني ± الانحراف المعياري بالنسبة لمكتب المدعي العام عكس الخلايا المصابة transfected من ثلاث تجارب مستقلة. * القيمة الاحتمالية <0.05. ** ف قيمة <0.01، **** ف قيمة <0.0001 (الاقتران، طالبة ر -test). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. المكونات المطلوبة لجعل 1X ACCM-2.

الجدول 2. حجم 1X سيرنا العازلة المطلوبة لترطيب المجففة بالتبريد سيرنا إلى التركيز المناسب.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.