مقالة منهجية

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

11.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54218

⸱

يوليو 15, 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

الانقسام الحي أمر بالغ الأهمية لكل كائن حي وغالبا ما تؤدي العيوب إلى السرطان واضطرابات النمو. باستخدام بروتوكول التصوير هذا وسمك الزرد كنظام نموذجي ، يمكن للباحثين تصور الانقسام في كائن فقاري حي والعديد من العيوب التي تنشأ عندما تكون العمليات الانقسامية معيبة.

الملخص

الانقسام أمر بالغ الأهمية للنمو العضوي والتمايز. عملية ديناميكية للغاية ويتطلب أمرت الأحداث لتحقيق التكثيف السليم لونين، التعلق أنيبيب الحيز الحركي، العزل الصبغي، والانقسام السيتوبلازمي في فترة زمنية صغيرة. أخطاء في عملية حساسة يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان. الأساليب التقليدية التحقيق الحالات المرضية الإنقسامية الإنسان غالبا ما تعتمد على أنظمة زراعة الخلايا، التي تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الطبيعي والتنموي / السياق الأنسجة محددة المفيد عند دراسة الأمراض التي تصيب البشر. هذا البروتوكول يتغلب على العديد من العقبات من خلال توفير وسيلة لتصور، مع ارتفاع القرار، وديناميات كروموسوم في النظام الفقاريات، الزرد. هذا البروتوكول سوف بالتفصيل النهج التي يمكن استخدامها للحصول على صور ديناميكية تقسيم الخلايا، والتي تشمل: النسخ في المختبر، وتربية الزرد / جمع ودمج الجنين، والوقت الفاصل بين التصوير. تحسين وmodifيتم استكشاف أيضا ications من هذا البروتوكول. باستخدام H2A.F / Z-EGFP (تسميات لونين) وmCherry-CAAX (تسميات غشاء الخلية) الأجنة حقن الرنا المرسال، الانقسام في AB-النوع البري، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 هو تصور الزرد متحولة. عالية الدقة التصوير الحي في الزرد يسمح احد لمراقبة mitoses متعددة لقياس إحصائيا العيوب الإنقسامية وتوقيت تطور الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ مراقبة الجوانب النوعية التي تحدد العمليات غير لائقة الإنقسامية (أي عيوب congression، missegregation من الكروموسومات، الخ) ونتائج الكروموسومات غير لائق (أي عدم توازن الصبغيات، تعدد الصيغ الصبغية، النويات، وما إلى ذلك). هذا الاختبار يمكن تطبيقها على مراقبة الأنسجة التمايز / التنمية وغير قابلة للاستخدام الزرد متحولة وكلاء الدوائية. تصور كيف عيوب في الانقسام تؤدي إلى السرطان والتنموية اضطرابات سوف كثيراتعزيز التفاهم من التسبب في المرض.

المقدمة

الانقسام هو الحاسم الخلوي ضروري عملية النمو، والتمايز، وتجديد في الكائن الحي. على إعداد دقيق وتكرار الحمض النووي في الطور البيني، وكانت سببا في الخلية للقسمة. وبدأت المرحلة الأولى من الانقسام، الطور، من خلال تفعيل السيكلين B / Cdk1. يتميز الطور الأول من التكثيف من مادة الكروماتين في الكروموسومات. يحدث المغلف انهيار النووي في الانتقال بين الطور الأول وطليعة الطور التالي. في طليعة الطور التالي، جسيم مركزي، ومركز نواة للتشكيل المغزل، والبدء في الهجرة إلى أقطاب المعاكس في حين تمتد الأنابيب الدقيقة بحثا عن التعلق الحيز الحركي. عند الإلحاق، والتحويلات لوضع حد على التعلق أنيبيب وقوات التوتر توجيه الكروموسومات تشكيل لوحة الطورية 1. إذا تعلق جميع الكروموسومات بشكل صحيح، اقتنعت حاجز الجمعية المغزل، والمشقوق حلقات cohesin عقد الصبغي شقيقة معا، والأنابيب الدقيقة تقصير لسحب الشقيقةالصبغي إلى أقطاب المعاكس خلال طور الصعود 2،3. المرحلة النهائية، الطور النهائي، ينطوي على استطالة الخلية وإعادة تشكيل الغلاف النووي حول اثنين من نواة جديدة. السيتوبلازمي يكمل عملية الانقسام من خلال فصل السيتوبلازم اثنين من الخلايا الوليدة الجديدة 4-6. تغيير مسارات رئيسية الإنقسامية (أي حاجز الجمعية المغزل، ازدواجية الجسيم المركزي، chromatid الشقيقة التماسك، الخ.) يمكن أن يؤدي إلى اعتقال الطورية، missegregation من الكروموسومات، وعدم الاستقرار الجيني 7-10. في نهاية المطاف، ويمكن عيوب في مسارات السيطرة على الانقسام يسبب اضطرابات النمو والسرطان، مما استلزم تصور الانقسام وعيوبه في العيش، والفقاريات، كائن متعدد الخلايا 10-16.

الأجنة الزرد بمثابة كائن نموذج رائع للتصوير الحية ويرجع ذلك إلى نسيج شفاف، وسهولة حقن مكروي، والتطور السريع. باستخدام الزرد، والهدف العام من هذا المخطوط هووصف وسيلة 5D الحية (أبعاد X، Y، Z، والوقت، والطول الموجي) التصوير من الانقسام 17 (الشكل 1C). استخدام الزرد متحولة خلل في مسارات مختلفة الإنقسامية تدليل على ذلك من مثل هذه العيوب. لهذا البروتوكول، وقد تم اختيار أورورا باء وEsco2 المسوخ لتوضيح هذه العيوب. أورورا B هو كيناز الذي هو جزء من مجمع كروموسوم الركاب (CPC) تشارك في تشكيل المغزل والتعلق أنيبيب. مطلوب أيضا لتشكيل انشقاق ثلم في السيتوبلازمي 18،19. في الزرد، ونقص أورورا B يؤدي إلى عيوب في الحث ثلم، السيتوبلازمي، وكروموسوم الفصل 20. Esco2، من ناحية أخرى، هو أسيتيل التي لا غنى عنها لchromatid الشقيقة التماسك 21،22. ومن acetylates cohesin على الجزء SMC3 من الحلبة وبالتالي استقرار cohesin لضمان الفصل كروموسوم السليم في المرحلة الانتقالية الطورية طور الصعود 23. فقدان Esco2 في الزرد يؤدي إلى التشابترmissegregation romosome، من السابق لأوانه الفصل الكروماتيدات الشقيقة، عدم الاستقرار الجيني، والتي تعتمد على البروتين p53 وموت الخلايا المبرمج مستقلة 24،25. ونظرا لتوفر، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 الزرد متحولة (يشار إليها فيما aurB م / م وesco2 م / م، على التوالي) وسوف تستخدم لتوضيح هذه التقنية 25-27.

وقد مكن اقتران متحد البؤر المجهري مع الآلات خلية فلوري الموسومة الباحثين إلى تصور لونين وغشاء الخلية ديناميات خلال الانقسام 25،28،29. تاريخيا استخدمت الهستونات الفلورسنت الموسومة إلى تصور لونين. الهستونات هي البروتينات النووية مكونة من أربعة أزواج مختلفة (H2A، H2B، H3، H4 و) التي هي المسؤولة عن هيكل جسيم نووي أن يؤلف الكروموسومات 30. في حين H2B يمكن القول إن هيستون الأكثر استخداما لالبروتينات الفلورية فيوقد ثبت الماوس وزراعة الخلايا، واستخدام هيستون 2A، Z الأسرة (H2A.F / Z) تماما للاستخدام في الزرد 31،32. كونكانافالين ألف والكازين كيناز 1-جاما على سبيل المثال، تعريب لغشاء الخلية، وقد أظهرت سابقا فعالا في تصور غشاء الخلية في قنافذ البحر وذبابة الفاكهة 33،34. وقد أظهرت دراسات أخرى أن CAAX بروتين فلوري الموسومة تسميات غشاء الخلية وكان ناجحا في الزرد 31. CAAX هو الحافز معترف بها من قبل الأنزيمات المعدلة بعد متعدية مثل farnesyltransferases وgeranylgeranyltransferases. تعديلات من قبل هذه الانزيمات تسبب البروتينات التي تساعدهن على غشاء المرتبطة بها، وبالتالي وصفها غشاء الخلية 35.

بسبب الاستخدام السابق في الزرد، واختار هذا البروتوكول لاستخدام H2A.F / Z وCAAX لتسمية لونين وغشاء الخلية. وتطبيق هذه الطريقة تسمح للباحث لمراقبة الانقسام على مستوى الخلية الفردية لمراقبة كروموسوم فرديديناميكية، وكذلك في وقت واحد يراقب الانقسامات الخلوية المتعددة التي قد تؤثر على تمايز الأنسجة والتنمية. هذه المادة سوف تركز على تصوير ديناميات فصل الكروموسومات خلال الانقسام على مستوى الخلية الفردية. ضمن هذه المخطوطة، والقدرة على مراقبة عدة أقسام الإنقسامية، حساب الوقت الانقسام، وفك الظواهر الإنقسامية سيتم توضيح ومناقشتها. باستخدام هذه المعايير، من الناحية الفسيولوجية البيانات ذات الصلة يمكن جمعها وتطبيقها على عدة ولايات المرض تتأثر العيوب الإنقسامية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. النسخ في المختبر

  1. خطي pCS2-H2A.F / Z-EGFP و / أو ناقلات pCS2-mCherry-CAAX من تقييد نوتي هضم انزيم 31. باستخدام الحمض النووي الريبي في عدة نسخ في المختبر، وتوليد 5 "المنتجات مرنا توج من كل قالب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تنقية مرنا توج باستخدام طقم تنقية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة. أزل مع ريبونوكلياز خالية H 2 O.
  3. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف. (OD 260 س تخفيف × 40 ميكروغرام / مل).
  4. تخفيف الحمض النووي الريبي إلى 100 ​​نانوغرام / ميكرولتر لكل H H2A.F / Z-EGFP وmCherry-CAAX مع ريبونوكلياز خالية من 2 O. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفض جدا، سوف تتضاءل مضان أو غائبة. سوف عينات أكثر إشراقا يقلل من المخاوف بشأن الضيائية وphotobleaching من. من ناحية أخرى، يمكن أن الكثير من RNA أن تكون سامة و / أو يسبب من آثار الهدف.
    ملاحظة: تخزين المتبقيةمرنا تنقيته في الثلاجة -80 درجة مئوية.

2. تربية اسماك الزرد، وجمع الأجنة، ومرنا حقن 36-38

  1. تجميع الدبابات تربية بحاجز لفصل خزان إلى منطقتين وملء كل خزان تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية المستخدمة في منشأة الزرد.
  2. من أجل منع تكاثر في وقت غير مناسب، ووضع اثنين من ذكور السمك على جانب واحد من الجدار وسمكتين الإناث على الجانب الآخر الليل قبل التزاوج.
  3. في اليوم التالي، ذوبان الجليد الخليط مرنا معدة مسبقا على الجليد. استبدال المياه في خزانات تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية العذبة وإزالة الحواجز. على الفور بعد سحب الحواجز، الحارة لحقن القالب إلى 28.5 درجة مئوية، وإعداد المعدات ل microinjection.
    ملاحظة: للحصول على معلومات حول قوالب حقن، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36.
  4. جمع البيض كل 10 - 15 دقيقة باستخدام مصفاة الشاي وشطف البيض إلى 100 × 15 ملم طبق بيتري نظيفة مع البريد3 الأزرق (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4، 10 -5٪ الميثيلين الأزرق). يستخدم E3 الأزرق لمنع نمو الفطريات وضمان التنمية السليمة للأسماك اليرقات. لمزيد من المعلومات عن التزاوج وجمع الأجنة، راجع غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski.
  5. تضمين نظمت خلية واحدة الأجنة في قالب حقن حرارة وحقن الحمض النووي الريبي في صفار البيض في المبلغ المطلوب من الأجنة (الشكل 1A). حساب للموت الجنين الطبيعي والأجنة غير مخصبة عن طريق إجراء الحقن الجنينية على 15٪ أكثر الأجنة من اللازم للتجربة. للحصول على تفاصيل إضافية عن Microinjection من الأجنة الزرد، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski.
    ملاحظة: للحصول على الاستخدام لأول مرة من مرنا، إجراء تحليل للجرعة منحنى لتحديد الجرعة المثالية لمضان وقدرتها على البقاء (كما هو موضح أي عيوب التنموية الإجمالية تصل إلى 5 DPF) قبل إجراء التصوير 5D. 150 - 200 نانوغرام / ميكرولترتحقن الأجنة في كثير من الأحيان على تركيز الأمثل، وبالتالي فإنه هو نقطة انطلاق جيدة لتركيز النهائي.
  6. استخراج بعناية الأجنة المحقونة من القالب باستخدام المعدلة 9 "زجاج باستور ماصة. لتعديل ماصة، تذوب نهاية باستخدام موقد بنسن حتى تشكل الكرة.
  7. وضع الأجنة المحقونة في طبق بيتري 100 × 15 ملم في E3 الأزرق ومنزل في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
  8. ستة ساعة بعد الحقن، وإزالة أي أجنة ميتة أو غير مخصبة من لوحات وإضافة نظيفة E3 الأزرق. منزل الأجنة في 28.5 درجة مئوية.

3. إعداد والتضمين من لايف الزرد الأجنة للتصوير (الشكل 1B)

  1. اثنين من ساعة قبل التصوير، وشاشة الأجنة حقن لGFP باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح. وضع الأجنة، معربا عن GFP الخضراء الزاهية في جديد 100 × 15 ملم طبق بيتري مع E3 الأزرق.
  2. تغلي حل سهم من 1٪ انخفاض الاغاروز تذوب بإضافة 1 غرام من ذوبان منخفضة الاغاروز إلى 100 مل من E3 الأزرق. بعد استخدام الاغاروز، تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم. يبقى الحل الأسهم مفيد لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. قسامة 3 مل من آغار ذاب في أنبوب ثقافة 17 × 100 ملم. إبقاء الحارة الاغاروز عن طريق وضع أنبوب الثقافة في 42 ° C حمام الماء لتصبح جاهزة للاستخدام. يعد حل 15 ملم تريكين في الماء منزوع الأيونات لتخدير الأجنة الزرد 36.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب تصوير في نقطة زمنية سابقة، يمكن انخفض تركيز أجار ما يصل الى 0.3٪ 39.
  4. تقديم 15 ملي تريكين والأجنة فرزهم، وانخفاض الاغاروز ذوبان، E3 الأزرق، و35 ملم الزجاج ساترة طبق ثقافة أسفل إلى مجهر الضوء تشريح. إزالة بعناية المشيماء الجنين مع # 5 ملاقط. هل هذا لمدة ثلاثة أجنة.
  5. وضع الأجنة dechorionated في وعاء منفصل ليتم تخدير. وكثيرا ما يستخدم غطاء الطبق ساترة القاع لهذا الغرض. باستخدام ماصة نقل، إضافة ثلاث قطرات (حوالي 150 ميكرولتر)من 15 ملي تريكين على طبق من 5 مل E3 الأزرق (في حالة استخدام غطاء ساترة طبق السفلي) أو حتى الأجنة تم تخدير بما فيه الكفاية. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 3-4 قطرات (حوالي 150 - 200 ميكرولتر) من 15 ملي حل تريكين إلى 1٪ أنبوب الاغاروز ذاب.
  6. باستخدام ماصة P200 مع 1 سم من طرف ماصة قطع. نقل الأجنة تخدير على طبق القاع ساترة. إزالة أي E3 الأزرق الزائد: حل تريكين.
  7. ببطء إضافة 5-10 ميكرولتر من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز: حل تريكين على الأجنة، والحفاظ على كل قطرة منفصل لضمان الأجنة لا ينجرف عن طريق الخطأ بالقرب من بعضها البعض.
    تحذير: إذا كان الاغاروز دافئة جدا، فإنه سوف يضر الجنين. درجة حرارة جيدة للحفاظ على أجار في غير 42 درجة مئوية.
  8. باستخدام 21 G 1 ½ إبرة، توجيه بلطف الجنين في الاغاروز إلى الموضع المطلوب. عند استخدام مجهر مقلوب للتصوير مرور الزمن، توجيه المنطقة ذات الاهتمام (ROI) أقرب إلى ساترة وقت possibجنيه.
    ملاحظة: لأغراض عامة، ومنطقة ذيل تقدم سهولة التوجيه وضوح بسبب رقيقة نسبيا الأنسجة (الشكل 1A). الأنسجة الأخرى، مثل الطبقة الظهارية المحيطة صفار البيض وزعنفة طيات، ويمكن استخدامها 28،29. هذه الأنسجة توفر وضوح، ولكن هذه المناطق ليست سوى عدد قليل من طبقات الخلايا سميكة. لغرض هذا البروتوكول، فإنه من المفيد لصورة المنطقة الذيل للحصول على أكبر عدد ممكن من انقسامات الخلية ممكن.
  9. السماح لدقائق قليلة لتجميد جزئي للأجار. استخدام إبرة لكسر بعيدا قطعة صغيرة من أجار لاختبار التصلب لها. عندما قطعة من أجار يمكن سحبها بعيدا عن الهبوط، انتقل إلى الخطوة التالية.
  10. تغطية ساترة كامل مع انخفاض أجار ذوبان تشكيل القبة على الأجنة المضمنة. السماح للأجار ليصلب قبل أن ينتقل إلى صحن للتصوير متحد البؤر (الشكل 1A).
  11. أثناء عملية التصلب أجار (يأخذ حوالي 10 دقيقة)، وإعداد 3 مل سحل و E3 الأزرق مع خمس قطرات من (حوالي 250 ميكرولتر) 15 ملي تريكين لتوضع على الأجنة جزءا لا يتجزأ من خلال التصوير.

4. 5D متحد البؤر التصوير من لايف الزرد الأجنة 40،41

ملاحظة: انظر أريجا 40 و 41 اوبراين للحصول على تفاصيل حول كيفية تنفيذ 5D التصوير باستخدام أنظمة متحد البؤر الأخرى. لZ-الفاصلة، Z المكدس، Z-العمق، الفاصل الزمني، وتعريفات 5D انظر الشكل 1C.

  1. فتح برامج التصوير وتعيين المجهر ل60X NA 1.4 عدسة الهدف. تطبيق زيت الغمر إلى عدسة موضوعية ووضع الطبق الثقافة في حامل الشرائح على المسرح المجهر. باستخدام وحدة تحكم محور ومركز جنين الفائدة فوق عدسة موضوعية وتقديم عدسة الهدف التصاعدي لتلبية الطبق الثقافة.
  2. انقر على أيقونة العين قطعة والتحول إلى مرشح GFP على المجهر. التركيز على العائد على الاستثمار. التركيز على الأنسجة الأقرب إلى ساترة وسffer أفضل نتائج التصوير.
  3. إزالة التعشيق. اختيار القنوات GFP وmCherry (قبل مجموعة موجات في مجال البرمجيات) وتعيين خط الخيار إلى وضعها الطبيعي في المتوسط.
  4. استخدام "التحكم عرض / شراء / A1 مسح منطقة" الأمر لفتح أداة A1 مسح المنطقة.
  5. بدء المسح الضوئي. باستخدام وحدة تحكم محور، وضع الجنين بحيث يتم تعبئة منطقة المسح الضوئي مع أكبر قدر من الزرد وقت ممكن. قوة الليزر ليست في حاجة إلى أن يكون الأمثل في هذه النقطة. خفض قوة الليزر لتجنب photobleaching من غير الضروري.
  6. استخدام "التحكم عرض / شراء / شراء ND" الأمر لفتح لوحة التحكم اكتساب ND.
  7. بدء المسح الضوئي لتعيين المعلمات Z-المكدس. تعيين الحد الأعلى Z كومة إلى حيث الخلايا ليست في التركيز والحد الأدنى إلى حيث الخلايا لم تعد مرئية. السماح لمساحة 3 ميكرون فوق عينة للنمو وحركة الخلية، التي قد توسع في مجال التصوير. ض المكدس للالأرقام الواردة في هذا المواليةغطت tocol لZ-عمق 40 ميكرون في ذيل الجنين.
  8. تعيين حجم الخطوة زي الفاصل إلى 2 ميكرون. في المتوسط، خلية هي 10 ميكرون في القطر. ول2 ميكرون سوف تنتج خمس فترات خلال تصوير البيانات ليتم تحليلها لكل خلية.
    ملاحظة: عمق للصورة التي يمكن الحصول عليها تعتمد على الفاصل الزمني Z. وضحى Z قرار للحصول على عمق الشامل في البعد Z من أجل صورة عن العديد من الخلايا التي تمر الانقسام ممكن (كبير Z-العمق). معكوس هو الصحيح، في ذلك، من خلال خفض حجم الخطوة، واكتسبت Z القرار، في حين يتم التضحية Z عمق (صغير Z-العمق).
  9. ضبط قوة صورة ليزر، ذات الجهد العالي، ومستويات تعويض. لالتجارب أثبتت في هذا البروتوكول، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات المحددة على الصعيدين المقابلة، على التوالي، للقناة GFP تعويض. 2-5، 120-140، و-9 إلى -11. للقناة mCherry، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات، على التوالي تعويض. 3-6، 120-140، و-3 ل-8. مرة واحدة يتم تعيين المعلمات، اغلاق الفحص لمنع التعرض ليزر غير الضرورية التي قد تسبب الضيائية وphotobleaching من العينة.
  10. حدد رمز المتوسط ​​خط 2X. "لا المتوسط" تنتج صورة مشوشة في حين أن "خط 4X المتوسط" يزيد بشكل كبير من وقت الفحص. استخدام المتوسط ​​خط 2X يوفر أفضل جودة الصورة ووقت أسرع المسح الضوئي.
  11. تحديد الفاصل الزمني والمدة الزمنية المناسبة اللازمة للتجربة. لالانقسامات من النوع البري، فترات زمنية لمدة دقيقتين لمدة 2 ساعة هو أفضل لتحديد مدة الإنقسامية (المستخدمة في أرقام 1، 2، 3A، و3B). الانقسامات التي تنشط حاجز الجمعية المغزل لمدة أطول من 30 دقيقة هي أكثر ملاءمة لمدة خمس فترات دقيقة لمدة أربعة ساعة من أجل الحفاظ على مضان كما هو موضح في الشكل 3C.
  12. ضع علامة في المربع "حفظ إلى ملف" واسم الملف لحفظ الملف تلقائيا كما يتم الحصول عليه. الاختيار المزدوج جميع سنويايتم تعيين rameters بشكل صحيح وضرب "بدء تشغيل".
  13. بعد الاستحواذ الكامل، لعرض ملف في شكل ثلاثي الأبعاد، انقر على أيقونة عتبة حجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل (2) القدرة على مراقبة العديد من الانقسامات الخلوية باستخدام طريقة عرض حقل واسع من AB البرية من نوع الذيل الزرد. يتم تصوير أكثر من سبع خلايا الإنقسامية في إطار زمني 14 دقيقة (فيلم 1). خلال العامين ساعة الوقت طبعا، تم القبض على أكثر من 40 أحداث الإنقسامية. في المتوسط، لوحظت 50 تقسيم الخلايا في AB و 30 تقسيم الخلايا في أور ب الأجنة م / م (الشكل 2B). لحساب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدام هذا الأسلوب يسمح احد لاستنتاج انهيار النووي المغلف، وتشكيل لوحة الطورية بواسطة إرفاق ملفات-أنيبيب الحيز الحركي، والفصل بين الصبغي الشقيقة لتشكيل لجنتين خلايا جديدة في الجسم الحي وبطريقة تعتمد على الوقت. القدرة على مراقبة الانقسام في الزرد هو مفيد على عينات الثابتة وأنظمة زراعة الخلايا ليتم تصوير الخلايا في علم وظائف الأعضاء الطبيعي، والأنسجة شفافة والذي يسمح لالبروتينات الفلورية لاستخدامها، وتطوير سريع نسبيا، والوقت الفاصل بين التصوير يمكن الحصول عليها. ويقتصر است...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر كريستين كوان على متجهات pCS2-H2A.F / Z-EGFP و pCS2-mCherry-CAAX. نشكر كريس روديش على تعليمنا التصوير المباشر في سمك الزرد. نشكر شون ويليامز وإريك مالاركي وبراد يودر على المساعدة في التصوير متحد البؤر في UAB ومرفق التصوير عالي الدقة في UAB. يتم دعم مرفق التصوير عالي الدقة من قبل منحة دعم مركز UAB الشامل للسرطان (P30CA013148) والمركز الأساسي للأمراض الروماتيزمية (P30 AR048311). JMP مدعوم من قبل المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (NIH R21 NS092105) ، والمنح التجريبية من جمعية السرطان الأمريكية (ACS IRG-60-001-53-IRG) ومركز UAB الشامل للسرطان (P30CA013148). SMP مدعوم من خلال منحة تدريب البيولوجيا الخلوية والجزيئية T32 (5T32GM008111-28).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ناقلات pCS2هدية من K. Kwanللحصول على البلازميد ذي الأهمية
NotI-HF إنزيم تقييدNew England BioLabsR3189Sلتقييد هضم مجموعة البلازميد
mMessage SP6Life TechnologiesAM1340ل in vitro < / em>
RNeasy Mini KitQiagen74104لتنقية mRNA
100 × 15 مم أطباق بتريفيشر FB0875712 العلميلإسكان الأجنة قالب
الحقن المجهريمحلي الصنعلحمل الأجنة أثناء الحقن المجهري
Agarose IIAmresco0815-25Gلتضمين الأجنة
TricaineSigma-AldrichE10521-10Gلتخدير الأجنة
كلوريد الصوديومSigma-AldrichS9888بالنسبة لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كلوريد البوتاسيومSigma-AldrichP3911لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجما-ألدريتشC8106لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
كبريتات المغنيسيومفيشر ScientificM7506لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
Methylene Blue HydrateSigma-AldrichMB1لمياه الجنين (E3 Blue) ، مذاب في UltraPure H2< / sub>O
أنبوب ثقافة 100 ممفيشر ساينتفيك50-819-812للأجار الذائب
35 مم غطاء زجاجي أسفل طبق ثقافة   ؛ماتيك كوربP35G-0-20-C رقم 0 ، زجاج 20 مم ، لتضمين الأجنة
# 5 ملاقطDumont72701-Dللأجنة المفككة
21 G 1 1/2 إبرة قياسBecton Dickinson305167لتحديد موضع الأجنة في مجهر تشريح أجار
نيكون AZ100لفحص الأجنة وتضمينها ، فإن أي نطاق تشريح سيقوم بعمل
مجهر متحد البؤرنيكون A1 +لبرنامج التصوير بفاصل زمني
البؤرعناصر NIS AR 4.13.00للحصول على الصور ومعالجتها
نسخ متحد

المراجع

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041(2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206(2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518(2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051(2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943(2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H2A F Z EGFP mCherry CAAX Aurora B Esco2

مقالات ذات صلة