Method Article

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار في الموقع التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في انواع معينة ايليجانس

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نبلغ عن إجراء موجز للتهجين الموضعي (FISH) في الغدد التناسلية والأجنة من Caenorhabditis elegans لمراقبة وقياس التسلسلات المتكررة. لقد نجحنا في ملاحظة وقياس تسلسلين متكررين مختلفين ، وتكرارات التيلومير ونموذج الإطالة البديلة للتيلوميرات (TALT).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomere عبارة عن بنية بروتين نووي ريبي تحمي نهايات الكروموسومات من الاندماج والتدهور الشاذ. يتم الحفاظ على طول التيلومير بواسطة التيلوميراز أو مسار بديل ، يعرف باسم الإطالة البديلة للتيلوميرات (ALT) 1. في الآونة الأخيرة ، C. ايليجانس ظهر ككائن حي نموذجي متعدد الخلايا لدراسة التيلومير و ALT2. يعد تصور التسلسلات المتكررة في الجينوم أمرا بالغ الأهمية في فهم بيولوجيا التيلوميرات. بينما يمكن قياس طول التيلومير عن طريق مقايسة جزء تقييد التيلومير أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، فإن هذه الطرق توفر فقط متوسط طول التيلومير. على العكس من ذلك ، يمكن أن يوفر التهجين الفلوري في الموقع (FISH) معلومات التيلوميرات الفردية في الخلايا. هنا ، نقدم بروتوكولات ونتائج تمثيلية لطريقة تحديد طول التيلومير ل C. ايليجانس عن طريق التهجين الفلوري في الموقع. توفر هذه الطريقة إجراء بسيطا ولكنه قوي في الموقع لا يسبب ضررا ملحوظا للتشكل. باستخدام الحمض النووي الببتيد المسمى بالفلورسنت (PNA) والمسبار المسمى digoxigenin-dUTP ، تمكنا من تصور تسلسلين متكررين مختلفين: تكرارات التيلومير وقالب ALT (TALT) في C. ايليجانس الأجنة والغدد التناسلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التيلومير يحمي نهايات الكروموسومات من الانصهار الشاذة والتدهور. يتكون التيلومير الثدييات يكرر G الغنية hexameric، TTAGGG، والمجمعات shelterin. تسلسل التيلومير تكرار الديدان الخيطية هي مماثلة لتلك التي من الثدييات (TTAGGC). معظم حقيقيات النوى الاستفادة تيلوميراز إضافة يكرر التيلومير إلى غاياتهم الكروموسومات. ومع ذلك، 10 - 15٪ من الخلايا السرطانية تستخدم التيلوميراز آلية مستقلة، والمعروفة باسم البديل تطويل التيلوميرات (ALT) 3. سابقا، وذكرت أن يكرر شريط الحامض النووي ومتواليات المرتبطة به، ويدعى تالت، وتضخمت في التيلوميرات من خطوط متحولة التيلوميراز التي نجت العقم حرجة 2.

وقد تم قياس طول التيلومير بواسطة PCR الكمي أو اللطخة الجنوبية، التي تنص على متوسط ​​طول التيلومير من إجمالي 4،5،6،7. قراءة عدد من تكرار التيلومير في كامل البيانات تسلسل الجينوم هو أيضا مؤشرا من إجمالي محتويات التيلومير 8. على الرغم من الخطيئةغلي التيلومير طول تحليل (STELA) يمكن أن توفر طول التيلومير واحد، فإنه لا يمكن أن توفر معلومات المكانية التيلومير 9. في حين POT-1 :: mCherry البروتين مراسل يوفر المعلومات المكانية التيلومير في الجسم الحي، فإنه لا يمكن أن تمثل أطوال التيلومير المزدوج تقطعت بهم السبل، كما POT-1 هو التيلومير واحد حبلا البروتين 10 ملزمة.

بينما توفر طرق المذكورة أعلاه المعلومات المتوسط ​​من تسلسل المتكررة، مضان في الموقع التهجين (FISH) يسمح لمراقبة كمية ونمط المكاني للتسلسل الفردية للاهتمام على نطاق والكروموسومات. بدلا من تنقية الحمض النووي، يتم إصلاح الأنسجة أو الخلايا للحفاظ على المعلومات المكانية المحلية في الأسماك. وهكذا، FISH هو أداة الكمية والنوعية على حد سواء لرصد تسلسل تكرار الفردية، مثل تكرار التيلومير.

يوفر هذا البروتوكول وسيلة فعالة للكشف في وقت واحد على حد سواء TELOمجرد وأخرى يكرر على أساس التحسينات من الأساليب المذكورة سابقا 11،12. C. ايليجانس اليرقات أو البالغين متعددة الخلايا مع خلايا متباينة للغاية. عدم تجانس الخلايا يعرقل على التحليل الكمي لعدد كبير من البقع التيلومير. لزيادة عدد الخلايا تحليلها والأجنة معزولة وانتشرت على الشرائح المغلفة متعدد الليزين للأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا البروتوكول أيضا أن تقترن المناعي.

كبرهان أن يعمل البروتوكول، وتبين لنا أنه من الممكن لمراقبة وتحديد اثنين من سلاسل متكررة مختلفة. تم إنشاء مسبار الحمض النووي ضد TALT1 مع بسيطة PCR دمج digoxigenin-dUTP. ثم تم تهجين هذه مسبار TALT1 ومضان المسمى التيلومير السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق في وقت واحد. وفي وقت لاحق، تم الكشف عن digoxigenin بالطرق المناعي الكنسي. نقدم هنا الصور التمثيلية حيث TALT1 colocalized مع التيلومير في TRT-1 الناجين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحقيقات وصفها مع Digoxigenin-dUTP بواسطة PCR

  1. أداء PCR وضع العلامات مع 10x مزيج dNTP تحتوي على digoxigenin-dUTP كما هو موضح سابقا (13).
  2. تنقية المنتج PCR مع تنقية تدور العمود وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. إذا كان التحقيق هو أقصر من 200 سنة مضت، وإزالة الحرة digoxigenin-dUTP مع اللوني تدور عمود من خليط التفاعل بدلا من تنقية تدور العمود.

2. إعداد الشرائح متعدد الليزين المغلفة

ملاحظة: الإجراء بأكمله يستغرق حوالي 2 ساعة. تتم معظم الخطوات في درجة حرارة الغرفة باستثناء خطوة التجفيف.

  1. تنظيف الشرائح
    1. ضع الشرائح في وعاء من البلاستيك وشطف الشرائح لفترة وجيزة مع الماء المقطر (DW). إزالة المياه وملء حاوية مع DW تحتوي على 1٪ منظف الزجاج.
    2. تستنهض الهمم الشرائح لمدة 15 دقيقة في 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تغسل الشرائح مع DW 3مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
    3. تغسل الشرائح مع 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة مع الإثارة. تجاهل 70٪ من الإيثانول ووضع الشرائح على كتلة جافة 65 درجة مئوية، والهواء الجاف لمدة 15 دقيقة.
  2. طلاء متعدد الليزين من الشرائح الزجاجية متعددة جيدا
    ملاحظة: طلاء متعدد الليزين من الشريحة الزجاجية خطوة هامة، لأنه يوفر التصاق العينة في جميع أنحاء الداخلي تلطيخ. سيئة الشرائح المغلفة سيؤدي إلى فقدان العينة.
    1. تمييع الحل الأسهم متعدد الليزين إلى 0.01٪ (ث / ت) في الماء المقطر. إضافة 20 ميكرولتر من المخفف 0.01٪ (ث / ت) متعدد الليزين إلى آبار شريحة زجاجية نظيفة.
    2. احتضان شريحة زجاجية لمدة 5 دقائق على RT.
    3. ضع الشرائح على 65 درجة مئوية كتلة جافة والهواء الجاف لمدة 1 ساعة.
    4. تخزين الشرائح متعدد الليزين في مربع مجانا الغبار.

3. التثبيت من الديدان على شريحة زجاجية (الشكل 1)

  1. إعداد الأجنة لFISH
    ملاحظة: الديدان الحصاد قبل كل رويستهلك انه الغذائي البكتيري من خلال مشاهدة وسائط النمو تحت المجهر. الجوع يقلل من إنتاج البيض من الديدان البالغة ويزيد من فقس البيض. وصفت وسائل مفصلة في 14،15.
    1. تنمو الديدان في 50 ملم بيتري طبق وفقا للطرق القياسية 14.
    2. بعد استهلاك جميع المواد الغذائية البكتيرية، وقطع وسائل الإعلام أجار في الربع مع الملعقة. تعقيم ملعقة قبل قطع لمنع التلوث.
    3. وضع كل قطعة من أجار على (NGM) لوحة 100 ملم وسائط النمو الخيطية. تحويل قطعة أجار رأسا على عقب للديدان للوصول إلى الغذائي الجرثومي جديدة.
    4. بعد 48 إلى 72 ساعة، وجمع الديدان مع العازلة M9. إضافة 3-5 مل من العازلة M9 على لوحة NGM. عازلة ماصة M9 على سطح NGM لغسل الديدان.
    5. جمع السائل مع الديدان وإضافة إلى أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: إذا كان هناك حطام أجار بعد الحصاد، الطرد المركزي الديدان في محلول السكروز 30٪. بينما مكعبات الحطام والديدان تطفو علىالسطح.
    6. إضافة العازلة M9 لتعويض حجم 15 مل. بيليه الديدان بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة معظم عازلة M9. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
      ملاحظة: إذا الديدان لا تزال تطفو بعد الطرد المركزي، وتعيين مستوى الفرامل من أجهزة الطرد المركزي لقيمة = 1.
    7. عازلة نضح M9. إضافة محلول تبييض لالديدان. في 0.5 مل من الديدان، وإضافة 6.5 مل من DW، 2 مل من هيبوكلوريت، 1 مل من 5 M KOH.
    8. احتضان الديدان مع هزاز في RT لمدة 3 دقائق في 50 دورة في الدقيقة. الديدان دوامة لمدة 15 ثانية للقص ميكانيكيا الديدان وفضح البيض.
    9. مراقبة أنبوب تحت المجهر تشريح خلال التبييض. تأكد من أن يتم قطع الديدان في نصف ويتم إطلاقها البيض. عندما يتم حل معظم الجسم الكبار، إضافة عازلة M9 لتعويض حجم 15 مل.
    10. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح معظم من M9 وإضافة عازلة M9 جديدة لتعويض حجم 15 مل. كرر غسل خطوة 3 مرات.
      ملاحظة:تجنب استخدام كمية زائدة من الديدان، لأنها تعيق عملية التبييض. الحفاظ على وقت رد الفعل الكلي أقل من 8 دقائق حتى يغسل. الإفراط في ابيض البيض تنتج تألق ذاتي قوي.
    11. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة مع بوليسوربات 20 (PBST) ما يصل إلى 200 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لجعل 2٪ PFA.
      تحذير: منذ PFA غير مسرطنة، وارتداء الملابس الواقية والقفازات ودرع العين قبل استخدام منهاج العمل.
    12. إضافة 40 ميكرولتر من البيض في 2٪ PFA على بئر متعدد الليزين المغلفة الشرائح.
    13. وضع الشرائح في غرفة رطبة واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إغلاق غرفة رطبة الحق بعد توضع الشرائح في الداخل.
      ملاحظة: البيض تترسب في القاع من الشرائح في حين يجري الثابتة.
  2. إعداد الغدد التناسلية تشريح للأسماك
    1. الديدان حصاد الكبار نمت على 50 ملم لوحة NGM قبل pipetting 1 مل من العازلة M9. الديدان الحصاد قبل الغذائي الجرثومي المنضب.
    2. غسل الديدان من أي بكتيريا خفة دمح عازلة M9، 2 مرات.
      ملاحظة: البكتيريا المتبقية قد تتداخل مع الغدد التناسلية تشريح من التمسك متعدد الليزين المغلفة الشرائح.
    3. بيليه الديدان بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز. إزالة M9 ونقل الديدان لوحة NGM فارغة من micropipette.
    4. إضافة 30 ميكرولتر من العازلة M9 التي تحتوي على 2 ملي الليفاميزول على بئر متعدد الليزين تعامل الشرائح.
    5. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة M9 إلى أنبوب 1 مل. استخدام هذا المخزن المؤقت لنقل الديدان بواسطة ماصة الفم.
    6. ملء غيض من ماصة الفم مع العازلة M9 عن طريق وضع الشعرية في أنبوب 1 مل يحتوي المخزن المؤقت M9.
    7. تحت المجهر تشريح، ووضع غيض من ماصة الفم فقط أمام رئيس الكبار دودة وسحب ماصة الفم حتى أن رئيس الديدان يدخل ماصة الفم. مرة واحدة في الرأس من الديدان تدخل طرف، وسيتم اختيار مجموعة كاملة من دودة إلى الحافة.
    8. نقل الديدان إلى الشريحة متعدد الليزين المغلفة باستخدام ماصة الفم.
    9. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع منو الرأس أو طرف الذيل من الديدان على الشريحة. عندما يتم قطع دودة، والغدد التناسلية تخرج. والغدد التناسلية التمسك الشرائح.
      1. إعداد 30 على الأقل الديدان في بئر واحدة. المزيد من الآبار يمكن استخدامها لمدة 30 الديدان آخر.
    10. ضع الشريحة في غرفة رطبة ونضح قبالة العازلة M9 مع ماصة الفم.
    11. إصلاح العينة بإضافة 20 ميكرولتر من 2٪ PFA في RT لمدة 15 دقيقة في غرفة رطبة.

4. التثبيت وPermeabilization

  1. وضع كتلة الألومنيوم على الثلج الجاف وتخزينها في المجمد العميق (-80 درجة مئوية). متجر الميثانول والأسيتون في -20 درجة مئوية.
  2. بعد PFA تثبيت خطوة 3.1.15 أو 3.2.11، وإزالة تثبيتي باستخدام micropipette ترك ~ 5 ميكرولتر من تثبيتي.
  3. وضع متعدد الليزين المغلفة شريحة أخرى على الشريحة عينة. إزالة تثبيتي مع منشفة ورقية إذا كان الحل هو المفرط. لا تتحرك الشرائح مرة واحدة عالقون معا.
  4. تجميد الشرائحعلى كتلة الألومنيوم لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: هذه العينات ويمكن تخزين لا يقل عن 2 - 3 أيام.
  5. في حين يتم تجميد الشرائح، ووضع الجرار التي تحتوي على الميثانول البارد والأسيتون على الجليد.
  6. تأخذ الشرائح من وحيلة لهم لتجميد كسر العينة. تجاهل الشريحة العليا. على الفور نقع الشريحة في الميثانول الجليد البارد لمدة 5 دقائق.
  7. نقل الشرائح إلى الأسيتون المثلج مدة 5 دقائق.
  8. تغسل شرائح 3 مرات مع PBST لمدة 5 دقائق لإزالة تثبيتي المتبقية. انتقل إلى الخطوة التالية أو تخزين الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذه العينات ويمكن تخزين لا يقل عن 2 - 3 أيام.

5. تهجين الخلايا الثابتة

  1. إضافة 20 ميكرولتر من حل ريبونوكلياز (PBST تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A). احتضان الشريحة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. غسل الشريحة مرتين في المياه المالحة 2X و سيترات الصوديوم مع بوليسوربات 20 (2X SSCT) لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  3. إضافة 20ميكرولتر من محلول التهجين وضعت غرفة رطبة في الحاضنة 37 درجة مئوية. بعد 1 ساعة، وإزالة حل التهجين من قبل pipetting.
  4. قبل إزالة حل التهجين، وإعداد التحقيق. إذا كان المسبار المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، وتفسد تحقيقات عن طريق التسخين في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة جافة. وبعد التسخين، تبريد التحقيق في فترة وجيزة الجليد.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من محلول التهجين التي تحتوي على تحقيقات للعينة. للسلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، تركيز استخدام في نسبة 1: 2000 ولتحقيق المسمى حفر، تركيز استخدام في نسبة 1: 200. تغطية العينة مع غطاء زجاجي.
  6. وضع منشفة ورقية مبللة بالماء على كتلة الحرارة (80 درجة مئوية). وضع غطاء علبة بلاستيكية على كتلة الحرارة للحفاظ على الرطوبة ودرجة الحرارة.
  7. بعد درجة حرارة كتلة الحرارة قد استقرت (80 ° C)، ضع الشريحة عينة على منشفة ورقية ساخنة وتغطية العينات مع غطاء علبة بلاستيكية. تفسد العينة لمدة 3 دقائق.
  8. المؤتمر الوطني العراقيأوباتي الشرائح في غرفة رطبة ليلا 37 درجة مئوية.

6. يغسل والمناعي

  1. الاحماء الحل غسل التهجين (2X SSC، 50٪ الفورماميد) إلى 37 درجة مئوية.
  2. غسل العينة في PBST مرتين في RT لمدة 5 دقائق. إزالة الغطاء الزجاجي.
  3. غسل العينة في التهجين حل غسل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. غسل الشريحة عينة في PBST 3 مرات في RT. ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غرفة رطبة في RT.
  5. إضافة 20 ميكرولتر من حل الحجب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة.
  6. إزالة عرقلة الحل وإضافة FITC مترافق مكافحة digoxigenin الأجسام المضادة حل (1: 200) لمدة 3 ساعة على RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

7. تركيب والمراقبة

  1. غسل الشريحة عينة مع PBST 2 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد حل مع دابي. وضع غطاء زجاجي واضغط بلطف. إزالة أي حل الزائدمع منشفة ورقية.
  3. لمنع تبخر حل المتصاعدة، وختم حواف الزجاج غطاء بطلاء الأظافر.
  4. مراقبة تحت المجهر متحد البؤر. استبعاد الأجنة مع خلفية عالية. التركيز على حقل مع 4-20 نوى.
  5. التقاط صور وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع 100X عدسة الهدف.
    ملاحظة: تثير عينة مع 405 نانومتر ليزر لدابي، مع 555 نانومتر ليزر لCY3، مع 488 نانومتر ليزر لFITC.

8. الكمي لالتيلومير الإشارة

ملاحظة: تم الكمي كما هو موضح سابقا (16). جميع الصور التي سيتم مقارنة ينبغي أن تؤخذ مع نفس الإعداد بما في ذلك وقت التعرض ومصدر الضوء.

  1. تصدير الصورة في شكل. TIF.
  2. تحميل وتثبيت برنامج تحليل الصور.
  3. تنفيذ برنامج تحليل الصور وانقر على زر الموافقة.
  4. انقر زر فتح. فتح الصور مع السمك التيلومير بالنقر المزدوج فوق ملف الصورة.
  5. انقر[عدل] - [المنطقة المعالجة مختارة]، حدد المنطقة من اهتمام من قبل انقر بزر الماوس الأيسر والسحب. استبعاد جميع تلطيخ غير محددة.
  6. انقر على [قياس] - [بقعة الكثافة البصرية]، حدد القناة مع إشارة التيلومير وأدخل اسم ملف لحفظ النتائج في ملف txt.
    ملاحظة: عمود من النتائج هي بالترتيب التالي: الإسفار من بقعة، وكثافة خلفية بقعة ومنطقة من بقعة.
  7. نسخ القيم وطرح كثافة خلفية بقعة من مضان الفور. ويمكن الآن للقيم يتم تحليلها إحصائيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وذكر في وقت سابق أن الناجين ALT يمكن أن تنشأ من المسخ-التيلوميراز ناقصة، TRT-1 (ok410)، في التردد المنخفض من تكرار محلية داخليا قالب من ALT "(تالت) تسلسل للصيانة التيلومير 2. عن طريق السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، كنا قادرين على تصور التيلومير في الغدد التناسلية تشريح (الشكل 2A). تم الكشف عن إشارة التيلومير باهتة سواء في TRT-1 (ok410) والناجي ALT. وقد تتداخل إشارة غامض فقط مع دابي، مما يشير إلى أنها...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا هي بساطة الإجراء دون ضرر ملحوظ على التشكل من الهيكل الخلوي. تم الأمثل عدة خطوات لC. FISH ايليجانس في هذا البروتوكول. وتشمل الخطوات الحاسمة لFISH الناجح وضع العلامات من تحقيقات، تثبيت الأجنة والاختراق. يوفر Digoxigenin-dUTP طريقة وضع العلامات وسيلة سهلة الاستخدام لطريقة وضع العلامات من قبل PCR أو شق الترجمة. لتسمية طويلة تسلسل الهدف، ويفضل نيك الترجمة. في هذه الحالة، يجب أن يتم هضمها تحقيقات مع انزيم تقييد المناسبة لتسهيل تغلغل تحق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير سلالات الديدان الطافرة من قبل مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة. تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI14C1277).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مسبار PNAمخصصPANAGENE
Anti-Digoxigenin-Fluorescein ، شظايا فاب11207741910استخدام Roche 1: 200 مخفف في PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
ألبومين مصل الأبقارSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP-6148تحضير 4٪ بارافورمالدهيد عن طريق التسخين في DW مع بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم. أضف 0.1 حجم 10x PBS.
مختبرات فيكتاشيلدناقلاتH-1200
محلول3x SSC, 50٪ فورماميد, 10٪ (وزن / حجم) كبريتات ديكستران, 50 μ جم / مل هيبارين ، 100 &# 956 ؛ جم / مل خميرة الحمض النووي الريبي ، 100 &# 956 ؛ جم / مل من المنوية السلمون المونيجات الحمض النووي
Hybridizaiton محلولالغسيل 2x SSC ، 50٪ فورماميد
فورماميدبيونيرC-9012
الميثانولالسام كارلو إربا
أسيتونكارلو إربا
الهيبارينSIGMA-ALDRICHH3393صنع 10 مجم / مل لمحلول المخزون
كبريتاتديكسترانSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSل 1 لتر DW: 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2.0 جم KCl ، 27 جم Na2< / sub>HPO4< / sub>&# 8226; 7H2< / sub>O ، 2.4 جم KH2< / sub>PO
PBST1x PBS ، 0.1٪ توين -20
بولي سوربات 20SIGMA-ALDRICHP-2287الاسم التجاري هو محلول Tween-20
Poly-L-Lysine (0.1٪ وزن / حجم)SIGMA-ALDRICHP-8920تحضير محلول طازج 0.01٪ وزن / حجم قبل استخدام
M93 جم كيه< ساب >2 < / فرعي > PO < > 4 < / فرعي > ، 6 جم Na 2 < / sub >HPO 4< / sub > ، 5 جم كلوريد الصوديوم ، 1 مل 1 م MgSO4< / sub> ، H2< / sub>O إلى 1 لتر
تبييض20٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 0.5 M KOH
للأجسام المضادة1x PBST ، 1 ملي مولار EDTA ، 0.1٪ BSA ، 0.05٪ أزيد الصوديوم (سام)
مانععازلة للأجسام المضادة مع 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA)
illustra Microspin G-50GE الرعاية الصحية27-53310-01
20x SSCلصنع 1 لتر ، 175.3 جم من كلوريد الصوديوم ، 88.2 جم من سترات الصوديوم ، H2< / sub>O إلى 1 لتر ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0
2x SSCT2x SSC ، 0.1٪ توين -20
10x digoxigenin-dUTP مزيج1 ملي مولار dATP ، 1 ملي مولار dGTP ، 1 ملي مولار dCTP ، 0.65 ملي مولار dTTP ، 0.35 ملي أعمدة تنقية DIG-11-dUTP
PCR منظفزجاج Cosmo genetechCMR0112
/ ULTRA CLEANDukssan كيماويات نقية8AV721
شريحة زجاجية متعددة الآبارMP الطبية الحيوية96041205
نمو الديدان الخيطيةلعمل 1 لتر ، 3 جم من كلوريد الصوديوم ، 17 جم من أجار ، 2.5 جم من البيبتون ، H2< / sub>O إلى 974 مل. الأوتوكلاف وتبريد القارورة. أضف 1 مل من 1 M CaCl 2< / sub> ، 1 مل من 4 مجم / مل من الكوليسترول في الإيثانول ، 1 مل من 1 M MgSO4< / sub> ، 25 مل من 1 M KPO4< / sub>.
شفرة ريشة الحلاقة LevamisoleSIGMA-ALDRICH196142
رقم 11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
microsope متحد البؤرZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X كعدسة موضوعية.
غرفةصندوق بلاستيكي مملوء بمنشفة ورقية غارقة في
برنامج تحليل الصور DW د. بيتر لاندسدوربTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502< / أ>
طلب هجين محلول عازلة محلول وسائط تم استخدام رطبة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles