يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل

15.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

يوليو 30, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المخطوطة نموذجا فريدا في المختبر لخلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية البشرية المنعقة المناعية المزروعة تحت نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. هذا النموذج مناسب لدراسة الآثار الوقائية للعلاجات الواعدة ، مثل الميلاتونين ، على مضاعفات الحمل المرتبطة بزيادة الإجهاد التأكسدي وتغير وظيفة المشيمة.

الملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغبية من المشيمة على المدى الطويل عن طريق عمليات الهضم الأنزيمية المتتالية ، متبوعة بالطرد المركزي للكثافة وعزل التدرج في الوسائط والتنقية المغناطيسية المناعية. كما لوحظ في الجسم الحي ، تتمايز خلايا الأرومة الغاذية الخلوية أحادية النواة في الثقافة الأولية إلى خلايا الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى بعد 72 ساعة. بالمقارنة مع نورموكسيا (8٪ O2) ، فإن خلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية التي تخضع لنقص الأكسجة / إعادة الأكسجة (0.5٪ / 8٪ O2) تخضع لزيادة الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج الجوهري ، على غرار تلك التي لوحظت في الجسم الحي في مضاعفات الحمل مثل تسمم الحمل والولادة المبكرة وتقييد النمو داخل الرحم. في هذا السياق ، تمثل الأرومات الغاذية الزغابية الأولية المزروعة في ظروف نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة نظاما تجريبيا فريدا لفهم الآليات ومسارات الإشارات التي يتم تغييرها في المشيمة البشرية بشكل أفضل وتسهيل البحث عن أدوية فعالة تحمي من بعض اضطرابات الحمل. تنتج الأرومات الغاذية الزغبية البشرية الميلاتونين وتعبر عن إنزيماتها ومستقبلاتها التوليفية. تم اقتراح الميلاتونين كعلاج لمقدمات الارتعاج وتقييد النمو داخل الرحم بسبب آثاره الوقائية المضادة للأكسدة. في نموذج خلية الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية الأولية الموصوفة في هذه الورقة ، ليس للميلاتونين أي تأثير على خلايا الأرومة الغاذية في الحالة الطبيعية ولكنه يعيد توازن الأكسدة والاختزال لخلايا الأرومة الغاذية المخلوية التي تعطلت بسبب نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. وبالتالي ، فإن خلايا الأرومة الغاذية الزغابية البشرية في الثقافة الأولية هي طريقة ممتازة لدراسة الآليات الكامنة وراء التأثيرات الوقائية للميلاتونين على وظيفة المشيمة أثناء نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين.

المقدمة

طوال فترة الحمل البشري، وخلايا الأرومة الغاذية الخلوية المشيمة، وهي الخلايا الجذعية mononucleated، تتكاثر بسرعة وتفرق في أي خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي أو extravillous. أرومة غاذية خلوية Extravillous تغزو واعادة تشكيلها الشرايين دوامة من جدار الرحم. أرومة غاذية خلوية زغبي، من ناحية أخرى، لا تزال تتكاثر، والتفريق والصمامات لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى (ومخلى) 1. الحفاظ على التوازن الأرومة الغاذية زغابي أمر ضروري لعافية الجنين والحمل الصحي. في الواقع، أرومة مغذية زغبي تسمح الصرف الأم الجنين من الأكسجين والمواد المغذية، وتنتج الهرمونات الضرورية للحمل. وعلاوة على ذلك، والأرومة الغاذية المخلوية هو الوحيد من نوع الخلية على اتصال مباشر مع الدورة الدموية للأم وتوفر حاجزا البدني والمناعية الأساسية. ولذلك، يجب على الأرومة الغاذية المخلوية الخضوع لموت الخلايا المبرمج واستبدال لصيانة التماثل الساكن وآفومعرف المشيمة الأمراض 2-5.

تسببت هذه التقنية التي وضعتها كليمان وآخرون. 6 في عام 1986 إلى عزل أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من مشيمة الآدمي ثورة في مجال البحوث المشيمة من خلال السماح للدراسة الآليات الجزيئية المعنية في التفريق الأرومة الغاذية الزغابي. هذه التقنية الكلاسيكية، على أساس الهضم الأنزيمية متتابعة مع التربسين والدناز، تليها العزلة في وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (جسيمات السيليكا الغروية المغلفة التي كتبها بوفيدون، أو Percoll) ومن المسلم به الآن باعتباره المعيار الذهبي لعزل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي. هذه التقنية يمكن أن يكون الأمثل من قبل immunopurification المغناطيسي، وهو الإجراء الذي يفصل أرومة غاذية خلوية زغبي من الخلايا غير الأرومة الغاذية على أساس التعبير التفاضلية للمستضدات معينة على أسطح هذه الخلايا. اخترنا الكريات البيض البشرية مستضد ABC (HLA-ABC) بسبب غياب التعبير عنها على MEMBRAN خلية الأرومة الغاذيةه 7،8.

المشيمة هي الجهاز الذي يخضع لتغيرات كبيرة في مستويات الأكسجين أثناء الحمل. في الثلث الأول من الحمل، ونسبة الأوكسجين هو من الناحية الفسيولوجية منخفضة جدا (2٪ O 2) ولكن الزيادات إلى مستويات معتدلة من الأوكسجين (8٪ O 2) في الثلث الثاني والثالث. وصف تيولي وآخرون. 9 أن الاستنساخ في المختبر البيئة الأرومة الغاذية داخل الزغابات المشيمية هو التحدي والاختلافات في مستويات الأوكسجين قد يؤدي حتى إلى تغييرات phenotypical. ولذلك، اقترح اعتماد 8٪ من الأكسجين كما normoxia لتقليد توتر الأوكسجين الموجودة في الزغابات المشيمية خلال الربع الثالث من الحمل 8،9. تشن وآخرون. 10 درس على نطاق واسع العديد من المتغيرات المتعلقة توتر الأوكسجين في زراعة الخلايا الأرومة الغاذية وأوضح أهمية تحديد مستويات الأكسجين في بيئة المحيطة بالخلايا. مستويات الأوكسجين في الزغابات تميل إلى زيادةنظرا لتكون الأوعية. تدفق الدم في الزيادات الزغابات المشيمية باستمرار ومستوى بيروكسيد الهيدروجين (وهي وفيرة أنواع الاكسجين التفاعلية) هو إشارة مهمة التي تسيطر تكون الأوعية 11،12. في مضاعفات الحمل، وعدم تكون الأوعية يولد نقص الأكسجين، والأهم من ذلك، والاختلافات متقطعة من الأوكسجين (وتسمى نقص الأكسجة / عودة التأكسج). هذه الظروف تؤدي إلى زيادة غير طبيعية في الاكسدة، الذي يعرض للخطر المشيمة والجنين 13،14 جدوى. التعديلات التي تخضع لخلايا الأرومة الغاذية في الجسم الحي خلال حلقة من نقص الأكسجة / عودة التأكسج يمكن تحاكي في المختبر على النحو التالي: يتم الاحتفاظ أرومة غاذية خلوية زغبي في ظل ظروف normoxic (8٪ O 2) حتى تتمايز إلى الأرومة الغاذية المخلوية. ثم يتعرضون لظروف نقص الأوكسجين (0.5٪ O 2) لمدة 4 ساعة، تليها 18 ساعة إضافية من normoxia (عودة التأكسج). باستخدام هذا النهج نقص الأكسجة / عودة التأكسج، أرومة مغذية السابقحررت hibit حالة الأكسدة والاختزال وزيادة مستويات الخلايا الجوهرية 8، كما لوحظ في بعض مضاعفات الحمل. وبالتالي، هذا هو مفيد في نموذج المختبر لتقييم نهج وقائية وعلاجية جديدة لمكافحة مضاعفات الحمل يرتبط مع المشيمة نقص الأكسجة / عودة التأكسج.

خلايا المشيمة تنتج الميلاتونين، الذي لديه عدة وظائف مهمة، مثل القدرة على تفادي الإجهاد التأكسدي وضعف المشيمة 15. هنا، نقدم نماذج النهج وخلية تجريبية تستخدم للتدليل على آثار وقائية من الميلاتونين في خلايا الأرومة الغاذية المشيمة على مستوى الجزيئات والخلايا وظيفية 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم الحصول على المشيمة مباشرة بعد الولادة المهبلية التلقائية من حالات الحمل غير معقدة في CHUM سانت لوك مستشفى، مونتريال، QC، كندا، مع موافقة المريض عن علم وموافقة لجان أخلاقية (CHUM سانت لوك مستشفى والنسبة المطبعة دوليا لمعهد أرمان-Frappier، لافال، QC، كندا).

1. عزل وتنقية خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي

  1. حلول ووسائل الإعلام
    1. إعداد وسائل الاعلام وسائل النقل من خلال استكمال Dulbecco لتعديل النسر متوسطة عالية الجلوكوز (DMEM-HG) مع 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الأساسي من خلال استكمال DMEM-HG مع 10٪ المجلد / المجلد مصل بقري جنيني (FBS)، 25 مم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) وتخزينها في 4 درجات مئوية. وسائل الاعلام الحارة إلى 37 درجة مئوية قبلاستعمال.
    3. إعداد 4 لتر من محلول ملحي (0.9٪ وزن / المجلد كلوريد الصوديوم).
    4. استعد تعديل هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) وذلك بإضافة 25 ملي HEPES ل1x أخرى HBSS (7.4 درجة الحموضة).
    5. إعداد الطازجة، وأربع زجاجات من الحل الهضم مع HBSS المعدلة (المعد في 1.1.4)، كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4)، كلوريد الكالسيوم (CaCl 2)، التربسين، ديوكسي ريبونيوكلياز الرابع (الدناز الرابع)، و 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية ( 10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) كما هو مبين في الجدول رقم 1.
    6. إعداد كثافة وسائل الاعلام الطرد المركزي التدرج
      1. إعداد الكثافة الطرد المركزي حل وسائل الاعلام من خلال استكمال كثافة وسائل الاعلام الطرد المركزي مع 10٪ المجلد / المجلد HBSS 10X.
      2. إعداد 14 أنابيب الاختبار مع الحل وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي وتعديل HBSS، كما هو موضح في الجدول رقم (2).
      3. خلط كل حل الكثافة (الخطوة 1.1.6.2) بقوة قبل أن يضيف محتواه على التدرج. بلطفإضافة حلول الكثافة إلى 50 مل أنبوب زجاجي الطرد المركزي مع مضخة تحوي (1 مل / دقيقة)، بدءا من أعلى تركيز (70٪). تجنب قطرات عن طريق استنزاف الحلول ضد جدار أنبوب للحفاظ على فصل الصحيح لكل طبقة من التدرج.
        1. في حالة عدم وجود مضخة تحوي، وتطبيق طبقات بلطف شديد مع ماصات باستور.
    7. إعداد عازلة تشغيل النهائي من خلال استكمال المخزن المؤقت تشغيل (انظر الجدول المواد) مع 2٪ المجلد / المجلد مضاد حيوي / مضاد فطري (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين). تخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. العزلة الأرومة الغاذية الخلوية زغبي
    ملاحظة: استخدام الخيوط الجراحية المعقمة المعدات والأواني الزجاجية، والماصات والقوارير، الخ
    1. في يوم من العزلة الأرومة الغاذية الخلوية زغبي، في 37 ° C حمام الماء، تدفئة حلول الهضم (من الخطوة 1.1.5) و 70 مل من FBS. ملاحظة: استخدام 50 مل من FBS لمقاطعة الهضم وتبقى 20 مل للخطوة التجميد (1.2.22) التي يمكن وضعها على الجليد إذابة مرة واحدة.
    2. بعد الولادة، وجلب المشيمة إلى مختبر في وسط النقل المثلج (من الخطوة 1.1.1) في أسرع وقت ممكن (أقل من 1 ساعة).
    3. متوسطة نقل نبذ ودم المشيمة في مزبلة السائلة. وزن المشيمة وتزج في محلول ملحي بارد.
    4. قياس وتحليل الميزات التالية: طول الحبل السري. توطين الحبل السري. طول المشيمة، والعرض، والشكل (بيضاوي، قرصي)؛ لون الغشاء. الأمراض هيكل فلقة. ملاحظة: يتم عرض البيانات في قسم النتائج.
    5. قطع الحبل السري إلى جانب الإدراج في المشيمة (أي عند قاعدته مع دائرة إضافية نصف قطرها 1 سم حول الحبل). تزج في 300 مل من النسيجي حل تثبيتي الأنسجة (الفورمالين 10٪) للتحليل النسيجي لاحق.
    6. قطع المشيمة بأكملها إلى مكعبات 5 × 5 × 5 سم. اغسل (4 مرات س ~ 1 دقيقة) في سول المالحةution (0.9٪) لإزالة خلايا الدم حتى محلول ملحي واضح. تجاهل الشطف السائل.
    7. في الزجاج ووتش، وإزالة الأغشية المشيمة والأنسجة واللحم المفروم لإزالة الأوعية الدموية وتكلسات. عقد الأوعية الدموية بحزم مع ملقط وإزالة الأنسجة باستخدام الجزء الخلفي من مقص Metzenbaum.
      1. وضع المشيمة المفروم في قمع بوشنر. شطف مع ما يقرب من 100 مل من العازلة المالحة. تواصل تنميق حتى 30 - يتم الحصول على 35 غرام من نسيج مفروم (استخدام البلاستيك وزنها قارب وعلى نطاق و). إذا لزم الأمر، تخطر على ما تبقى من المشيمة للحصول على ما يصل الى ثلاثة إضافية 30 - استعدادات 35 غ. خلال هذا الوقت، وضعت الأنسجة المفروم في قارب وزنها على الجليد.
        ملاحظة: هذه الخطوة سوف يستغرق حوالي 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
    8. إضافة 30-35 غرام أنسجة المشيمة المفروم إلى قارورة trypsinizing. نقل 150 مل من استعداد الهضم حل 1 (الجدول 1) إلى قارورة trypsinizing وتخلط جيدا.
    9. ضع قارورة trypsinizing فيوتهز حمام مائي لمدة 30 دقيقة بسرعة لا تزيد عن 50 دورة / دقيقة ويدويا مزيج القارورة trypsinizing كل 5 دقائق لعملية الهضم متجانسة.
    10. في نهاية عملية الهضم الأول، وإزالة قارورة trypsinizing من الحمام المائي وإمالته (45 درجة) لمدة 1 دقيقة لالرواسب وأنسجة المشيمة. مع 10 مل ماصة معقمة، وإزالة وتجاهل ما يقرب من 80 مل من طاف. تجنب الشفط الأنسجة.
    11. نقل 100 مل من محلول الهضم 2 (الجدول 1) إلى قارورة trypsinizing. تخلط جيدا وكرر الخطوة 1.2.9.
    12. في نهاية عملية الهضم الثاني، وإزالة قارورة trypsinizing من الحمام المائي وإمالته 45 درجة لمدة 1 دقيقة. مع 10 مل ماصة معقمة، إزالة 80 مل طاف ونقل بلطف لأنبوب الطرد المركزي مع مصفاة الخلية (100 شبكة ميكرون). نقل طاف تصفيتها إلى دورق يحتوي على 2 مل من FBS في كل مرة أنبوب الطرد المركزي ممتلئ.
    13. أداء الهضم الثالث كما هو موضح فيالهضم الثاني (1.2.11 و1.2.12) باستخدام 75 مل الهضم حل 3. وفي موازاة ذلك، نفذ الخطوات 1.2.15 ل1.2.16.1 لهضم 2.
    14. أداء الهضم الرابع تماما كما الهضم الثالث باستخدام حل الهضم 4 (75 مل)، ولكن جمع أكبر قدر ممكن من طاف. تنفيذ الخطوات 1.2.15 ل1.2.16.1 بالتوازي لعملية الهضم 3، وأخيرا لعملية الهضم 4.
    15. قسامة وطاف (من الهضم 2 و 3 و 4) إلى 13.5 مل أجزاء، كل جزء في واحدة أنبوب الطرد المركزي 15 مل. مع 22.8 سنتيمترا ماصة باستير الزجاج، بلطف شديد ووضع ببطء 1.5 مل من FBS في الجزء السفلي من كل أنبوب من أجل خلق طبقة منفصلة. لا تخلط FBS وطاف. أنابيب الطرد المركزي دون الفرامل لمدة 20 دقيقة في 1250 x ج في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي، 4 طبقات واضحة في الأنبوب، كما هو مبين في الشكل (1) فصل الخلايا التربسين والأرومة الغاذية يتجنب الهضم الخلوي المفرط.
    16. مع مضخة فراغ، aspirأكل وتجاهل طاف (حل الهضم) وطبقات FBS، بما في ذلك فيلم بيضاء بين طبقتين. resuspend الكرية (وأرومة مغذية وطبقات خلايا الدم الحمراء) مع 1 مل من الحارة خلية ثقافة المتوسط ​​(الخطوة 1.1.2، مع عدم وجود FBS ولا HEPES).
      1. جمع الخلايا معلق من جميع الأنابيب والجمع بينهما في 1 أنبوب. السماح للأنبوب الوقوف في درجة حرارة الغرفة حتى نهاية كل الهضم. ملاحظة: بعد كل الهضم، والعائد المعتاد هو 3 أنابيب من الخلايا معلق (واحد لكل الهضم).
    17. تشكل وحدة التخزين إلى 15 مل مع دافئ مستنبت الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف مع مضخة فراغ. تجنب الشفط بيليه.
    18. resuspend بلطف بيليه تم الحصول عليها من 3 أنابيب مع 1 مل من الحارة خلية ثقافة المتوسط. تجميع محتوياتها في 1 أنبوب. للحصول على 8 مل، واستكمال وحدة التخزين مع دافئ مستنبت الخلية.
    19. جدا طبقة بلطف تعليق الخلية على غراد الانفصالient مع ماصة باستور. أجهزة الطرد المركزي من دون فرامل لمدة 30 دقيقة في 507 x ج في درجة حرارة الغرفة.
    20. بعد الطرد المركزي، وتحديد طبقات مختلفة من الخلايا في الانحدار مع الإضاءة الخلفية. تحديد الطبقات التي تحتوي على الأرومة الغاذية وتلويث الخلايا بين 40 - 50٪ من متوسط ​​الكثافة الطرد المركزي. مع مضخة فراغ، وإزالة الطبقات العليا (> 50٪).
    21. جمع الخلايا الموجودة في طبقات الفائدة مع ماصة باستير ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تشكل وحدة التخزين إلى 50 مل مع خلية ثقافة المتوسط. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1250 x ج في درجة حرارة الغرفة.
    22. تحت ظروف معقمة، تجاهل طاف، resuspend الكرية مع 20 مل من FBS وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. على الجليد، إضافة 2.22 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل العقيمة (DMSO) وتخلط بلطف عن طريق التقليب. قسامة 1.5 مل من تعليق خلية في قارورة المبردة، وتجميد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية، ونقل إلى خزان النتروجين السائل.
    3. <لى> تنقية الأرومة الغاذية
    1. تثبيت الشطف ومخازن تشغيل وعمود فلتر جديد على الصك تنقية المغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. نفذ برنامج "نظيفة" لتنظيف السلبية 1، إيجابي 1 و 2 الإيجابي الموانئ، ومن ثم إدخال 50 مل أنابيب تحت كل ميناء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. ذوبان الجليد الخلايا التي تم تجميدها في الخطوة 1.2.22 بسرعة في 37 ° C حمام الماء. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وResuspend الخلايا برفق مع 20 مل من البرد حل العازلة على التوالي. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل طاف. كرر الخطوة غسل العازلة مع جارية باردة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد جدوى. كرر الطرد المركزي (لمدة 5 دقائق، 450 x ج في 4 درجات مئوية). إزالة بعناية طاف. إضافة 1 مل من العازلة جارية باردة تحتوي على 1٪ المجلد / المجلد الماوس الأجسام المضادة، HLA-ABC. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، للانترنتنانوغرام بلطف كل 5 دقائق.
    4. إضافة 6 مل من العازلة جارية باردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتكرار هذه الخطوة. Resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة جارية باردة تحتوي على 10٪ المجلد / المجلد من مكافحة فأر حبات مغناطيسية الثانوية إلى جانب الأجسام المضادة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، والخلط بلطف كل 5 دقائق.
    5. إضافة 6 مل من العازلة جارية باردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend في 5 مل العازلة جارية باردة.
    6. فصل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام أداة تنقية المغناطيسي. جمع الخلايا في ميناء سلبي وإضافة 20 مل من العازلة جارية باردة.
      ملاحظة: خلايا الأرومة الغاذية لا تحتوي على معقدة HLA-ABC، وبالتالي فصل من أنواع الخلايا الأخرى وتوجيهها نحو 1 منفذ السلبي.
    7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بلطف الخلايا في 20 مل دافئ مستنبت الأولية. عد الخلايا النقيبالجا عدادة الكريات لتحديد جدوى.
    8. لوحة الخلايا في كثافة التالية: 0.15 × 10 6 خلايا / جيد في لوحات 96-جيدا، 1.6 × 10 6 خلايا / جيد في 24 لوحات جيدة و 4.5 × 10 6 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    9. تأكيد نقاء خلايا الأرومة الغاذية التدفق الخلوي 16،17 و / أو مناعية 18.
      ملاحظة: تم تحديد نقاء من الخلايا immunopurified باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة FITC مترافق ضد cytokeratin-7 و فيمنتين 17-19. هذا البروتوكول هو مفصل بشكل جيد في Lanoix وآخرون، 2008 7.
    10. بعد لا يقل عن 4 ساعة، وشطف الخلايا مرتين مع مستنبت دافئ لإزالة الخلايا غير مرتبط ومن ثم نقل لوحات لغرفة normoxia، الذي يتكون من 8٪ O 2 (انظر الشكل 2 والباب 2).

2. في المختبر Inductioن من Normoxia ونقص الأكسجة / عودة التأكسج

  1. تشغيل غرفة الحاضنة (انظر الشكل 2A لمجموعة متابعة).
    1. في غطاء تدفق الصفحي، وضع طبق بتري تحتوي على الماء المعقم في الجزء السفلي من الغرفة الحاضنة لتجنب جفاف. ثم وضع لوحات أو قوارير (الخطوة 1.3.10) ثقافة خلية أعدت مسبقا على الرفوف العالية للغرفة.
    2. خارج غطاء محرك السيارة، ونعلق الغرفة (منفذ مدخل) للخرطوم الغاز (الشكل 2A: 5A، ب، ج) للوصول إلى أنبوب الغاز (8٪ O 2 أو 0.5٪ O 2) (الشكل 2A: 7). فتح كل مدخل ومخرج الموانئ من الغرفة. في هذه اللحظة، ومنظم الغاز (الشكل 2A: 4) يجب أن تظل مغلقة.
    3. بعناية فتح صمام منظم الغاز (الشكل 2A: 4). مطاردة لمدة 4 دقائق مع تدفق الهواء من 25 لتر / دقيقة تماما ليحل محل الهواء داخل الغرفة.
    4. بعد التنظيف الغرفة، أغلق منظم الغاز ثم مدخل وأووالموانئ tlet من الغرفة.
    5. افصل خرطوم تدفق متر منفذ (الشكل 2A: 5C) من مدخل الميناء من الغرفة ووضع الغرفة في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية.
    6. استبدال الهواء موجودة حاليا في لوحات، وقوارير وحلت في مستنبت عن طريق ملء الغرفة مع الغاز 1 ساعة بعد خطوة 2.1.3.
    7. كرر الخطوات من 2.1.1 إلى 2.1.6 للالتراكيب الغاز الأخرى (على سبيل المثال، 2٪ O 2 لالأشهر الثلاثة الأولى الثقافة الأرومة الغاذية 9).
  2. تأكيد نسبة الأكسجين (الشكل 2B-C)
    1. لتأكيد تركيز الأوكسجين في مستنبت خلايا (بدون الخلايا) داخل الغرفة، استخدم إلكترود أكسجين مرتبطة بمحول الأكسجين. ربط القطب الأكسجين إلى الفولتميتر.
    2. إنشاء منحنى المعايرة في نفس الحل (أي خلية ثقافة المتوسط) من خلال تعريض حل للغازات مع محتويات الأكسجين المعروفة (على سبيل المثال، 0٪ و21٪ أكسجين). بعد أن استقرت قراءات لكل تركيز، وإدخال القطب في المتوسط ​​في الغرفة.
      ملاحظة: خذ كل قياس في عمق نفسه من أجل تجنب أي تحيز في تركيز الأكسجين 10.
  3. تحريض normoxia ونقص الأكسجة / عودة التأكسج في أرومة مغذية.
    1. بعد إضافة خلايا الأرومة الغاذية الأولية إلى قوارير ثقافة الخلية المناسبة، لوحات أو أطباق بتري، نفذ العلاجات حسب الضرورة.
    2. في موازاة ذلك، داخل غرفة، وتعريض الخلايا لخليط الغاز المطلوب لإعادة إنتاج حالة معينة كل 24 ساعة (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العزلة وimmunopurification من خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي من المشيمة طبيعية المدى التي حصلت عليها الولادة المهبلية أسفرت 1 × 10 8 خلايا قابلة للحياة. وزن المشيمة 350 غرام، كانت 19 سم وقطرها 4 سم مع شكل القرصية والأغشية الشفافة. تم الكشف عن أي تشوهات فلقة. كان الحبل السري توطين مجاور للمركز ويبلغ طوله 56 سم. تم تقييم نقاء التدفق الخلوي باستخدام فيمنتين وcytokeratin-7 علامات. وكانت أكثر من 98٪ من الخلايا السلبية لفيمنتين وإيجابية لc...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الثدييات، تعتمد اعتمادا مباشرا على وظيفة المشيمة كافية نمو الجنين. وتستند أصول التنموية من الاضطرابات الصحية على فرضية أن سبب الأمراض يتجلى في وقت لاحق في الحياة يمكن ان ترجع الى التنمية في وقت مبكر وأن المشيمة دورا الآلية في البرمجة الجنينية 30-32. المشيمة هي الوسيط الرئيسي للنمو الجنين وتطوره: أنه ينظم نقل المواد الغذائية، ويحمي من التعرض الضارة، ولها وظائف الغدد الصماء الرئيسية. التطور الذي كليمان وآخرون من تقنية استنساخه لعزل أرومة غاذية خلوية أولية قابل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

بدعم من منح من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (رقم 262011-2009) إلى السيرة الذاتية ومنحة أبحاث العلوم الاجتماعية والسلوكية (# 12-FY12-179) إلى CV و JTS ؛ عن طريق المنح الدراسية إلى LSF من وزارة التعليم ، ومؤسسة البحوث في كيبيك (FRQ) - Nature et technologies (NT) ومؤسسة جامعة Armand-Frappier INRS ، إلى HC من Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE ، إلى AAHT من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) و FRQ-Santé ، وإلى JBP من NSERC ؛ من خلال زمالة EMAS من المجلس الوطني للدراسات العليا والتكنولوجيا (CNPq) وبرنامج التميز للدراسات المهنية MEESR-FRQNT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقص Metzenbaum المنحنيمعدات جراحية Shandon9212(عزل الخلايا) (2 وحدة) ملقط
منشق Fine 41/2 فيFisherbrand13-812-42المعدات الجراحية (عزل الخلايا) (2 وحدة) مقص
4.5 Str تشريحFisherbrand08-940المعدات الجراحية (عزل الخلايا) (2 وحدة)
إسفنجة شاش 10 سم × 10 سمالكاردينال361020733
طبق خبز زجاجي مستطيلPyrex1105397الأواني الزجاجية (2.8 لتر)
Funnel BuchnerCoorstek Inc10-356Eالأواني الزجاجية (قطر 114 مم)
ساعة زجاج   ؛بيركس9985100EMDالأواني الزجاجية
محلول الفورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪Sigma-AldrichHT501128-4Lمحلول تثبيت الأنسجة
النسيجي قوارير التربسينالأواني الزجاجية 355395 ويتون(1 وحدة)
أنابيب الثقافة التي يمكن التخلص منهاKimble73750-13100الأواني الزجاجية
البورسليكات زجاج باستور PIPET (22.8 سم)FisherbrandK63B1367820Cالأواني الزجاجية
250 مل أكواب زجاجيةFisherbrandKFS14005250
زجاجية مع غطاءFisherbrandKFS14395250الأواني الزجاجية (8 وحدات)
50 مل Corex Tube  ؛كورنينج8422-A(1 وحدة)
15 مل أنبوب طرد مركزي من البوليسترينكورنينج430791
50 مل أنبوب طرد مركزي من البوليسترينكورنينج430829
خلوية 11415038ماصة مصلية
100 مو ؛ م نايلونكورنينج431752
ماصة بطانةScienceware1199918
500 & nbsp ؛ مل زجاجات أعلى فلتركورنينجالمسام: 0.22   ؛ ومايكرو. م / متوسط و HBSS التحضير
2 مل قوارير كريوجينيككورنينج430488
حاوية تجميد ، نالجين السيد فروستيسيجما ألدريتشC1562-1EA
مضخة تمعجيةصيدلانية الكيماويات الدقيقةP3 نموذج
اهتزاز حمام الماءفيشرموديل 127
مضخة فراغABM4EKFS6CX-4
كلوريد الصوديومفيشربراندEC231-598-3محلول ملحي 0.9٪
هانك محلول الملح المخزن (Hbss)Sigma-AldrichH2387الكمية: 9.25 (قارورة واحدة) ل 1 لتر من محلول
الهضم حمض هيدروكسي بيبرازي إيثانسولفونيك (Hepes)< اسم = "نطاق! B29 ">Life Technologies< / a>15630-08025 مل (1 م) لكل 1 لتر من محلول الهضم
التربسين النوع الأولسيجما ألدريتشT80039،888 U
Deoxyribonuclease Type IVRoche10-104-159-001402،000 U
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC4901100 ملي
كبريتات المغنيسيومبيكر2500-01800 ملي
دولبيكو s النسر المعدل متوسط ارتفاع الجلوكوز (DMEM)تقنيات الحياة10564-045
البنسلين / الستربتومايسين كبريتاتهيكلونSV30010
مصل الأبقار الجنينيCorning 35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644تدرج وسائط الطرد المركزي الكثافة. الحجم: 36 مل
IsopropanolAcros42383-001050 مل
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش472301
فاصل مغناطيسي Automacs   ؛ميلتيني بيوتيكموديل 003
أوتوماكس  الأعمدة Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs Running Buffer Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Rinsing Solution Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
المضاد للإنسان Hla ABC استنساخ منقى W6 / 32Affymetrix eBioscience14-9983-82الأجسام المضادة للفأر
المضادة للفأر الميكروبيداتMiltenyi Biotec130048401
لوحة آبار متعددة -  6 جيد مع غطاءCorning3335خلية ربط السطح
لوحة بئر متعددة -  24 بئر مع غطاءCorning3337خلية ربط سطح
متعدد لوحة بئر -  96 بئر مع غطاءCorning3300خلية ربط سطح
وحدة حاضنة غرفة   ؛Billups-RothenbergMIC-101مجموعة من اثنين ضرورية لتوليد ظروف نورموكسيا ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجة في وقت واحد
مقياس التدفقBillups-RothenbergSFM3001
50 مم مرشح في الخطWhatman6721-5010PTFE ، المسام: 1.0 & م
منظم الغازبرو ستارPRS301233مجموعة من اثنين ضرورية لتوليد ظروف نورموكسيا ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجة
خرطوم الغاز من الفئة السادسة واضحة 5/16 & nbsp ؛Parker100-050701023 قطع مع ~ 0.5 م
17 مم قابل للتعديل خرطوم الغاز المشبكTiewrapsTHCSS-16
Normoxia اسطوانة الغاز   ؛PraxairNI CDOXR1U-Kحجم K (3rd< / sup> تكوين الثلث : 5٪ CO2< / sub> ، 8٪ O2< / sub> ، Bal. N2< / sub>)
اسطوانة غاز نورموكسيا   ؛PraxairNI CDOXR1U-Kالحجم K (3rd< / sup> تكوين الثلث : 5٪ CO2< / sub> ، 0.5٪ O2< / sub> ، Bal. N2< / sub>)
الأكسجين الكهربائي الدقيق Mi-730Microelectrodes INC84477
محول الأكسجينالأقطاب الكهربائية الدقيقة INC3572
كاشف الكشف عن ROS: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG ELISA kit DRG internatinalEIA-4115
الأجسام المضادة المنقاة المضادة للفيمنتينeBioscience14-9897المضيف: الفأر
المضاد للكيراتين 7 (FITC) الجسم المضاد  Abcamab119697المضيف: الماوس
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H& تقنيات الأجسام المضادةLA-11029
صحة زجاجات 10 مل مصفاة

المراجع

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Beta hCG
الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.