تقدم هذه المخطوطة نموذجا فريدا في المختبر لخلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية البشرية المنعقة المناعية المزروعة تحت نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. هذا النموذج مناسب لدراسة الآثار الوقائية للعلاجات الواعدة ، مثل الميلاتونين ، على مضاعفات الحمل المرتبطة بزيادة الإجهاد التأكسدي وتغير وظيفة المشيمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغبية من المشيمة على المدى الطويل عن طريق عمليات الهضم الأنزيمية المتتالية ، متبوعة بالطرد المركزي للكثافة وعزل التدرج في الوسائط والتنقية المغناطيسية المناعية. كما لوحظ في الجسم الحي ، تتمايز خلايا الأرومة الغاذية الخلوية أحادية النواة في الثقافة الأولية إلى خلايا الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى بعد 72 ساعة. بالمقارنة مع نورموكسيا (8٪ O2) ، فإن خلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية التي تخضع لنقص الأكسجة / إعادة الأكسجة (0.5٪ / 8٪ O2) تخضع لزيادة الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج الجوهري ، على غرار تلك التي لوحظت في الجسم الحي في مضاعفات الحمل مثل تسمم الحمل والولادة المبكرة وتقييد النمو داخل الرحم. في هذا السياق ، تمثل الأرومات الغاذية الزغابية الأولية المزروعة في ظروف نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة نظاما تجريبيا فريدا لفهم الآليات ومسارات الإشارات التي يتم تغييرها في المشيمة البشرية بشكل أفضل وتسهيل البحث عن أدوية فعالة تحمي من بعض اضطرابات الحمل. تنتج الأرومات الغاذية الزغبية البشرية الميلاتونين وتعبر عن إنزيماتها ومستقبلاتها التوليفية. تم اقتراح الميلاتونين كعلاج لمقدمات الارتعاج وتقييد النمو داخل الرحم بسبب آثاره الوقائية المضادة للأكسدة. في نموذج خلية الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية الأولية الموصوفة في هذه الورقة ، ليس للميلاتونين أي تأثير على خلايا الأرومة الغاذية في الحالة الطبيعية ولكنه يعيد توازن الأكسدة والاختزال لخلايا الأرومة الغاذية المخلوية التي تعطلت بسبب نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. وبالتالي ، فإن خلايا الأرومة الغاذية الزغابية البشرية في الثقافة الأولية هي طريقة ممتازة لدراسة الآليات الكامنة وراء التأثيرات الوقائية للميلاتونين على وظيفة المشيمة أثناء نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين.
المقدمة
طوال فترة الحمل البشري، وخلايا الأرومة الغاذية الخلوية المشيمة، وهي الخلايا الجذعية mononucleated، تتكاثر بسرعة وتفرق في أي خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي أو extravillous. أرومة غاذية خلوية Extravillous تغزو واعادة تشكيلها الشرايين دوامة من جدار الرحم. أرومة غاذية خلوية زغبي، من ناحية أخرى، لا تزال تتكاثر، والتفريق والصمامات لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى (ومخلى) 1. الحفاظ على التوازن الأرومة الغاذية زغابي أمر ضروري لعافية الجنين والحمل الصحي. في الواقع، أرومة مغذية زغبي تسمح الصرف الأم الجنين من الأكسجين والمواد المغذية، وتنتج الهرمونات الضرورية للحمل. وعلاوة على ذلك، والأرومة الغاذية المخلوية هو ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم الحصول على المشيمة مباشرة بعد الولادة المهبلية التلقائية من حالات الحمل غير معقدة في CHUM سانت لوك مستشفى، مونتريال، QC، كندا، مع موافقة المريض عن علم وموافقة لجان أخلاقية (CHUM سانت لوك مستشفى والنسبة المطبعة دوليا لمعهد أرمان-Frappier، لافال، QC، كندا).
1. عزل وتنقية خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي
- حلول ووسائل الإعلام
- إعداد وسائل الاعلام وسائل النقل من خلال استكمال Dulbecco لتعديل النسر متوسط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
العزلة وimmunopurification من خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي من المشيمة طبيعية المدى التي حصلت عليها الولادة المهبلية أسفرت 1 × 10 8 خلايا قابلة للحياة. وزن المشيمة 350 غرام، كانت 19 سم وقطرها 4 سم مع شكل القرصية والأغشية الشفافة. تم الكشف عن أي تشوهات فلقة. كان الحبل السري توطين مجاور للمركز ويبلغ طوله 56 سم. تم تقييم نقاء التدفق الخلوي باستخدام فيمنتين وcytokeratin-7 علامات. وكانت أكثر من 98٪ من الخلايا السلبية لفيمنتين وإيجابية لc.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الثدييات، تعتمد اعتمادا مباشرا على وظيفة المشيمة كافية نمو الجنين. وتستند أصول التنموية من الاضطرابات الصحية على فرضية أن سبب الأمراض يتجلى في وقت لاحق في الحياة يمكن ان ترجع الى التنمية في وقت مبكر وأن المشيمة دورا الآلية في البرمجة الجنينية 30-32. المشيمة هي الوسيط الرئيسي للنمو الجنين وتطوره: أنه ينظم نقل المواد الغذائية، ويحمي من التعرض الضارة، ولها وظائف الغدد الصماء الرئيسية. التطور الذي كليمان وآخرون من تقنية استنساخه لعزل أرومة غاذية خلوية أولية قابل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
بدعم من منح من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (رقم 262011-2009) إلى السيرة الذاتية ومنحة أبحاث العلوم الاجتماعية والسلوكية (# 12-FY12-179) إلى CV و JTS ؛ عن طريق المنح الدراسية إلى LSF من وزارة التعليم ، ومؤسسة البحوث في كيبيك (FRQ) - Nature et technologies (NT) ومؤسسة جامعة Armand-Frappier INRS ، إلى HC من Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE ، إلى AAHT من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) و FRQ-Santé ، وإلى JBP من NSERC ؛ من خلال زمالة EMAS من المجلس الوطني للدراسات العليا والتكنولوجيا (CNPq) وبرنامج التميز للدراسات المهنية MEESR-FRQNT.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص Metzenbaum المنحني | معدات جراحية Shandon | 9212 | (عزل الخلايا) (2 وحدة) ملقط |
| منشق Fine 41/2 في | Fisherbrand | 13-812-42 | المعدات الجراحية (عزل الخلايا) (2 وحدة) مقص |
| 4.5 Str تشريح | Fisherbrand | 08-940 | المعدات الجراحية (عزل الخلايا) (2 وحدة) |
| إسفنجة شاش 10 سم × 10 سم | الكاردينال | 361020733 | |
| طبق خبز زجاجي مستطيل | Pyrex | 1105397 | الأواني الزجاجية (2.8 لتر) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | الأواني الزجاجية (قطر 114 مم) |
| ساعة زجاج ؛ | بيركس | 9985100EMD | الأواني الزجاجية |
| محلول الفورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪ | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | محلول تثبيت الأنسجة |
| النسيجي قوارير التربسين | الأواني الزجاجية 355395 ويتون | (1 وحدة) | |
| أنابيب الثقافة التي يمكن التخلص منها | Kimble | 73750-13100 | الأواني الزجاجية |
| البورسليكات زجاج باستور PIPET (22.8 سم) | Fisherbrand | K63B1367820C | الأواني الزجاجية |
| 250 مل أكواب زجاجية | Fisherbrand | KFS14005250 | |
| زجاجية مع غطاء | Fisherbrand | KFS14395250 | الأواني الزجاجية (8 وحدات) |
| 50 مل Corex Tube ؛ | كورنينج | 8422-A | (1 وحدة) |
| 15 مل أنبوب طرد مركزي من البوليسترين | كورنينج | 430791 | |
| 50 مل أنبوب طرد مركزي من البوليسترين | كورنينج | 430829 | |
| خلوية 11415038 | ماصة مصلية | ||
| 100 مو ؛ م نايلون | كورنينج | 431752 | |
| ماصة بطانة | Scienceware | 1199918 | |
| 500 & nbsp ؛ مل زجاجات أعلى فلتر | كورنينج | المسام: 0.22 ؛ ومايكرو. م / متوسط و HBSS التحضير | |
| 2 مل قوارير كريوجينيك | كورنينج | 430488 | |
| حاوية تجميد ، نالجين السيد فروستي | سيجما ألدريتش | C1562-1EA | |
| مضخة تمعجية | صيدلانية الكيماويات الدقيقة | P3 نموذج | |
| اهتزاز حمام الماء | فيشر | موديل 127 | |
| مضخة فراغ | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشربراند | EC231-598-3 | محلول ملحي 0.9٪ |
| هانك محلول الملح المخزن (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | الكمية: 9.25 (قارورة واحدة) ل 1 لتر من محلول |
| الهضم حمض هيدروكسي بيبرازي إيثانسولفونيك (Hepes) | < اسم = "نطاق! B29 ">Life Technologies< / a> | 15630-080 | 25 مل (1 م) لكل 1 لتر من محلول الهضم |
| التربسين النوع الأول | سيجما ألدريتش | T8003 | 9،888 U |
| Deoxyribonuclease Type IV | Roche | 10-104-159-001 | 402،000 U |
| كلوريد الكالسيوم | سيجما ألدريتش | C4901 | 100 ملي |
| كبريتات المغنيسيوم | بيكر | 2500-01 | 800 ملي |
| دولبيكو s النسر المعدل متوسط ارتفاع الجلوكوز (DMEM) | تقنيات الحياة | 10564-045 | |
| البنسلين / الستربتومايسين كبريتات | هيكلون | SV30010 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Corning 35-010-CV | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | تدرج وسائط الطرد المركزي الكثافة. الحجم: 36 مل |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 مل |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | 472301 | |
| فاصل مغناطيسي Automacs ؛ | ميلتيني بيوتيك | موديل 003 | |
| أوتوماكس الأعمدة | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| المضاد للإنسان Hla ABC استنساخ منقى W6 / 32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | الأجسام المضادة للفأر |
| المضادة للفأر الميكروبيدات | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| لوحة آبار متعددة - 6 جيد مع غطاء | Corning | 3335 | خلية ربط السطح |
| لوحة بئر متعددة - 24 بئر مع غطاء | Corning | 3337 | خلية ربط سطح |
| متعدد لوحة بئر - 96 بئر مع غطاء | Corning | 3300 | خلية ربط سطح |
| وحدة حاضنة غرفة ؛ | Billups-Rothenberg | MIC-101 | مجموعة من اثنين ضرورية لتوليد ظروف نورموكسيا ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجة في وقت واحد |
| مقياس التدفق | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 مم مرشح في الخط | Whatman | 6721-5010 | PTFE ، المسام: 1.0 & م |
| منظم الغاز | برو ستار | PRS301233 | مجموعة من اثنين ضرورية لتوليد ظروف نورموكسيا ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجة |
| خرطوم الغاز من الفئة السادسة واضحة 5/16 & nbsp ؛ | Parker | 100-05070102 | 3 قطع مع ~ 0.5 م |
| 17 مم قابل للتعديل خرطوم الغاز المشبك | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia اسطوانة الغاز ؛ | Praxair | NI CDOXR1U-K | حجم K (3rd< / sup> تكوين الثلث : 5٪ CO2< / sub> ، 8٪ O2< / sub> ، Bal. N2< / sub>) |
| اسطوانة غاز نورموكسيا ؛ | Praxair | NI CDOXR1U-K | الحجم K (3rd< / sup> تكوين الثلث : 5٪ CO2< / sub> ، 0.5٪ O2< / sub> ، Bal. N2< / sub>) |
| الأكسجين الكهربائي الدقيق Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| محول الأكسجين | الأقطاب الكهربائية الدقيقة INC | 3572 | |
| كاشف الكشف عن ROS: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| الأجسام المضادة المنقاة المضادة للفيمنتين | eBioscience | 14-9897 | المضيف: الفأر |
| المضاد للكيراتين 7 (FITC) الجسم المضاد | Abcam | ab119697 | المضيف: الماوس |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H& تقنيات الأجسام المضادة | L | A-11029 |
المراجع
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Fac....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
