يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

30.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54244

⸱

يونيو 30, 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لزراعة الخلايا لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) المتمايز من البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية. يستخدم البروتوكول الحفظ بالتبريد للخلايا الوحيدة إلى جانب تمايزها السائب إلى الضامة. ثم يمكن بعد ذلك زرع البلاعم المحصودة في آبار الاستزراع بكثافات الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب.

الملخص

يتم تقديم بروتوكول لزراعة الخلايا لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) المتمايز من البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية. لبدء التجارب ، يتم استزراع الخلايا الوحيدة الطازجة أو المجمدة في قوارير لمدة أسبوع واحد باستخدام M-CSF للحث على تمايزها إلى ضامة. بعد ذلك ، يمكن حصاد البلاعم وبذرها في آبار الاستزراع بكثافات الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب. يؤدي استخدام أعداد محددة من البلاعم بدلا من الأعداد المحددة من الخلايا الوحيدة لبدء مزارع البلاعم للتجارب إلى مزارع البلاعم التي يمكن فيها تحقيق كثافة الخلايا المطلوبة بشكل أكثر اتساقا. يقلل استخدام الخلايا الوحيدة المحفوظة بالتبريد من الاعتماد على توافر المتبرعين وينتج مزارع بلاعم أكثر تجانسا.

المقدمة

دراسة البلاعم المستنبتة هي نموذج مفيد لفهم وظيفة هذه الخلايا في الالتهابات مثل ما يحدث في لويحات تصلب الشرايين. عندما يكون تركيز البحث على الأمراض البشرية التي تنطوي على البلاعم ، فمن المفيد دراسة البلاعم البشرية الأولية بدلا من البلاعم غير البشرية لتجنب الاختلافات في الأنواع. أيضا ، يمكن تجنب تأثيرات تحول الخلايا باستخدام البلاعم الأولية بدلا من خطوط خلايا البلاعم. لهذا الغرض ، تعمل البلاعم المتمايزة عن الخلايا الوحيدة المعزولة عن دم الإنسان كوسيلة للحصول على البلاعم البشرية الأولية.

قد تكون بلاعم الأنسجة إما موجودة داخل الأنسجة أو قد تكون مشتقة من الخلايا الوحيدة التي تهاجر إلى الأنسجة وتتمايز إلى البلاعم 1. تم تحديد نوعين من البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية التي تختلف ليس فقط في التشكل ولكن أيضا في التعبير الجيني ووظيفة الخلية 2. يتم الحصول على هذين النوعين من الخلايا الوحيدة التي يتم تمييزها إلى ضامة في وجود M-CSF + مصل بقري الجنين (FBS) والخلايا الوحيدة التي يتم تمييزها إلى ضامة في وجود عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم (GM-CSF) + FBS 2-6. في تجربتنا (ملاحظة غير منشورة) ، فإن استخدام المصل البشري بدلا من FBS يولد نوع GM-CSF بغض النظر عما إذا كان M-CSF أو GM-CSF مدرجا في وسط التمايز. تميل البلاعم من نوع M-CSF إلى أن تكون أكثر استطالة من البلاعم من النوع GM-CSF ، والتي تشبه البيض المقلي في مورفولوجيتها. يجب أن يدرك الباحثون أن البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية M-CSF و GM-CSF ليست هي نفسها ما يسمى بالبلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر M1 و M2 6.

أثناء البحث باستخدام البلاعم المتمايزة M-CSF المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية ، واجهنا صعوبة تتعلق بتوافر الخلايا الوحيدة لبدء التجارب والتباين في كثافة الخلايا التي تم الحصول عليها من الضامة أثناء تمايز الخلايا الوحيدة إلى ضامة. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتطوير البروتوكول التالي الذي يتم فيه تجميد الخلايا الوحيدة حتى الحاجة إلى استخدامها ، ويتم تمييز الخلايا الوحيدة بكميات كبيرة إلى ضامة يمكن إزالتها بعد ذلك من قوارير الثقافة وطلاءها بكثافات الخلايا المرغوبة للحصول على ثقافات أكثر اتساقا من تجربة إلى أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت فصادة الكريات البيض تحت بروتوكول البحث موضوع البشري الموافقة عليها من قبل المعاهد الوطنية للصحة المراجعة المؤسسية متنها.

1. عزل والحفظ بالتبريد من وحيدات

  1. الحصول على خلايا وحيدات النوى التي كتبها فصادة الكريات البيض من الجهات المانحة الإنسان، وإثراء حيدات التي كتبها المستمر لمكافحة تدفق الطرد المركزي تصويل من خلايا وحيدات النوى كما هو موضح في المراجع 7،8. الحصول على ما يقرب من 100 × 10 6 خلايا elutriated (حوالي 80 - 90٪ وحيدات) في المخزن تصويل المحدد من قبل الشركة المصنعة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  2. حيدات أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل البولي بروبلين في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة طاف وبلطف resuspend الخلايا في FBS تليها سلفوكسيد ثنائي ميثيل لتحقيق تركيز النهائي من 90٪ FBS / 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 50 × 10 6 خلية / مل.
  4. إضافة كل مل من تعليق خلية تيس لcryovial الفردية.
  5. وضع cryovials في زنزانة تجميد الحاويات ونقل إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة 24 ساعة قبل نقل إلى النيتروجين السائل خزان cryovial للتخزين على المدى الطويل.

2. تمايز الخلايا وحيدة النواة في الضامة

  1. ذوبان الجليد في cryovial من الخلايا عن طريق نقل بسرعة إلى 37 درجة مئوية حمام الماء ثم إزالة فورا عند تعليق الخلية قد تحسنت حوالي 70٪.
  2. فور الذوبان الكامل في درجة حرارة الغرفة، ونقل 1 مل محتويات cryovial إلى 50 مل من 37 درجة مئوية درجة حرارة المعهد التذكاري روزويل بارك (RPMI) 1640 متوسطة مع 2 مم L-الجلوتامين، 50 نانوغرام / مل M-CSF، 25 نانوغرام / مل انترلوكين 10 (IL-10)، و 10٪ FBS (المتوسط ​​الشامل).
  3. نقل 25 مل من تعليق الوحيدات في كل من اثنين من 75 سم 2 قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية.
  4. احتضان الثقافات في 37 درجة خلية C الثقافة الحاضنة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية لمدة 48 ساعة.
  5. شطف مكعبltures 3 مرات مع 10 مل RPMI 1640 المتوسطة (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، وإزالة بلطف مستنبت لتجنب طرد أي خلايا فضفاضة يعلق.
  6. بعد الشطف، إضافة المتوسطة كاملة جديدة، وتغيير المتوسط ​​كل يوم 2 حتى تفرق حيدات وتتكاثر بما فيه الكفاية لتصبح متموجة. وهذا يتطلب حوالي أسبوع واحد من الثقافة.

3. حصاد الضامة لبدء التجارب

  1. شطف الضامة متباينة في قارورة 3 مرات مع 10 مل قبل تحسنت مخزنة المالحة الفوسفات 37 ° C Dulbecco وبدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ قبل إضافة 10 مل 37 ° C 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل قبل تحسنت.
  2. مكان قارورة في حاضنة الثقافة خلية ل10-15 دقيقة في الوقت الذي ما يقرب من 90٪ من الضامة يجب أن يكون مقربا ومنفصلة. التحقق من ذلك عن طريق الفحص المجهري للقارورة.
  3. إضافة 10 مل من RMPI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS إلى sكبار trypsinization.
  4. نقل تعليق خلية بلعم من القارورة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل، الطرد المركزي 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف.
  5. resuspend بلطف الضامة في 1 مل من المتوسط ​​الشامل.
  6. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم مع 10 ميكرولتر حل التريبان الأزرق وتحديد عدد الخلايا البلاعم وقدرتها على البقاء (عادة> 95٪) باستخدام عدادة الكريات.
  7. واستنادا إلى عدد خلايا (عادة حوالي 15 - 18 × 10 5 الضامة)، إضافة المتوسطة كاملة إضافية لتحقيق كثافة الخلية البذر المطلوب. ملاحظة: 1 × 10 5 الضامة في 1.5 مل المتوسطة لكل بئر من لوحة ال 12 أيضا سوف تنتج ثقافة شبه متموجة.
  8. بعد غرس البذور، واحتضان الضامة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة الخلية مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية للسماح مرفق الخلية. ثم، تبدأ التجارب المرجوة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كانت قابلية حيدات الطازجة أو cryopreserved أكبر من 95٪ كما هو محدد مع التريبان الأزرق تلطيخ 9 الشكل 1 والشكل 2 مقارنة في تكبير الدنيا والعليا، على التوالي، تقدم الطازجة وcryopreserved (أي المجمدة) الوحيدات التمايز في الضامة. لاحظ أن طازجة مقارنة مع تظهر حيدات cryopreserved جزء من السكان من التمييز وحيدات التي لا تنتشر ولكن تبقى مدورة. تحدث فجوات مرحلة لوسنت في الضامة الوحيدات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن توليد أنواع بلعم يعرف توضيح بعض نتائج متضاربة التي حصل عليها المحققون عند دراسة علم الأحياء البلاعم. استخدام الظروف ثقافة مختلفة وعوامل التمايز لتوليد الضامة الإنسان الأساسية يمكن أن يؤدي إلى أنواع بلعم مختلفة جدا، وهذه حقيقة قد لا يكون موضع تقدير من قبل الباحث. على سبيل المثال، الضامة تتولد في بعض الأحيان من وحيدات الإنسان استخدام أي مصل، مصل الإنسان وحده، المصل البشري تستكمل مع M-CSF، FBS وحده، أو FBS تحتوي M-CSF أو GM-CSF. كما ذكرت سابقا، وكما لاحظنا أيضا، مثقف وحيدات لمدة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

قدم قسم طب نقل الدم ، المركز السريري ، المعاهد الوطنية للصحة ، الخلايا الوحيدة المخففة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم ، والمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة ثقافة Cellbind 12 بئرCorning3336
CELLSTAR ، قارورة T-75 ، زراعة الأنسجة المعالجةGreiner Bio-One أمريكا الشمالية658157
RPMI 1640 وسط ثقافةCellgro Mediatech15-040-CMدافئة إلى 37 درجة ؛ C
L-GlutamineCellgro Mediatech25-005-CI
مصل بقري الجنينGibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 & nbsp;PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Cryovial ثرمو علمية 375418
DPBS بدون Ca2+ و Mg2+ Corning cellgro21-031-CV
0.25٪ Trypsin-EDTA Gibco25200-056
50 مل أنبوب مخروطي بولي بروبلينFalcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
مقياس كثافة الدم بالضوء الساطع المحسن من NeubauerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
تجميد خلايا CoolCell LX يجب أيضا أنحاويات التجميدBioCisionBCS-405
نظام تخزين النيتروجين السائل ، CryoPlus 1Thermo Scientific   ؛7400يجب أن يكون أي خزان نيتروجين سائل كافيا
تكون الأخرى كافية لهذه الخطوة

المراجع

  1. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
  2. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  3. Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
  4. Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
  5. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
  6. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
  7. Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
  8. Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
  9. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  10. Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
  12. Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
  13. Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
  14. Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
  15. Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
  16. Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  17. Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
  18. Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
  19. Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
  20. Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
  21. Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
  22. Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

M CSF RPMI 1640
ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.