الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

الاصطناعي الدهون غشاء طبقة ثنائية، أو أسود الدهون غشاء (بلم)، هو أداة هامة لتوضيح آليات أغشية الخلايا والقنوات الأيونية، وكذلك لفهم التفاعلات بين القنوات الأيونية وأيونات / جزيئات ^1-7 على الرغم من أن طريقة التصحيح، المشبك وغالبا ما تعتبر المعيار الذهبي للدراسات غشاء الخلية، فمن شاقة وتتطلب مشغلي درجة عالية من المهارة لقياس القناة الايونية. ⁸ بينما ظهرت تشكيلها بشكل مصطنع الأغشية الدهنية طبقة ثنائية كأدوات بديلة للدراسات القناة الايونية، ^9،10 أنها ترتبط أيضا مع شاقة عمليات وخبرات محددة. وعلاوة على ذلك، الأغشية عرضة للاضطرابات الميكانيكية. التطبيقات العملية وبالتالي، تقنيات طبقة ثنائية الدهون وعرض لتاريخ محدودة. ¹¹

من أجل تعزيز متانة وطول العمر من الأغشية الدهنية طبقة ثنائية، كوستيلو وآخرون. ^12، وإيد وياناغيدا وآخرون. ¹⁴ ضعت غشاء مغلف هيدروجيل (HEM) مع الحميم هيدروجيل الدهون طبقة ثنائية الاتصال، مما أدى إلى تعزيز طول العمر (تصل إلى عدة أيام). لزيادة عمر HEM، Malmstadt وجيون وآخرون خلق غشاء مغلف هيدروجيل مع هيدروجيل بالدهون ملزمة عبر في الموقع التساهمية الاقتران (cgHEM). ¹⁵ وفي كلا النظامين، وزيادة عمر غشاء كبير (> 10 يوما) . ومع ذلك، فإن أنظمة تشكيل غشاء يست قوية بما فيه الكفاية، وأنه لا يمكن تخزينها أو تسليمها عند الحاجة لتحرير الخبرة لاستخدام طبقات ثنائية الدهون.

وقد تمحور تطوير منصة الدهون طبقة ثنائية في المقام الأول حول زيادة متانة وطول العمر من BLMs. وبالرغم من أن طول عمر BLMs سوتعزيز bstantially مؤخرا، وقد اقتصرت طلباتهم بسبب عدم وجود قابلية النقل والقدرة التخزينية. للتغلب على هذه القضايا، جون وآخرون خلق نظام الغشاء القابل للتخزين وعرض السلائف غشاء (MP). ¹⁶ لبناء النائبة، وإعداد خليط من ديكان N- وسداسي تحتوي على 3٪ DPhPC (1،2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) للتحكم في درجة التجمد من الحل الدهون بحيث أنها ستجمد في ~ 14 درجة مئوية (تحت درجة حرارة الغرفة، وفوق درجة حرارة الثلاجة العادية). في هذه التجربة، تم نشر النائب خلال فتحة صغيرة على (PTFE) فيلم تترافلوروإيثيلين وجمدت في وقت لاحق في الثلاجة على 4 درجات مئوية. عندما أحضر النائب إلى درجة حرارة الغرفة، وإذابة النائب وتشكلت تلقائيا طبقة ثنائية المادة الدهنية، والقضاء على الخبرات التي ترتبط عادة مع تشكيل غشاء. ومع ذلك، كان معدل نجاح بلم مصنوعة من النائب منخفضة تصل إلى ~ 27٪، والتشكل الغشاءن الوقت كان يتعارض (30 دقيقة إلى 24 ساعة)، يحد من تطبيقاتها العملية.

في هذه الدراسة، تم استخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) رقيقة بدلا من التقليدية لأغشية رقيقة مسعور (PTFE، polyoxymethylene، البوليسترين) إلى (أ) قياس الزمن تلفيق و (ب) زيادة معدل نجاح تشكيل بلم كما ذكرت سابقا من قبل ريو وآخرون. ¹⁷ وهنا، وقد سهلت تشكيل غشاء عن طريق استخراج المذيبات نظرا لطبيعة المسامية من PDMS، والوقت اللازم لتشكيل غشاء تمت السيطرة بنجاح في هذه الدراسة. في هذا النظام، كما استوعبت حل الدهون في الفيلم PDMS رقيقة، تم التوصل إلى ثابت وقت تشكيل غشاء. وعلاوة على ذلك، كان لفترة طويلة العمر الغشاء بسبب امتصاص بطيء من المذيبات في PDMS رقيقة، نتيجة لإضافة السكوالين إلى حل الدهون. أجرينا القياسات البصرية والكهربائية للتحقق من أن الأغشية شكلت باستخدام هذه التقنية هي مناسبة لطعلى دراسات القنوات.

1. الحل تحضير

1. إعداد حل العازلة:
   1. لصياغة حل العازلة، حل 1 م بوكل (كلوريد البوتاسيوم)، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (تريس، هيدروكلوريد)، و 1 ملي EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) في الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
   2. تصفية الحل باستخدام فلتر 0.20 ميكرون. لتعقيم، الأوتوكلاف الحل في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. إعداد الحل الدهون لمرحلة ما قبل اللوحة:
   1. لصياغة حل الدهون لمرحلة ما قبل اللوحة، حل 3٪ DPhPC (1،2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) الدهون (ث: ت) في خليط من 2: 8 ن -decane وسداسي (ت: الخامس). يقلب بين عشية وضحاها باستخدام المدورة.
3. إعداد الحل الدهون لتشكيل غشاء:
   1. لصياغة حل الدهون لتشكيل غشاء، ويحل 0.1٪ DPhPC (1، 2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) الدهون (ث: ت) في خليط من 2: 8 متر مربعualene وسداسي (ت: ت). يقلب بين عشية وضحاها باستخدام المدورة.

2. تشكيل لPDMS رقيقة

1. مزيج PDMS وكيل علاج في 9: نسبة 1 (ث / ث) في كوب الخلط لتشكيل prepolymer PDMS. إضافة 5 غرام من PDMS prepolymer إلى طبق بيتري لتشكيل PDMS رقيقة (سمك 200-250 ميكرون). نشر PDMS قبل البوليمر باستخدام المغطي تدور في 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية لتشكيل طبقة رقيقة.
2. وضع طبق بتري في مجفف فراغ عند ضغط 100 mTorr لمدة 2 ساعة لإزالة فقاعات الهواء. لبلمرة طبقة رقيقة قبل البوليمر، يخبز في الفرن لمدة 5 ساعة عند 70 درجة مئوية.
3. من أجل جعل PDMS مربع رقيقة، وقطع PDMS بلمرة رقيقة إلى 2 × 2 سم ² الساحات. استخدام لكمة الدقيقة 500 ميكرون لجعل فتحة في وسط PDMS رقيقة. فتحات قبل الطلاء مع 3٪ حل DPhPC الدهون مختلطة في 2: 8 ديكان N- وسداسي.

3. غرفة تصنيع وAsse وmbly

1. لافتعال غرفة بلم، تصميم مبنيين متماثل من الغرفة باستخدام 3D برامج الرسم مع الأبعاد الخارجية من 4 سم × 1.5 سم × 1 سم وأبعاد داخلية جيدا من 1.5 سم × 1.3 سم × 0.8 سم ^17.
2. صياغة الغرفة باستخدام كتلة PTFE مع آلة التصنيع باستخدام الحاسب الآلي واتبع تعليمات الشركة الصانعة.

4. الجمعية الغرفة

1. لتجميع الغرفة، وضع الفيلم رسمت قبل-PDMS رقيقة بين الكتل PTFE اثنين بحيث الفتحة على PDMS رقيقة يتواءم مع ثقب في الغرفة.
2. ختم الحواف الخارجية للغرفة باستخدام غطاء زجاجي مع الشحوم (تسهيل المراقبة البصرية). شل غرفة تجميعها باستخدام الصواميل والمسامير.
   ملاحظة: تأكد من أن الغرفة بشكل جيد مختومة حتى لا يكون هناك أي تسرب السائل.

5. تشكيل غشاء السلائف مع تشكيل التجميع الذاتي المعجل (MPES)

1. باستخدام ماصة، إيداع 0.5ميكرولتر من 0.1٪ DPhPC الدهون مختلطة في 2: 8 ن -decane: سداسي على الفتحة من PDMS رقيقة تجميعها مع الغرفة.
2. قبل استخدام وتخزين غرفة في الفريزر أو الثلاجة أقل من 10 درجة مئوية.

6. تشكيل غشاء والتأكيد

1. لتشكيل بلم مع MPES، سحب غرفة من الثلاجة وتعليق 2 مل من محلول منظم في كل جانب من الغرفة. تعيين غرفة جانبا ل<10 دقيقة حتى يذوب الغشاء السلائف المجمدة.
2. مكان الغرفة في الصعود إلى micromanipulator إلى التحكم بدقة في الارتفاع مع الاحترام لمصدر الضوء والمجهر. تسليط الضوء على جانب واحد من غرفة كمصدر ضوء استخدام الهالوجين الألياف البصرية إضاءة لسطع الفتحة من PDMS رقيقة للمراقبة البصرية من عملية تشكيل بلم.
3. على الجانب الآخر، ووضع المجهر الرقمي عموديا فيما يتعلق مصدر الضوء لمراقبة تشكيل بلم (تكبير بنسبة 200X).
4. لتأكيد تشكيل بلم، ومراقبة مركز الفتحة حيث يصبح اللون أكثر إشراقا من بالطوق.

7. تسجيل الكهربائية

1. القياسات الكهربائية، وإعداد الأقطاب حج / الكلور باستخدام سلك الفضة 208 ميكرون سميكة والتبييض في هيبوكلوريت الصوديوم ل> 1 دقيقة. وضع الأقطاب حج / الكلورين في كل جانب من الغرفة عميقة بما يكفي لتكون مغموسة في حل العازلة.
2. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت مسرى مكروي. باستخدام برنامج الكهربية، وتطبيق ± 10 فولت الموجي الثلاثي عبر الغشاء في الحصول على موجة مربعة. تعيين تطبيق التيار الكهربائي من خلال النقر على الأسهم المشار إليها في V_clamp (بالسيارات).
3. تسجيل الخواص الكهربائية للغشاء عن طريق النقر على زر التسجيل (النقطة الحمراء رمز). الشروع في تسجيل حتى لوحظ موجة مربع موحدة. إنهاء التسجيل عن طريق النقر على أيقونة مربع أسود.

8. ايون قناة التأسيس

ليسيحدث الجراميسيدين ألف (GA) دمج عفويا على تشكيل بلم، كما يضاف GA مباشرة إلى الحل الدهون: E.

1. لمراقبة أنشطة قناة GA، تطبيق 100 بالسيارات عبر الغشاء بمعدل عينة من 5 كيلو هرتز لقياس عقد إمكانات الغشاء. تعيين تطبيق التيار الكهربائي من خلال النقر على الأسهم المشار إليها في V_clamp (بالسيارات).
2. تسجيل الخواص الكهربائية للدمج GA عن طريق النقر على زر التسجيل (النقطة الحمراء رمز). المضي قدما في تسجيل حتى يلاحظ القفزات الحالية. إنهاء التسجيل عن طريق النقر على أيقونة مربع أسود.
3. بعد الحصول على البيانات الكهربائية وتصفية البيانات مع انخفاض تمرير مرشح بسل في 100 هرتز باستخدام برنامج الكهربية.
4. مراقبة يقفز الحالية في عقد البيانات المحتملة التي تمت تصفيتها (كل قفزة الحالي، ~ 0.15 م، يمثل dimerization من قناة أيون GA) للتحقق GA التأسيس.

تعظيم الاستفادة من MPES الحل التركيب
تم اختبار تركيبات مختلفة من الدهون والمذيبات لإعادة بنجاح الأغشية الدهنية طبقة ثنائية من MPES. النظام النائب بمزيج من ديكان N- وسداسي تحتوي على 3٪ DPhPC 14 عرضت نسبة نجاح منخفضة من تشكيل غشاء (~ 27٪). وبالإضافة إلى ذلك، كما في الفيلم PDMS استخراج باستمرار حل الدهون، كان من الضروري لتحسين تكوين مذيب للحفاظ على غشاء الدهون طبقة ثنائية سليمة. زاد بالتالي، السكوالين، التي لديها اللزوجة 12 CP عند 20 درجة مئوية 18 كان يستخدم بدلا من ديكان N-، الذي لديه زوجة 0.92 CP عند 20 درجة مئوية. 19 عندما كان يستخدم السكوالين، على حد سواء الاستقرار وطول العمر نظرا ل تقلص معدل امتصاص المذيبات التي كتبها PDMS. ويقارن الجدول 1 الوقت رقيق خارج، والعمر، ومعدل نجاح الأغشية مع التراكيب المذيبات المختلفة.

عندما استخدمت ديكان N-، وتشكيل غشاء يتعارض والأغشية كثيرا تمزق في غضون فترة قصيرة من الزمن، نظرا لامتصاص السريع من المذيبات التي كتبها PDMS الأغشية الرقيقة. من ناحية أخرى، عندما كان يستخدم السكوالين، تأخر الوقت لتمزق الغشاء. وبالإضافة إلى ذلك، أصبح الوقت تشكيل غشاء أكثر اتساقا، ومعدل نجاح تشكيل غشاء المحسنة، وطول العمر من الأغشية زاد.

تشكيل غشاء من أغشية السلائف (MP)
النائب هو الشكل المجمدة من حل الدهون التي تصبح جاهزة للاستعمال على ذوبان في درجة حرارة الغرفة. الحل الدهون التي تحتوي على خليط من ديكان N- وسداسي في فتحة صغيرة في PDMS رقيقة يتجمد دون 16 درجة مئوية، وغير القابل للتخزين إلى أجل غير مسمى ونقلها في شكل المجمدة الشكل 1 يوضح التجمع من PDMS رقيقة مع PTFE تشاmber لإنتاج النائب. قبل الاستخدام، تم سحب غرفة PTFE من الثلاجة لتشكيل غشاء. هنا، تم وضع PDMS رقيقة تحتوي على حل الدهون المجمدة بين نصفين غرف PTFE. عندما أضيف حل العازلة في وقت لاحق إلى جانبي الغرفة في درجة حرارة الغرفة، وغشاء الدهون طبقة ثنائية تشكلت عفويا على ذوبان مقدمة الغشاء المجمدة (MP).

على ذوبان الجليد، ضعفت الحل الدهون خارج كما هو موضح في الشكل (2). وعندما إذابة غشاء السلائف المجمدة، تم جلب اثنين من الطبقات الوحيدة على طول واجهات بين العازلة وحل الدهون في اتصال 20 بعد تشكيل غشاء، أحادية GA التي كانت قبل مختلطة في الدهن أظهر حل أنشطة القناة.

الملاحظة البصرية لأغشية
من أجل التحقق بصريا تشكيل غشاء، ونحنتستخدم الضوء المرسل إلى تصور الغشاء. على تشكيل غشاء، ويبدو الغشاء أكثر إشراقا من المناطق المحيطة بها بسبب عملية ترقق بها، وكان مركز الفتحة (موقع تشكيل غشاء) أكثر إشراقا من بالطوق. ويبين الشكل 3 تشكيل غشاء لوحظ من خلال المجهر الرقمي. غشاء ضعيفة خارج بنجاح على الذوبان.

القياس الكهربائي من الدهون طبقة ثنائية
قمنا بقياس التيارات الكهربائية عبر الغشاء باستخدام مكبر للصوت لحساب سماكة الغشاء. وغمرت المياه الأقطاب حج / أجكل في مجلسي القياسات الكهربائية. عندما تم تطبيق 10 بالسيارات موجة مثلث الذروة إلى الذروة عبر الغشاء، تم تحويل موجة المثلث لموجة مربع من التيار بسبب سمة من الغشاء الدهني طبقة ثنائية (بوصفها مكثف). 21 ونتيجة لذلك، كنا قادرة على تقدير سمك الغشاء باستخدام المعادلة التالية:

حيث يمثل الأول (ر) التيار الكهربائي وC يمثل السعة عبر الغشاء. يمثل الخامس التطبيقية الجهد الذروة إلى الذروة (20 فولت لل0.0625 ثانية). هنا، C يمكن التعبير مع والسماحية من المساحة الحرة (8.85 × 10 12 F / م 2)، وثابت العزل الكهربائي من الدهون (2.1)، و 22 ألف، ومنطقة للغشاء (~ 1.29 × 10 -7 م 2)، ود، سمك طبقة ثنائية. مع البيانات البصرية في الشكل (3) والبيانات الكهربائية، حسبنا سمك الغشاء أن يكون ~ 4 نانومتر. وبالإضافة إلى ذلك، استوفت غشاء تشكيلها على مستوى ختم جيجا أوم (> 1 GΩ)، والتي عادة ما المطلوب لدراسات قناة أيون 23

> ايون أنشطة القناة من الجراميسيدين ألف (GA)
للتحقق من جدوى فحص القناة الايونية مع طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تشكلت من النائب، نحن تأسست الجمعية العامة، واحدة من القنوات الأيونية الأكثر استخداما للتحقق من تكوين غشاء. الجراميسيدين ويدمج في غشاء عن اثنين من وحدات فرعية متميزة dimerize في وقت لاحق. 7 ايون قنوات شكل على dimerization من GA، وأيونات تتخلل من خلال القناة الايونية GA الشكل 4 يوضح التأسيس وdimerization من الجمعية العامة. على GA dimerization، كانت GA قناة المستويات تصرف 28 PS، بما يتفق مع نتائج التقارير السابقة. 3

الجدول 1. الأمثل من MPES تكوين الحل. علقت 0.5 ميكرولتر من محلول الدهون في الصعود إلى PDMS فتحة غشاء رقيق (500 ميكرون قطر). هنا، نحن اختلفت تركيز الدهون، وتكوين المذيبات، وقبل اللوحة. 17. مقتبس بإذن من ريو، H. وآخرون. 7

وكان الرقم 1. رسم تخطيطي من نظام تشكيل غشاء البعد الخارجي من كل شطر من غرفة 4 سم × 1.5 سم × 1 سم، وكان حجم البئر الداخلي 1.5 سم × 1.3 سم × 0.8 سم. كان جيدا الداخلي كبير بما يكفي لاستيعاب 2 مل من محلول العازلة. على كل كتلة PTFE هناك ثقوب أن يكون PDMS رقيقة الاتصال الفيلم مع حل العازلة. وتم التوصل الى الجانب الآخر مع غطاء زجاجي للمراقبة البصرية من بلم. وأخيرا، تم تعزيز الكتل غرفة مع البراغي والصواميل لتجنب تسرب السائل.4258 / 54258fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. رسم تخطيطي من المجمدة غشاء السلائف مع المعجل الذاتي التجمع (MPES) تشكيل. حل الدهن على PDMS الأغشية الرقيقة فتحة يمكن تجميدها لفترة غير محددة. عندما أحضر مقدمة الغشاء المجمدة في درجة حرارة الغرفة لذوبان الجليد، مما يسهل تشكيل طبقة ثنائية الدهون نتيجة لإستخراج مذيب مسعور في PDMS رقيقة. كما تم إضافة أحادية GA مباشرة في حل الدهون، GA القنوات الأيونية تشكلت مباشرة بعد تشكيل غشاء. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "/ ملفات / ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg" />
الشكل 3. مخطط المجهري للعملية ترقق الخروج، وعند ذوبان MPES وامتصاص لاحقة من المذيبات مسعور، وتسهيل عملية ترقق الخروج على الفتحة من PDMS رقيقة، وتشكلت الغشاء في غضون دقيقتين بعد ذوبان الجليد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. القياسات الكهربائية عند التأسيس من الجراميسيدين A. الحالي يقفز على يظهر التأسيس وdimerization من GA في غشاء. وقد لوحظ اتساع ~ 28 PS على dimerization من أحادية GA (100 بالسيارات عقد المحتملة؛ 100 هرتز بسل المنخفضة تمرير فلتر).r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.