قمنا بجمع الخلايا وتلطيخها وتصويرها من ملتحمة هامش الجفن الداخلي للبشر. من خلال توصيف مورفولوجيا الخلية ونشاط التمثيل الغذائي ، قد تعزز هذه الطريقة فهمنا لجفاف العين والدور الذي قد يلعبه الاحتكاك بين أسطح العين في إدراك الانزعاج العيني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوجد عدد قليل من التقارير حول التشريح الخلوي لمنطقة ممسحة الجفن (LW) في الجفن الداخلي وتقرير واحد فقط يستخدم الأساليب الخلوية. تم وصف تحسين طريقة جمع الخلايا وتلطيخها وتصويرها من منطقة LW باستخدام علم خلايا الانطباع (IC) في هذه الدراسة. يتم جمع الخلايا من السطح الداخلي للجفن العلوي للبشر باستخدام أغشية بولي تترافلورو إيثيلين محبة للماء (PTFE) ، وتلطيخها بالأصباغ الخلوية للكشف عن وجود خلايا الكأس والميوسين ونواة الخلايا ودرجات مختلفة من التقرن المسبق وشبه القرني. تظهر الأصباغ الكيميائية المناعية نشاط إسترازاز الخلايا وأغشية الخلايا المعرضة للخطر باستخدام مجهر ليزر المسح الضوئي متحد البؤر. يتم التقاط ما يصل إلى 100 صورة رقمية مجهرية لكل عينة وخياطتها في صورة عالية الدقة وواسعة النطاق لامتداد IC بأكمله. نظهر حساسية أعلى ل IC مما تم الإبلاغ عنه من قبل ، وهو مناسب لتحديد الأشكال الخلوية والنشاط الأيضي في منطقة LW. على حد علمنا ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام هذا الاختيار من الأصباغ الفلورية لتصوير أغشية LW IC. سيكون هذا البروتوكول فعالا في الدراسات المستقبلية للكشف عن تفاصيل غير موثقة لمنطقة LW ، مثل تقييم الخصائص الخلوية لمرتدي العدسات اللاصقة أو المرضى الذين يعانون من جفاف العين أو اعتلال ظهارة ممسحة الجفن.
المقدمة
الجفن العلوي البشري ينفذ حوالي 10،000 يومض كل يوم 1، مع مجرد 1 - المنطقة الملتحمة 2 مم الضيقة معارضة العالم العين. بسبب حركة المسح له خلال طرفة، وقد أطلق على هذا الجزء من هامش غطاء "غطاء ممسحة" المنطقة 2. ومن المفترض أن يتم زيادة الاحتكاك في هذه المنطقة خلال الوميض المعتاد، وذلك بسبب الغطاء محو أنحاء العالم. هذا قد لعب دورا هاما في راحة العين. يضعون العدسات اللاصقة في تجربة معينة عدم الراحة في العين وهذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لوقف عدسة ارتداء 3. عندما يتم وضع العدسات اللاصقة على العين، وقد تبين أن معامل الاحتكاك بين المواد العدسة وسطح العين لتغيير 4. هناك أدلة تشير إلى أن أعراض جفاف يمكن أن تكون ذات صلة في هذا الاحتكاك تغير 2،5،6.
هذا الارتباط يمكن أيضا أن تنعكس في الظواهر الملحوظة سريريا، ولا سيما واي غطاءفي epitheliopathy (LWE)، وتسمى أيضا الجفن العلوي هامش تلطيخ (ULMS) 6. LWE هو علامة مبكرة من تهيج العين ومؤشرا محتملا لمرض العين الجافة. لوحظ ويقاس تلطيخ حيوي من المناطق حافة الجفن العلوي والسفلي. في حين أن هذا نظام الدرجات 2 و صحة السريرية (أي، والارتباط مع أعراض ذاتية) لا تزال قيد المناقشة، لا يزال عدم الراحة في العين معضلة بالنسبة للأطباء والعلماء على حد سواء، والأهم، مصدر إزعاج للمرضى.
حتى تاريخه، لا يعرف إلا القليل عن الاختلافات سريريا ذات الصلة في (شبه) التشريح الخلوي وعلم وظائف الأعضاء من منطقة ممسحة غطاء 7 وتقرير واحد فقط يجعل من استخدام أساليب الخلوي 8. وقد استخدمت الانطباع علم الخلايا (IC) لأكثر من 40 عاما لجمع الخلايا من سطح الظهارية من الصلبية أو الملتحمة الجفنية من خلال تطبيق غشاء 9،10. عند إزالتها، فإن الخلايا الملتصقة تخضع جتلطيخ ytological والتصوير المجهري. نظرا للاختلافات التشريحية والخلوية في المنطقة ممسحة غطاء، وهذا الأسلوب يتطلب الأمثل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الأخلاق بيان: قبل جمع الخلايا من المواد البشرية، عن علم ويجب الحصول على موافقة الأخلاق.
1. إعداد وصمة عار
ملاحظة: تعد وصمة عار في يوم من التجربة.
- إضافة 5 ميكرولتر إيثيديوم (أو 4 ميكرومتر) و 5 ميكرولتر Calcein AM (أو 4 ميكرومتر) إلى 2.5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 15 مل أنبوب الطرد المركزي. مزج. التفاف في رقائق الألومنيوم لحمايتها من ضوء وتخزينها في RT حتى الاستخدام.
2. خلايا اجمع
- إزالة إدراج ثقافة خلية من حزمة وتسمية كل جفن لأخذ عينات. التوجه علامة جمع الخلية على جانب صاحب غشاء البلاستيك باستخدام علامة دائمة. شق سلوك التفتيش مصباح في تضخم معتدل (حوالي 20X) لتأكيد الصحية المناسبة للمنطقة للخضوع IC.
- الاستغناء عن قطرة واحدة من مخدر موضعي (0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد) في كيس الملتحمة السفلي من عصامالفصل العين وإرشاد المشاركين للحفاظ على عيون مغلقة لمدة دقيقة واحدة.
- إيفرت الجفن العلوي وعقد في مكان من قبل جلدة. تجنب أي اتصال مع منطقة غطاء ممسحة.
قد تكون هناك حاجة لمساعدات محقق الثانوية لتنفيذ هذه الخطوة: اختياري. - تطبيق غشاء عموديا على الجزء الأوسط من المنطقة ممسحة غطاء مع الحد الأدنى من الضغط.
- عقد الغشاء في مكان 3-5 ثانية. مراقبة غشاء تصبح شفافة في مجال الاتصال. في هذه المرحلة، وإزالة بلطف الغشاء وتسمح غطاء المشارك في "الوجه" العودة الى المكان.
- تطبيق فورا قطرة واحدة من برنامج تلفزيوني للعينة، لمنعها من الجفاف. والغشاء تتحول شفافة ويجب أن لا تتحول مبهمة في أي وقت، وهذا يدل على التجفيف. هل لديك المحقق الثانوي الشروع فورا في تجهيز العينات (القسم 3).
- إجراء فحص العين النهائي لضمان سلامة الملتحمة. الاستغناء عن مواد التشحيم العين وإرشاد المشاركينلتجنب فرك عيونهم حتى ترتدي تأثير المخدر قبالة (حوالي 15 دقيقة).
تجهيز 3. عينة
- باستخدام المقص الصغير، وقطع الغشاء في نصف (نصف واحد لكل من التحليلات المصب)، عمودي عن طريق الوسط من جمع الخلية. قطع على طول الحافة الخارجية من نصف غشاء لفصلها عن صاحب البلاستيك؛ تجنب التفاعل مع الخلايا التي تم جمعها على الغشاء، بما في ذلك ضمان أن الغشاء لا أضعاف على نفسها.
- تأمين غشاء باستخدام الملقط قبل فصل تماما من حامل. مكان الغشاء إلى المسمى أنبوب الطرد المركزي 2 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من 95٪ (ت / ت) الإيثانول وتترك لإصلاح مدة لا تقل عن 20 دقيقة إلى حد أقصى قدره 2 ساعة قبل معالجة (القسم 4.2).
- الشوط الثاني مستقل على الفور من غشاء (كما هو موضح في القسم 3.2)، والشروع فورا مع القسم 4.1.
تلطيخ 4. عينة
- Immunocytochemiكال تلطيخ
- وضع بعناية غشاء في 35 ملم الزجاج طبق ثقافة القاع مع الجانب جمع لأسفل. ضمان غشاء مسطح.
- ماصة 20 ميكرولتر من تكوين وصمة عار immunocytochemical تجميعها في القسم 1 إلى الغشاء. إذا عينة تجعيد الشعر يصل، وتستخدم نصائح ماصة المتاح لشد بعناية الغشاء عن طريق دفع أطرافها إلى أسفل. تجنب الاتصال مع المناطق جمع الخلية.
- تغطية بلطف الغشاء مع غطاء زجاجي زلة. تجنب الحركة غير الضرورية من العينة. تغطية صحن مع غطاء وختم مع مختبر الفيلم حول حواف. لا تعرقل شفافية طبق (العلوي والسفلي)، وتسليط الضوء على عينة. تسمية مع علامة المختبر.
- الشروع فورا في (القسم 5.1) التصوير، ثم العودة إلى القسم 4.2 على الاستمرار في تلطيخ الخلوي من النصف الآخر من الغشاء.
- الخلوي تلطيخ
- تدريجيا ترطيب الغشاء عن طريق إضافة ببطء 500 ميكرولتر من الماء المقطر إلى أنبوب شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لتثبيت في القسم 3.4. محتويات نضح عدة مرات إلى طرف ماصة إلى المزيج، ثم إزالة المحتويات.
- إضافة 500 ميكرولتر من الماء المقطر. اسمحوا الوقوف لبضع ثوان، ثم إزالتها. إضافة 500 ميكرولتر من وصمة عار الأزرق الألسيان ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ 3 التوالي 500 ميكرولتر الماء المقطر يشطف أو حتى السائل يشطف واضح.
- إضافة 500 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين # 1 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ ثلاث 500 ميكرولتر متتالية يشطف بالماء المقطر أو حتى السائل يشطف واضح. يذوى (عكس القسم 4.2.1) بواسطة الشفط السائل واضح.
- إضافة 500 ميكرولتر من بابانيكولاو OG-6 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وأداء واحد 500 ميكرولتر 95٪ (ت / ت) شطف الإيثانول.
- إضافة 500 ميكرولتر من بابانيكولاو EA-65 وصمة عار ويترك لمدة 3 دقائق. إزالة وصمة عار وتنفيذ 3 على التوالي 500 ميكرولتر 95٪ (ت / ت) يشطف الإيثانول.
- يذوى بشكل كامل باستخدام ثلاث مرات متتالية 500 ميكرولتر 100٪ يشطف الإيثانول. باستخدام TWEezers، وإزالة عينة من الحل. تجنب المناطق جمع خلية مؤثرة.
- وضع غشاء على شريحة زجاجية. تأكد من أن خط تجميع الخلايا إما موازية أو عمودية على الشريحة هامش لتسهيل التوافق أثناء التصوير.
- تطبيق قطرة من الإيثانول بنسبة 100٪، وتغطي مع انزلاق زجاج. الشروع فورا في التصوير (القسم 5.2).
التصوير 5. عينة
- التصوير نيون Immunocytochemical البقع
- استخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر (CLSM) 11 أو مضان المجهر 12، مزودة بكاميرا رقمية ملونة، وصله بجهاز الكمبيوتر تشغيل برنامج الحصول على الصور. نظرا لعينات يجري الواردة في أطباق الثقافة، قد يكون من الضروري مجهر مقلوب.
- إعداد المجهر 11،12 فقا لامتصاص وانبعاث أطياف إيثيديوم homodimer-1 (528/617 نانومتر ماكسيما م ت / م بحضور DNA)، وcalcein AM (494/517 نانومتر Eس / م ماكسيما).
- تحديد أدنى التكبير المجهر (على سبيل المثال، الهدف 2.5X) وتفعيل نظام التصوير الرقمي. مراقبة العينة المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
- تفقد عينة لميزات الخلوية في المصالح.
- تحديد المطلوب التكبير المجهر والحصول على الصور باستخدام برامج التصوير.
- حفظ الملفات في أي شكل ملف المجهر الأصلي أو تنسيق ملف مضغوط (على سبيل المثال، * .raw التي تم *، و tiff).
- التصوير الخلوي البقع
- استخدام المجهر القياسية مختبر مشرق الميدان مع عدم وجود مرشحات، مزودة بكاميرا رقمية ملونة، وصله بجهاز الكمبيوتر تشغيل برنامج الحصول على الصور.
- مكان وشريحة زجاجية قفل (من الخطوة 4.2.8) على خشبة المسرح المجهر. ترطيب عينة مع الإيثانول بنسبة 100٪ حسب الحاجة، في جميع أنحاء الإجراء التصوير كله.
- تحديد أدنى التكبير المجهر (على سبيل المثال، الهدف 2.5X) وتفعيل اله نظام التصوير الرقمي. مراقبة العينة المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
- يتم محاذاة ضمان جمع الخلايا إما X أو Y محور السيطرة مرحلة المجهر. ضبط إذا لزم الأمر، عن طريق إزالة الغطاء زلة وتناوب العينة باستخدام طرف ماصة أو ملاقط.
- باستخدام برامج التصوير، التقاط الصور (ق) من العينة كلها مع أدنى التكبير المجهر.
- التبديل إلى التكبير المجهر المعتدل (على سبيل المثال، 10 - الهدف 20X) وضبط مصدر ضوء المجهر والمعلمات التصوير البرمجيات (التعرض والتباين وتوازن اللون الأبيض، وما إلى ذلك)، وتعطيل لها القياس برامج الحاسوب الآلي. حفظ هذه الإعدادات لاستخدامها في المستقبل.
- تحديد بداية ونهاية نقاط فحص (على سبيل المثال، أعلى اليسار واليمنى السفلى من جمع الخلية).
- باستخدام برامج التصوير، التقاط الصور (ق) في المنطقة بأسرها جمع خلية داخل البداية والنهاية نقطة. ضمان 20٪ جنبا إلى جنب وأعلى إلى أسفل تداخل betwالتابعين كل الصور المجاورة.
- حفظ الملفات باستخدام تنسيق ملف المجهر الأصلي أو تنسيق ملف مضغوط (على سبيل المثال، * .raw التي تم *، و tiff).
- توليد صورة بانورامية النهائية باستخدام البرمجيات الآلي خياطة الاختيار (على سبيل المثال، عناصر أدوبي فوتوشوب). استخدام صور المرجعية التي اتخذت في خطوة 5.2.5) لتأكيد دقة خياطة الآلي في الصورة النهائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
غشاء خلية ثقافة امتدت على مدى حامل البلاستيك هو أداة ملائمة لجمع يده من الخلايا الظهارية من الملتحمة غطاء ممسحة. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى أدوات إضافية معقمة تستخدم عادة لإعداد والتعامل مع الأغشية IC الشكل 1 يصور IC للمنطقة ممسحة غطاء باستخدام إدراج الثقافة الخلية. نحن الأمثل بروتوكولين تلطيخ المختلفة التي تكمل بعضها البعض لتوصيف الخلايا الظهارية من منطقة ممسحة غطاء بطريقة الرواية. الأصباغ immunocytochemical الفلورسنت تكشف النشاط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم تنفيذ الخلايا الانطباع عادة على الملتحمة الصلبية، وذلك باستخدام الأغشية استر السليلوز مختلطة. يتم قطع العينات إلى حجم من صفائح المواد السائبة، تعقيم، تطبيق وإزالتها من على سطح الملتحمة باستخدام ملقط. باستخدام نفس المواد الغشاء، تم تصميم جهاز IC التي تسيطر عليها مكبس مؤخرا لتتناسب مع هندسة سطح الملتحمة الصلبية، والحفاظ على ضغط ثابت بين تطبيقات 13. هذه الأساليب غير فعالة للضيق، غطاء منحني بارز ممسحة المنطقة (انظر الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، السليلوز م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين تمويل أو نزاعات ذات صلة للكشف عنها.
شكر وتقدير
نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى زميلتنا الدكتورة جلايا فاريكوتي التي قدمت نظرة ثاقبة وخبرة حول موضوع ممسحة الغطاء ، والتي ساعدت بشكل كبير في هذا البحث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألسيان بلو ، 1٪ في 3٪ حمض الخليك | سيجما | B8438-250ML | |
| هيماتوكسيلين ، جيل 1 | سيجما | GHS116-500 مل | |
| صبغة بابانيكولاو ، OG-6 | Sigma | HT40116-500 مل | |
| صبغة Papanicolaou ، EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live / Dead Live / Dead Toleranceity Kit | Life Technologies | L-3224 | يحتوي على أحجار الإيثيديوم homodimer-1 والكالسيين AM |
| الألكايين (0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 & nbsp; مم ، PTFE محب للماء ، 0.4 & nbsp ؛ ومايكرو. م | EMD Millipore | PICM01250 | |
| أطباق زجاجية ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
المراجع
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
