مقالة منهجية

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

10K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54276

⸱

يوليو 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكول تمايز خلايا عضلة القلب قويا وسريعا وقابلا للتطوير للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يمكن أن توفر خلايا عضلة القلب المشتقة باستخدام هذه الطريقة واسعة النطاق أعدادا كافية من الخلايا لاستخدامها الفعال في نمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية ، وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ، والتطبيقات السريرية المحتملة.

الملخص

تعظيم الاستفادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) للأبحاث، والنمذجة المرض والأدوية والتطبيقات السريرية يتطلب أساليب قوية للإنتاج على نطاق واسع من أنواع الخلايا الوظيفية، بما في ذلك العضلية. هنا علينا أن نظهر أن التلاعب الزمني للWNT، TGF-β، وSHH مسارات إشارات تؤدي إلى خطوط hPSC كفاءة عالية cardiomyocyte تمايز وحيدة الخلية passaged في كل تعليق ثابت وأنظمة التعليق مفاعل حيوي أثار. توظيف هذه الاستراتيجية أدت إلى ~ 100٪ الضرب الكروية، التي تحتوي على الدوام> 80٪ التروبونين القلبي خلايا T إيجابية بعد 15 يوما من الثقافة، والتحقق من صحة في خطوط hPSC متعددة. نفيدكم أيضا على الاختلاف من هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا لم تتكيف حاليا إلى الركض وحيدة الخلية، وقد تم التحقق من نجاح الذي في 42 خطوط hPSC. العضلية تم إنشاؤها باستخدام هذه البروتوكولات التعبير عن علامات-نسب محددة، ومن المتوقع عرض electrophysوظائف iological. يقدم بروتوكول لدينا منصة بسيطة وفعالة وقوية لإنتاج على نطاق واسع العضلية الإنسان.

المقدمة

خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، لديها القدرة على تجديد الذات والقدرة على التمايز إلى خلايا ثلاث طبقات جرثومية جنينية 1،2. ونظرا لهذه الخصائص، وتوفر hPSCs مصدرا قيما وغير محدودة لتوليد وقابلة للإنتاج أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر 3-5، لالإنتاجية العالية فحص المخدرات وسمية المقايسات 6،7 ويحتمل أن تكون للتطبيقات السريرية 8 . جيل الخلايا العضلية من hPSCs يوفر فرصة للتحقيق على وجه التحديد آليات أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية المعقدة والعلاجات الممكنة، في وقت سابق خارج نطاق قدراتنا نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية ذات الصلة و / أو توافر الأنسجة الأساسية المتضررة.

جميع التطبيقات المذكورة أعلاه hPSCs نecessitate إنتاج أعداد هائلة من العضلية عالية التخصيب والوظيفية. وهكذا، فإن توافر الكفاءة واستنساخه وقابلة للتطوير في المختبر بروتوكول تمايز القلب مناسبة لخطوط hPSC متعددة أمر بالغ الأهمية. وقد استخدمت التقليدية بروتوكولات cardiomyocyte التمايز استراتيجيات مختلفة مثل تشكيل هيئة مضغي 9، تقنيات شارك في الثقافة 10، الاستقراء مع الكوكتيلات السيتوكينات 11 و طرق بروتين تنبيغ 12. وعلى الرغم من التقدم في هذه التقنيات، معظمها لا يزال يعاني من ضعف كفاءة، تتطلب عوامل النمو مكلفة، أو تقديم العالمية محدود عند محاولة استخدام خطوط hPSC متعددة. حتى الآن، وقد وضعت هذه التحديات حدود لإنتاج الخلايا العضلية المستمدة hPSC للدراسات العلاج بالخلايا في النماذج الحيوانية، وكذلك في مجال الصناعات الدوائية لاكتشاف الأدوية 13. ولذلك، فإن تطوير تقنيات قوية وبأسعار معقولة لكبيران الانتاج -scale من الوظائف العضلية المستمدة hPSC في أنظمة ثقافة قابلة للتسهيل إلى حد كبير من التطبيقات التجارية والسريرية الخاصة بهم.

في هذه المخطوطة، ونحن التقرير تطور نظام التمايز القلب فعالة من حيث التكلفة ومتكامل مع كفاءة عالية، واستنساخ وتطبيق لhESCs وhiPSCs ولدت من مجموعة متنوعة من المصادر والأساليب الثقافة، بما في ذلك وسيلة لإنتاج على نطاق واسع للغاية السكان المخصب العضلية المستمدة hPSC باستخدام مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، لدينا الأمثل هذا البروتوكول لخطوط hPSC لا تتكيف مع المغذية ثقافة الخلية الحرة و / أو واحدة، مثل hiPSCs المنشأة حديثا أو أفواج كبيرة من خطوط hPSC ذات الصلة لتحليل آلية المرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، طلاء لوحات زراعة الخلايا وصيانة مشوه hPSCs

  1. إعداد وسائل الاعلام
    ملاحظة: تعقيم وسائل الإعلام باستخدام جهاز 0.22 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى 4 أسابيع. يتم سرد أسماء كاشف والموردين وأرقام مصورة في مواد الجدول.
    1. لماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEF) متوسطة، والجمع بين 445 مل DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS) و 5 مل وسائل الإعلام ثقافة الخلية (على سبيل المثال، Glutamax).
    2. لHESC المتوسطة، والجمع بين 390 مل خروج المغلوب-DMEM (KO-DMEM)، 100 مل استبدال خروج المغلوب المصل (KO-ريال)، 5 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية، 5 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و 0.5 مل 55 ملي β-المركابتويثانول.
      تنبيه: β-المركابتويثانول سامة. تجنب استنشاق، ابتلاع وملامسة الجلد.
    3. لRPMI-B27 (RB) متوسطة، والجمع بين 475 مل RPMI 1640، 10 مل B27 ناقصالأنسولين، 5 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية، 5 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين و 0.5 مل 55 ملي β-المركابتويثانول.
    4. لحل التفكك (DS)، والجمع بين 10 مل 0.05٪ التربسين، 4 مل KO-ريال، 1 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل)، و 5 مل KO-DMEM و 20 ميكرولتر CaCl 2 (1 M).
    5. لتغذية خلايا المتوسطة مكيفة، إضافة 15 مل المتوسطة HESC (بدون bFGF) إلى قارورة T75 مع صراعات uent الخلايا المغذية (MEF أو القلفة البشرية الليفية) والتي تم المعطل من قبل العلاج مع أي ميتوميسين C أو بواسطة أشعة. حصاد مكيفة المتوسطة بعد 24 ساعة واستبدالها مع المتوسطة HESC جديدة. الخلايا يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. طلاء لوحات ثقافة الخلية
    1. ECM جل طلاء:
      1. عند الشراء، ذوبان الجليد استخراج جل ECM في 4 درجات مئوية حتى أنها في حالة سائلة بما يتفق بالتساوي، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع بنسبة1: 2 في البرد KO-DMEM المتوسطة، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
        ملاحظة: أثناء إعداد هلام ECM، والحفاظ على جميع المواد اللازمة للاستخدام في aliquotting والطلاء الداخلي البرد. تركيز ECM هلام يختلف مع رقم الدفعة. ضمان ويلاحظ تركيز على قسامات. يمكن أن تظل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      2. ذوبان الجليد قسامة هلام ECM في 4 درجات مئوية. عندما إذابة، إضافة الباردة المتوسطة KO-DMEM لتركيز النهائي من 0.34 ملغ / مل. ماصة جيدا وإضافة 0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    2. ميتوتيكلي المعطل الفأر الجنينية الخلايا الليفية الطاعم الخليوي (MEF) طلاء
      ملاحظة: وقد وصفت إعداد الخلايا المغذية MEF السابق 14
      1. معطف 6 جيدا وحة زراعة الخلايا مع عامل ملحق (AF) أو 0.1٪ الجيلاتين (راجع الخطوة 1.2.3) في RT لمدة 5 دقائق (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا).إزالة وترك لوحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لتجف.
      2. ذوبان الجليد MEF عن طريق نقل قارورة المجمدة إلى 37 درجة مئوية الماء الحمام لحوالي 2-3 دقائق.
      3. إضافة 7 مل المتوسطة MEF إلى أنبوب 15 مل. عند إذابة قارورة من الخلايا، ونقل ببطء المحتويات إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 4 دقائق. نضح في وطاف resuspend الخلايا في المتوسط ​​MEF.
      4. عد الخلايا ولوحة 1 × 10 6 خلايا في 6 لوحة جيدا (~ 1.7 × 5 10 خلايا / جيد). نقل إلى حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 وتسمح للخلايا لإرفاق O / N قبل الاستخدام.
    3. الجيلاتين طلاء:
      1. حل 1 غرام من مسحوق الجيلاتين في الماء عالى النقاء لجعل 0.1٪ (ث / ت) حل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم الأوتوكلاف الحل في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما تبرد، إضافة إلى العدد المطلوب من الآبار (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: أي 0.1٪ من محلول الجيلاتين المتبقية يمكن أن تظل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
    4. Laminin طلاء:
      1. ذوبان الجليد laminin (1 ملغ / مل) في 4 درجات مئوية حتى إذابة. 5 ميكرولتر من حل laminin، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. ماصة جيدا ثم يضاف إلى العدد المطلوب من الآبار (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا)، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    5. السيليكون طلاء السطح سبينر قارورة الداخلية:
      1. اغسل 100 مل الدوار قارورة (مع 1 البندول الزجاج) مع الماء المقطر، وذلك باستخدام فرشاة التنظيف لإزالة أي غبار و / أو بقايا الثقافة. ملء مع 70٪ من الإيثانول وبعد شطف 30 دقيقة مع الماء المقطر. إضافة 5 M هيدروكسيد الصوديوم وترك O / N.
      2. إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وشطف قارورة تحت الماء الجاري لمدة 5 دقائق. ملء قارورة مع 1 M حمض الهيدروكلوريك ويترك لمدة 15 دقيقة. غسل القارورة مع المياه الجارية لمدة 5 دقائق، ثم مرتين مع الماء المقطر المزدوج إلى تماماإزالة أي أثر للحمض الهيدروكلوريك. ترك القارورة حتى يجف تماما في ش.
      3. إضافة 1.5 مل من محلول siliconizing إلى القارورة وتدوير أفقيا لتغطية جميع الأسطح. كرر نفس الإجراء البندول الزجاج.
      4. تسخين قارورة المغلفة في الفرن الجاف عند 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو السماح ليجف O / N في RT. إذا تم تسخينه في فرن، تترك لتبرد لRT عن 30 - 60 دقيقة.
      5. شطف القارورة 3 مرات مع الماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، ثم تعقيم بواسطة التعقيم في 121 مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. صيانة مشوه hPSCs
    ملاحظة:     سوف لكل من البروتوكولات المذكورة، ما لم ينص تحديدا، وتزرع الخلايا ومثقف في الآبار لوحات ثقافة 6 جيدا وأحجام إعطاء مناسبة لهذا الشكل.
    1. hPSCs مثقف كما مشوه الأجسام الشبه الكروية في نظام تعليق ثابت
      يجب بالفعل أن تتكيف الخلايا المستخدمة في هذه الخطوات ل: مذكرةوحيد الخلية الثقافة. 15
      1. بدء التجربة مع hPSCs مثقف على هلام ECM في لوحة الثقافة 6 جيدا في حوالي 70-80٪ confluency. إزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش. إضافة 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: لإزالة المستعمرات المتباينة، استخدم طرف ماصة لفصل بلطف وإزالة كافة أجزاء متباينة يدويا تحت مجهر تشريحي. يجب الحرص على عدم إزالة المستعمرات غير متمايزة.
      2. إزالة الخلايا من الحاضنة والمتوسطة نضح. غسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني، وإزالة وإضافة 0.5 مل خلية الانزيم التفكك. احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      3. إضافة 1 مل HESC المتوسطة وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. فصل الخلايا إلى خلايا واحدة باستخدام ماصة p1،000. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
      4. Resuspend الخلايا إلى 2 × 10 5 ج قابلة للحياةملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل في تغذية خلايا المتوسطة مكيفة تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632. نقل الخلايا لوحات مرفق منخفضة للغاية باستخدام ماصة 5 مل (3 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا).
      5. بعد 2 أيام، وإزالة بعناية الخلايا من الحاضنة ونصف نضح من المتوسط ​​(حوالي 1.5 مل). استبدال المتوسطة مشروط جديدة تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /.
      6. تغيير نصف المتوسط ​​كل يوم مع متوسط ​​مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF / حتى يوم 5. الآن، إما المزيد من الخلايا ثقافة، مرور لاستمرار ثقافة غير متمايزة (الخطوة 1.3.1.2 - 5)، أو استخدام للتمايز القلب (القسم 2 ). إذا استمرار ثقافة، وخلايا مرور كل 4-8 أيام.
    2. hPSCs مثقف على الخلايا المغذية وPassaged عن طريق كولاجيناز النوع الرابع
      1. قبل الركض hPSCs، وإزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 1 ملبرنامج تلفزيوني لكل بئر. إزالة ثم إضافة 0.75 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة، كما يشترط أن تكون حواف المستعمرات بدأت تقشر.
      2. نضح كولاجيناز وإضافة 1 مل من HESC المتوسطة لكل بئر. فصل المستعمرات إلى مجموعات صغيرة باستخدام مكشطة الخلية، ثم نقل الخلايا باستخدام ماصة p1،000 في أنبوب 15 مل. يجب الحرص على عدم تفريق التجمعات إلى قطع صغيرة.
      3. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية وإضافة إلى 15 مل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح الخلايا وطاف resuspend في المتوسط ​​HESC تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /.
      4. إزالة لوحة MEF المغلفة من الحاضنة ونضح المتوسطة MEF. نقل الخلايا في النسبة بين 1: 3 و 1:10، حسب الاقتضاء. تغيير متوسطة يوميا مع متوسط ​​HESC جديدة تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /. خلايا مرور كل 4-8 أيام.

2. Differentiأوجه من hPSCs كما الأجسام الشبه الكروية في نظام تعليق ثابت

  1. بدء التجربة باستخدام اليوم 5 الكروية غير متمايزة كما أعدت في القسم 1.3.1.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون متوسط ​​حجم الكروية 175 ± 25 ميكرون. وينبغي أن تستخدم ما لا يقل عن 50 الكروية عند بدء التجربة التمايز.
  2. نقل الكروية في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل RB المتوسطة لجمع أي الكروية المتبقية وإضافة إلى نفس أنبوب 15 مل. ترك الخلايا لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). نضح طاف، والحرص على عدم اتخاذ أي الكروية.
  3. إضافة 3 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021. نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. بعد 24 ساعة، كرر الخطوة 2.2.
    ملاحظة: RB المتوسطة خفيف حساسة. عند العمل مع المتوسط ​​RB، والحفاظ على ضوء ش.م.ب مغلقا.
  4. ادد 3 مل المتوسطة الظهير الأيمن إلى بيليه الخلية. نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. بعد 24 ساعة، كرر الخطوة 2.2.
  5. إضافة 3 مل المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما). نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. 2 بعد أيام كرر الخطوة 2.2.
  6. resuspend الخلايا في 3 مل من المتوسط ​​RB ونقل إلى لوحة الجيلاتين المغلفة للسماح للخلايا لنعلق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، ويمكن أيضا أن تبقى الخلايا في تعليق. من أجل الاستمرار مع ثقافة تعليق ثابتة، نقل الخلايا إلى لوحة مرفق منخفضة للغاية.
  7. تغيير المتوسطة مع 3 مل المتوسطة RB بعد 2 أيام. فإن الثقافات تبدأ للفوز اليوم التالي. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام مع متوسط ​​RB.

3. تمايز hPSCs كما الأجسام الشبه الكروية في مفاعل حيوي لتعليق حرك

  1. بدء التجربة مع الثقافة الكروية غير متمايزةد في تعليق ثابت لا يقل عن 3 مقاطع (انظر القسم 1.3.1). إضافة 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. إزالة الخلايا من الحاضنة ونقل جميع الكروية في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الكروية المتبقية وإضافة إلى نفس أنبوب 15 مل. ترك الخلايا لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). نضح طاف، والحرص على عدم اتخاذ أي الكروية.
  3. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني. يترك لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). إزالة طاف وإضافة 0.5 مل التربسين 0.05٪ زائد 0.53 ملي EDTA. احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إزالة الخلايا من الحاضنة وإضافة 1 مل المتوسطة HESC. باستخدام ماصة p1،000، فصل الخلايا إلى خلايا واحدة، عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. و resuspend إلى 2 × 10 5 viabلو خلية / مل في المتوسط ​​مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632.
  5. نقل 100 مل من تعليق خلية في قارورة مفاعل حيوي صلكنزد مع 1 البندول (انظر القسم 1.2.5). تبدأ مع الانفعالات 35 دورة في الدقيقة، وبعد الزيادة 24 ساعة إلى 40 دورة في الدقيقة.
  6. بعد 48 ساعة، والتوقف عن التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية إلى أسفل القارورة. استبدال نصف المتوسطة مع مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /. كرر نفس العملية كل 24 ساعة حتى يوم 5.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، ينبغي تشكيل الكروية غير متمايزة مع متوسط ​​حجم 175 ± 25 ميكرون.
  7. وقف التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية إلى أسفل القارورة. نقل جميع الكروية إلى أنبوب 50 مل في الحد الأدنى من المتوسط ​​(أقل من 50 مل). تجاهل أي وسيط المتبقية في قارورة مفاعل حيوي، وضمان بعناية أي الكروية هي المتبقية في وعاء.
  8. اوراقه ل5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل ثم إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية فضفاضة. يغسل مع 25 مل PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم أو المتوسطة RB، ثم يترك مرة أخرى ل5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل لتشكيل مرة أخرى بيليه فضفاضة.
  9. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021، 10 ميكرومتر مثبط روك و 0.1٪ كحول البولي فينيل (PVA). Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: RB المتوسطة خفيف حساسة. عند العمل مع المتوسط ​​RB حفاظ على درجة البكالوريوس في ضوء مغلقا واسطة.
  10. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  11. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل RB تستكمل المتوسطة بنسبة 0.1٪ بولي. Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى رانه مفاعل حيوي قارورة. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
  12. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  13. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما). Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 2 أيام.
  14. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  15. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB فقط. Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة. ينبغي مراعاتها الكروية بفوزه 48 - بعد 72 ساعة.
  16. تغيير نصف المتوسط ​​كل 3 - 4 أيام مع متوسط ​​RB فقط من خلال وقف التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من السفينة. إزالة بعناية 50 مل من المتوسط ​​من دون إزعاج الكروية وcarefاستبدال ully مع 50 مل من المتوسط ​​RB جديدة.

4. تمايز hPSCs عن طريق الثقافات لا تتكيف مع الركض وحيد الخلية

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للالتمايز السريع لعدد كبير من خطوط hPSC دون الحاجة إلى التكيف مع تقنيات زراعة وحيدة الخلية، عملية جدا كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. هذه التقنية قابلة للتطبيق على خطوط الخلايا التي تعتبر حساسة للغاية لتفكك خلية الأنزيمية، مثل خطوط hPSC التي أنشئت حديثا.

  1. بدء التجربة مع hPSCs مثقف على MEF (كما هو الحال في القسم 1.3.2) والتي ما يقرب من 70-80٪ متموجة. إزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش.
  2. إزالة المتوسطة وإضافة 0.5 مل تفارق الحل (DS). احتضان ل0،5-1 دقيقة حتى اعتقلت خلايا MEF صعودا وحواف المستعمرات hPSCs أصبحت واضحة. بسرعة إزالة DS وإضافة 0.75 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل).
  3. احتضانالخلايا لمدة 5-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فحص الخلايا تحت المجهر خلال فترة الحضانة، وعندما المستعمرات كلها بدأت يقلع وفصل، وإزالة كولاجيناز وإضافة 1.5 مل HESC المتوسطة.
    ملاحظة: إذا كان بعد 15 دقيقة معظم المستعمرات لا تزال تعلق، ووضع الخلايا إلى حاضنة. فحص الخلايا تحت المجهر كل 5 دقائق. يجب الحرص على عدم ترك الخلايا في كولاجيناز لأكثر من 30 دقيقة. إذا كان هناك العديد من المستعمرات العائمة في حل كولاجيناز، لا إزالة كولاجيناز. فقط إضافة 1 مل HESC المتوسطة.
  4. باستخدام ماصة p1،000، ماصة بلطف المستعمرات لفصل المستعمرات بأسرها. لا كسر المستعمرات إلى قطع صغيرة. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية إضافة إلى الأنبوب نفسه. يترك لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية جميع المستعمرات (لا أجهزة الطرد المركزي).
  5. إزالة بعناية طاف وإضافة 2 مل HESC ميديأم أن تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF. نقل الخلايا إلى لوحة مرفق منخفضة للغاية باستخدام ماصة 5 مل (1 مل في كل بئر من 24 لوحة جيدا و 3 مل في كل بئر من لوحة 6 جيدا). احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لا يقل عن 6 ساعة (بحد أقصى 12 ساعة).
  6. خلال هذا الوقت، وإعداد العدد المطلوب من الآبار / لوحات المغلفة laminin لخطوة 4.7. نسب نقل خلية الموصى بها هي 1 متكدسة بئر من لوحة 6 جيدا إلى 2 آبار لوحة 24-جيدا (أو ما يعادلها في المساحة السطحية).
  7. بعد 6 ساعات، ونقل بعناية المجاميع مستعمرة في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. غسل لوحة مع متوسط ​​RB لجمع أي الركام المتبقي، ويضاف إلى الأنبوب نفسه 15 مل (0.5 مل لكل بئر لمدة 24 جيدا و1 مل لكل بئر ل6 لوحات أيضا). انتظر 5 دقائق حتى الرواسب الركام، ثم نضح بعناية طاف. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه فضفاضة.
  8. إضافة 2 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021 ونقل بعنايةمع ماصة 5 مل لديك معدة سلفا laminin المغلفة الآبار (كما هو الحال في القسم 1.2.4) للسماح للخلايا لنعلق.
  9. بعد 24 ساعة، وإزالة بعناية المتوسطة في كل بئر وإضافة 1 مل المتوسطة RB فقط.
    ملاحظة: بعض المجاميع قد تعلق فقط ضعيفة جدا إلى لوحة الثقافة. ولذا فمن المهم أن لا إزالة أي المجاميع الكبيرة التي قد تأتي فضفاضة أثناء إجراء تغيير المتوسطة. من المهم، مع ذلك، لإزالة أكبر قدر من حطام خلية صغيرة ممكن.
  10. بعد 24 ساعة، وإزالة بعناية على المدى المتوسط ​​وإضافة المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما).
  11. تغيير المتوسطة بعد 2 أيام مع متوسط ​​RB فقط. سوف تبدأ خلايا للفوز اليوم التالي.
  12. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام مع متوسط ​​RB فقط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل إنشاء طريقة بسيطة للتمييز واسع النطاق للالعضلية من hPSCs، أنشأنا البروتوكول الذي تم علاج الخلايا في البداية مع المنشط WNT / β-كاتينين (CHIR99021) 16 و في وقت لاحق مع مثبطات للWNT / β- كاتينين ومسارات تحويل النمو عامل β (TGF-β) (IWP2 16 و SB431542 17، على التوالي)، وأخيرا منشط القنفذ سونيك (SHH) مسار (purmorphamine) 17 (الشكل 1A). في استراتيجية التمايز لدينا، ما يقرب من 50٪ من الأجس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

العضلية المستمدة من hPSCs تعتبر مصدرا جذابا للغاية لاستخدامها في نماذج الأمراض التي تصيب البشر، المخدرات فحص / اختبار السمية، وربما في المستقبل، علاجات التجدد. واحدة من العقبات الرئيسية لاستخدام هذه الخلايا ومع ذلك، هو القدرة على توفير ما يكفي من مواد ذات جودة عالية لاستخدامها على نحو فعال. استخدام لدينا بروتوكول وصفها، وتقدم الطريقة التي يتغلب هذا القيد.

في الآونة الأخيرة، وقد وصفت الجزيئات الصغيرة الاصطناعية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

معهد أبحاث القلب تشانغ فيكتور لا تشارك في، ولا تتغاضى عن تدمير الأجنة البشرية لأغراض البحث. مساهمته في هذه الدراسة كانت محدودة للعمل على الخلايا الجذعية المحفزة التي يتسبب فيها الإنسان.

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من خلال المنح المقدمة من معهد رويان ، والمجلس الإيراني لأبحاث وتكنولوجيا الخلايا الجذعية ، ومؤسسة العلوم الوطنية الإيرانية (INSF) ، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (NHMRC ؛ 354400) ، والمؤسسة الوطنية للقلب في أستراليا / Heart Kids Australia (G11S5629) ، وشبكة نيو ساوث ويلز لأبحاث القلب والأوعية الدموية. تم دعم HF من خلال منحة جامعية دولية للدراسات العليا من جامعة نيو ساوث ويلز ، أستراليا. تم دعم RPH من قبل زمالة NHMRC Australia. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للبشر الذين شاركوا في هذا البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
KnockoutDMEM Life Technologies10829018
استبدال مصل خروج المغلوب (KO-SR)Life Technologies10828028
GlutamaxLifeTechnologies 35050061
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةتقنيات الحياة11140-050
& بيتا - MercaptoethanolLife Technologies21985-023
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Life Technologies11875093
DPBS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيومLife Technologies14190144
DPBSLife Technologies14287072
عامل التعلق (AF) LifeTechnologiesS006100
ECM GelSigma-AldrichE1270
LamininInvitrogen23017-015
DMEMLife Technologies11965-092                                                                                                                                                                                                             
مصل الأبقار القاتل (FBS)Life Technologies16140-071
B27 ناقص الأنسولينGibcoA18956-01
Penicillin / StreptomycinLife Technologies15070063
0.05٪ Trypsin / EDTALife Technologies25300-054
تقنيات الكولاجيناز من النوع الرابع17140-019
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>)سيجما ألدريتشC7902
ميتومايسين سيبيوأستراليBIA-M1183
CHIR99021ميلتيني بيوتيك130-104-172
IWP2ميلتيني بيوتيك130-105-335
SB431542ميلتيني بيوتيك130-095-561
بورمورفامينميلتيني Biotec130-104-465
مثبط ROCK Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE6758
بولي فينيل كحول (PVA)سيجما ألدريتش363073
الجيلاتينسيجما ألدريتشG1890
تريبان بلوبيو راد145-0013
Accumax شركة تقنيات الخلية المبتكرةAM105
Sigmacote سيجما ألدريتشSL2  
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
قارورة سبينر مع 1 بندول ، 100 مل   ؛Integra Biosciences182 023
الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF)محضرة داخليا (أو متوفرة تجاريا) خطوط
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)محضرة داخليا (أو متوفرة تجاريا)

المراجع

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577(2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

WNT TGF beta T hPSC

مقالات ذات صلة