مقالة منهجية

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

DOI:

10.3791/54281

⸱

ديسمبر 25, 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت صبغة تقنية نقل الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات الفجوة تقاطع. فجوة الاتصال بين الخلايا وصلي هو عملية الخلوية الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة وتعطيل هذه الإشارات الخلوية له تأثيرات صحية سلبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت نقل صبغة تقنية (SL-DT) الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي عملية بين الخلايا الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة. وقد تم ربط انقطاع الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) من خلال المواد السامة والسموم والمخدرات، وما إلى ذلك العديد من الآثار السلبية على الصحة. وقد تم ربط العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان مقرها الوراثية إلى حدوث طفرات في الجينات الفجوة تقاطع. تقنية SL-DT هو فحص وظيفي بسيط لتقييم في وقت واحد GJIC في عدد كبير من الخلايا. الفحص يشمل خلايا التحميل المسبق مع صبغة الفلورسنت ذلك عن طريق تشويش لفترة وجيزة في غشاء الخلية بشفرة مشرط من خلال مجموعة من الخلايا. ثم يسمح للصبغة الفلورسنت لاجتياز من خلال قنوات الفجوة تقاطع إلى الخلايا المجاورة لفترة معينة. ثم يتم إنهاء فحص بإضافة الفورمالين إلى الخلايا. انتشار فلووويتم تقييم صبغ rescent من خلال مجموعة من الخلايا مع مجهر epifluorescence ويتم تحليل الصور مع أي عدد من حزم البرامج المظهرية المتوفرة، بما في ذلك حزم البرمجيات الحرة وجدت في المجال العام. كما تم تكييف هذا الاختبار لفي الدراسات المجراة باستخدام شرائح الأنسجة من الأجهزة المختلفة من الحيوانات المعالجة. عموما، يمكن فحص SL-DT تخدم مجموعة واسعة من في المختبر الاحتياجات الدوائية والسمية، ويمكن أن يحتمل تكييفها لانشاء نظم إنتاجية عالية مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل لتوضيح المزيد من العينات في وقت أقصر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير تقنية بسيطة وشاملة وغير مكلفة نسبيا لتقييم السمية المحتملة للمركبات. هذا هو النهج في المختبر والتي يمكن استخدامها في خطوط الخلايا متعددة. يمكن القياسية مختبرات البيولوجيا الخلوية المزودة المجاهر epifluorescence إجراء البحوث باستخدام هذا الاختبار.

لقد كان لدينا المعرفة الأساسية من وظائف الخلية يعتمد بشكل كبير على اختبارات بيولوجية في المختبر، وأصبحت عنصرا أساسيا في تقييم السمية للأدوية، والملوثات البيئية، والملوثات الغذائية ولدت. للأسف، لا يوجد في المختبر النظام الأحيائي واحد التي يمكن أن تلبي شامل لمطالب لجميع التقييمات السمية. العديد من فحوصات المختبر تم تصميم والأمثل لتقييم وكذلك تقييم نقطة نهاية البيوكيميائية أو جزيئية محددة. وهذه في كثير من الأحيان جنبا إلى جنب في إنتاجية عالية شكلت لتعكس الاضطراب لمعين مسار نقل الإشارة، مثل مستقبلات هرمون الاستروجين مما يشير إلى 1. وكانت هذه الاستراتيجية ناجحة جدا، ولكن عددا كبيرا من مسارات نقل الإشارة المشاركة في التعبير الجيني يجعل مهمة اختيار مسار الإشارات المحددة لتقييم معقدة جدا. ويجري حاليا إعداد عالية البروتوكولات من خلال-وضع وتستخدم لقياس وقت واحد العديد من مسارات إشارات، الذي كان نهج واحد للتغلب على بعض أوجه القصور في المقايسات واحدة. ومع ذلك، فقد أدرجت ليس كل مسارات إشارات بنجاح إلى نهج أكثر شمولا، بالإضافة إلى مسارات الإشارات جديدة يجري باستمرار اكتشفت أن يزيد من تعقيد عملية التقييم هذه. استخدام الأرقام واسعة من النهج في المختبر، وخاصة من خلال ارتفاع-وضع أنظمة لتقييم السمية الشاملة هي أيضا مكلفة للغاية وغير مواتية لمعظم محقق واحد أدى المشاريع البحثية.

GJIC هو القصبات عمليةتسيطر htly تغيرات في التيار الكهربائي، وتركيز الكالسيوم، ودرجة الحموضة، والتوازن الأكسدة، التي تنظمها مسارات الإشارات بين الخلايا التنبيغ الرئيسية والتفاعل مع الغشاء والهيكل الخلوي البروتينات 2،3. وهكذا، وتثبيط GJIC يمكن أن تعكس أنواع مختلفة من الإجهاد الخلوية، وتعطل الوظائف الخلوية المختلفة، أو اضطرابات من مختلف مسارات نقل الإشارة. مقاربة أخرى للتغلب على استخدام محدودة اختبارات بيولوجية نقل الإشارة هو الاستفادة من الظواهر البيولوجية أن الكثير، إن لم يكن أكثر، والتضمين مسارات نقل الإشارة كذلك من قبل أنظمة الإشارات بين الخلايا التعاونية من خلال قنوات الفجوة تقاطع 4-8. على الرغم من أن أنظمة الإشارات بين الخلايا هي أيضا عديدة وتحت السيطرة مسار متعددة، إشارات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة في النهاية وظيفة من القنوات التي يتم فتحها، مغلقة جزئيا أو مغلقة تماما. وهذا يوفر نقطة النهاية التي يمكن قياسها بسهولة باستخدام مختلففي أنظمة الأحيائي المختبر 7. وبالنظر إلى أن نقطة مجموعة التماثل الساكن من الأنسجة يتطلب فتح قنوات، وتحديد تأثير المركبات على الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) هو نهج أكثر شمولا في تحديد الآثار السمية المحتملة للمركبات 4،8. في جوهرها، وهذه الظاهرة البيولوجية الهامة التي تلعب دورا محوريا في تنسيق متعددة الأحداث نقل الإشارة السيطرة على التعبير الجيني يسمح لتقييم واسعة من الآثار السمية. وهكذا، اختبارات بيولوجية التي تقيم GJIC هي نقطة انطلاق ممتازة لتقييم إمكانية السامة من المركبات.

وتستند هذه التقنيات الأكثر شمولا المستخدمة لتقييم GJIC على تحميلها مسبقا الخلايا مع التحقيق الفلورسنت ثم مراقبة هجرة الصبغة من خلية تحميل أو الخلايا إلى الخلايا المجاورة. وقد شملت التقنيات لتهيئة تحميلها على صبغ حقن مكروي 9، كشط تحميل 10، والميثيل استرات تحقيقات 11 . مشرط التحميل الفلورسنت نقل صبغ (SL-DT) الأسلوب هو تعديل للتحميل كشط - صبغ نقل فحص وضعتها الفولي 10. بدلا من كشط أكثر الغازية، وطريقة مشرط تحميل هذا التقرير ينطوي على لفة لطيف من مشرط بشفرة الجولة من خلال أحادي الطبقة من الخلايا التي تقليل الضرر الغازية (الشكل 1). مزايا هذه التقنية هي تقييم السمية من مجموعة من الخلايا بدلا من الخلايا واحد من الفحص حقن مكروي. وعلاوة على ذلك، وبساطة هذا الاختبار يسمح للكشف السريع لوحات متعددة في وقت قصير في حين طرق استخدام التقنيات والأساليب التي تستخدم استرات الميثيل من تحقيقات الفلورسنت حقن مكروي بشكل ملحوظ أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أعلى بكثير مستوى المهارة.

رغم عدم وجود طريقة واحدة لتلبية جميع احتياجات دراسة GJIC. فحص SL-DT هو فحص بسيط وغير مكلفة إلى حد ما ومتعدد الاستعمالات التي يمكنتلبية العديد من احتياجات التقديرات الأولية من السميات من المركبات المختلفة. وتشمل المزايا الرئيسية: البساطة، لا حاجة خاصة للمعدات أو المهارات المطلوبة لأساليب أخرى مثل حقن مكروي، والانتعاش الفلورسنت بعد photobleaching من (FRAP) فحص وتفعيل المحلي الجزيئية فحوصات التحقيق الفلورسنت، والتقييم السريع والمتزامن لGJIC بشكل كبير عدد من الخلايا، يفضي إلى ارتفاع الإنتاجية انشاء مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل، وكذلك قدرتها على التكيف للدراسات في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على بروتوكول لهذه الدراسة من قبل رعاية الحيوان واللجنة الاستفادة من المعاهد الوطنية للعلوم الصحية من اليابان، والتي هو فيها في الجسم الحي وقد أجريت التجارب، للتأكد من أن الفئران معاملة إنسانية وفيما يتعلق لتخفيف المعاناة.

1. SL-DT الأحيائي

  1. البذور 3 × 10 5 WB-F344 خلايا الظهارية كبد الفئران على 35 ملم لوحات ثقافة قطر التي تحتوي على النسور تعديل 5٪ مصل بقري جنيني المتوسطة بالاضافة الى ذلك، والثقافة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 100٪ الرطوبة النسبية (RH)، و 5٪ CO 2.
  2. ثقافة الخلايا حتى تصل إلى 100٪ التقاء (عادة 2 أيام) وإجراء العلاج التجريبي المطلوب من الخلايا كما هو موضح أدناه.
    1. إجراء التجارب الجرعة الاستجابة
      1. إضافة 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من ملي حل الأوراق المالية 2 من فينانثرين في الأسيتونتريل٪ 100 و 4 ميكرولتر، 6 ميكرولتر، و 8 ميكرولتر من حل 20 ملي الأسهم من phenanthrene في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لكل وحدة تخزين إضافية من المحلول.
      2. إضافة 4 ميكرولتر، 6 ميكرولتر، 8 ميكرولتر، 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من حل 100٪ من الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لكل وحدة تخزين إضافية تتمثل في حل الأسيتونتريل لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
      3. احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة في حاضنة وضعت في 37 درجة مئوية، و 100٪ RH و 5٪ CO 2.
      4. انتقل إلى الخطوة 1.3.
    2. سلوك الوقت التجارب الاستجابة
      1. إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو للكل نقطة زمنية (أي، 0، 1، 2، 3، 4، 5، 10 دقيقة).
      2. إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لكل نقطة من الوقت لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
      3. احتضان لوحات في كل مرة ع المعينةoint في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 100٪ RH و 5٪ CO 2.
      4. انتقل إلى الخطوة 1.3.
    3. إجراء التجارب الانتعاش مرة
      1. إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لمدة 15 دقيقة.
      2. إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لمدة 15 دقيقة لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
      3. صب المتوسطة التي تحتوي إما على فينانثرين أو الأسيتونتريل وشطف 3X مع كل 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
      4. إضافة 2 مل من متوسط النمو الطازج كل لوحة واحتضان لأوقات الانتعاش المطلوب (أي، 25، 35، 45، 60، 90، 120، 150، 180، 240، 360 دقيقة) في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 100 ٪ RH و 5٪ CO 2.
      5. انتقل إلى الخطوة 1.3.
    4. تجارب آلية سير
      1. إضافة نقل الإشارة المانع، أي
      2. إضافة 5 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو لمدة 15 دقيقة لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
      3. إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو بالإضافة إلى D609 لمدة 15 دقيقة إضافية.
      4. إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط ​​النمو بالإضافة إلى 100٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة إضافية لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
      5. انتقل إلى الخطوة 1.3.
  3. تجاهل مستنبت إما عن طريق سكب بلطف المتوسط ​​أو عن طريق الشفط فراغ.
    ملاحظة: يجب التخلص من ثقافة المتوسط ​​تحتوي على النفايات الخطرة بشكل مناسب.
  4. شطف الخلايا ثلاث مرات مع كل 3 مل من برنامج تلفزيوني وإما صب أو نضح بين هذا وذاكن يشطف.
  5. ماصة 1 مل من 1 ملغ / مل لوسيفر صبغ أصفر يذوب في برنامج تلفزيوني (LY) في كل لوحة الخلية.
  6. التحميل المسبق الصبغة في الخلايا عن طريق المتداول بلطف # 20 الجراحية شفرة الصلب مع حافة مدورة من خلال مجموعة من الخلايا في ثلاث مناطق مختلفة من لوحة.
    1. تبدأ من خلال وضع مشرط عمودي (زاوية 90 درجة) و 5 ملم من حافة صفيحة الثقافة، ومن ثم لفة مشرط من هذه الزاوية العمودية إلى نحو زاوية من 15 درجة (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: ويتحقق ذلك عن طريق معسر مشرط بين السبابة والإبهام. استخدام الجاذبية للسماح للمشرط للذهاب بلطف من 90 درجة إلى 15 درجة موقف (كما شفرة دائرية تتحرك ببساطة على الخلايا). وهذه الحركة يترك خط المسافة البادئة ملحوظ بصريا.
  7. احتضان الخلايا مع الحل LY لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. صب أو نضح LY وشطف ثلاث مرات مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة كافة extracellular صبغ للقضاء على مضان الخلفية خارج الخلية.
  9. إضافة 0.5 مل من 10٪ الفوسفات حل الفورمالين لإصلاح الخلايا.
    ملاحظة: بعد تثبيت في الفورمالين، الهواء الجاف الخلايا وتخزينها في الظلام لمدة تصل إلى سنتين مع الحد الأدنى photobleaching من الصبغة LY. عند الاقتضاء، ترطيب مع 10٪ من محلول الفورمالين لتصور الجبهة صبغة الفلورسنت.
  10. عرض الخلايا الثابتة باستخدام المجهر epifluorescence مجهزة مكعب مزدوج اللون لقمم الإثارة / انبعاث 428/536 نانومتر في التكبير من 200X. تنسيق بين جميع لوحات بحيث خط المسافة البادئة هو مواز للمجال الأفقي للرؤية.
    ملاحظة: مكعب FITC مزدوج اللون يعمل بشكل جيد.
    1. التقاط صورة مع كاميرا CCD والبرامج الداعمة.
      1. فتح البرامج الداعمة للكاميرا CCD واستخدام إعدادات التعرض للسيارات. استخدم زر "الاستيلاء" على اكتساب رقميا الصورة. حفظ الصورة على النحو ملفات .tif باستخدام زر "حفظ".

    2. التكيف من SL-DT الفحص لأنسجة الكبد

    1. إزالة ما يقرب من سم شريحة 2 × 2 من الفص الأيسر من الكبد من 5 أسابيع من العمر، ذكر فيشر 344 الفئران باستخدام مقص تشريح ووضعه على البلاستيك تزن لوحة مغطاة الشاش الرطب 12.
    2. ماصة 0.5 مل من محلول برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملغ / مل كل من إبليس لوحة صفراء ورودامين ديكستران (RD) على سطح شريحة الكبد في البلاستيك الوزن.
      ملاحظة: RD هو الصبغة التي لا يمكن اجتياز قنوات تقاطع الفجوة وسيمثل الخلايا التي تم تحميلها.
    3. جعل 3-5 شقوق حوالي 1 سم طويلة على سطح شريحة الكبد الذي يحتوي على محلول الصبغة في وزن اللوحة مع شفرة حادة ثم قم بإضافة صبغة إضافية كافية لملء الشقوق.
    4. احتضان النسيج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة على البلاستيك وزن اللوحة.
    5. شطف ثلاث مرات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    6. إصلاح الأنسجة اوفهrnight في 30 مل من 10٪ الفوسفات الفورمالين في 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    7. في اليوم التالي، وغسل الشرائح مع الماء، وتقليم الأنسجة حول شق مع مقص تشريح في 1 × 1 × 0.5 سم 3 شرائح ثم استخدام التقنيات القياسية لتضمين شرائح في البارافين (13).
    8. القسم شرائح عمودية على خط شق لبسمك 5 ميكرون وتخزين العينات في الظلام حتى جاهزة للتصوير باستخدام تقنيات باجتزاء قياسية مع 13 مشراح.
    9. استخدام المجهر epifluorescence مجهزة الكاميرا الرقمية CCD لتصور والتقاط الصور من الجبهات صبغة الفلورسنت وفقا للمادة 1.10 7.

    3. تحديد مقدار GJIC

    1. قياس انتشار صبغة الفلورسنت باستخدام حزمة البرامج المظهرية (على سبيل المثال، يماغيج).
      1. انقر فوق علامة التبويب "ملف" ثم انقر فوق "فتح" لفتحالصورة المحفوظة.
      2. انقر على "أداة اليد الحر" في شريط تبويب أداة لتتبع الخطوط العريضة للجبهة صبغ.
      3. انقر فوق علامة التبويب "تحليل" ثم انقر فوق "القياس".
        ملاحظة: هذا سيولد قيمة المنطقة في ورقة انتشار، والتي يمكن نسخها إلى برامج أخرى انتشار ورقة إذا رغبت في ذلك.
    2. باستخدام برنامج جداول البيانات، حساب جزء من التحكم (FOC) من خلال تقسيم المنطقة من انتشار الصبغة في لوحة التجريبية من منطقة سافر الصبغة في لوحة التحكم باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-1
      وه = مجال انتشار الصبغة في الخلايا المعرضة للمتغير التجريبي، مثل الخلايا المعالجة بمادة كيميائية في جرعة أو زمنية محددة
      وج = مجال انتشار الصبغة في السيطرة، والتي هي الخلايا تعامل مع السيارة المستخدمة لإذابة المواد الكيميائية ذات الاهتمام
      ملاحظة: لتحديد تأثير السيارة،ومن شأن ه أن يكون مجال انتشار الصبغة في الخلايا المعالجة من قبل مركبة وشأن ج تكون المنطقة من انتشار الصبغة في الخلايا لم تعالج من قبل مركبة. أثر السيارة ويفضل أن يكون أقل من 10٪.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم انقطاع GJIC على نطاق واسع والعلامات البيولوجية لتحديد المركبات السامة على المستويات جينية nongenotoxic السيطرة الجين الذي يؤدي الى تأثيرات صحية ضارة 14. على سبيل المثال، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات متعددة الحلقات والملوثات في كل مكان من البيئة ولكن تختلف في سميتها جينية بوصفها وظيفة من الهياكل الجزيئية من 15. وعادة ما يتم العثور على أقل متعددة الحلقات الوزن الجزيئي في تركيزات أعلى نسبيا من أعلى متعددة الح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص SL-DT هي تقنية بسيطة وتنوعا في قياس GJIC، ولكن هناك العديد من المخاوف الحرجة التي يجب أخذها في الاعتبار في تصميم البروتوكولات التجريبية المناسبة. لقياس قوة من GJIC باستخدام فحص SL-DT يجب أن يكون هناك انتشار صبغ جيد للLY من خلال تقاطعات الفجوة من الخلايا. في الحد الأدنى، وينبغي اختيار الوقت المناسب للتأكد من أن الصبغة ينتشر من خلال ثمانية أو أكثر من صفوف من الخلايا من الخلايا مشرط تحميلها في كلا الاتجاهين. أيضا، لسهولة قياس المسافة التي الصبغة هاجر من الخلايا مشرط تحميل، حدد عا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم من منح NIEHS #R01 ES013268-01A2 ، والمحتويات هي مسؤولية المؤلف وحده ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية ل NIEHS ، وبدعم من مشروع CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05 / 2.1.00 / 19.0382.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
WB-F344 الخلايا الظهارية لكبد الفئرانمن الدكتورين جيه دبليو جريشام وإم إس تساو من جامعة نورث كارولينا (تشابل هيل ، نورث كارولاينا)لا شيءمقدم من الدكتورين جيه دبليو جريشام وإم إس تساو جامعة نورث كارولينا تشابل هيل نورث كارولاينا
35 مم لوحات ثقافةكورنينج430165
25 سم 2< / sup> قوارير ثقافةCorning430639
75 سم < sup>2< / sup> قوارير ثقافةCorning430641
D-medium ، وسيط تعديل النسور   ؛ThermoFisher / GIBCO الصيغة رقم 78-5470EF
مصل الأبقار الجنينيThermoFisher / GIBCO   ؛10437
0.25٪ trypsin-EDTA ThermoFisher / GIBCO 15050
فوسفات مخزن محلول ملحيمحلي الصنعانظر أدناه للحصول على مكون Cat #137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار Na 2< / sub>PO 4< / sub> ، 2 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub>
KClJT Baker - Mallinckrodt & nbsp;3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
لوسيفر الأصفر CH ، ملح الليثيومسيجما ألدريتش الكيميائيةL0259
الرودامين ديكسترانسيجما ألدريتش الكيميائيةR9379
1-ميثيل أنثراسينسيجما ألدريتش الفينانثرين الكيميائي
سيجما ألدريتش كيميكالP11409
ريسفيراترولسيجما ألدريتش كيميكالR5010
D609Tocris Bioscience 1437
أسيتونيتريلEMDAX0145-1
37٪ محلول فورمالديهايدJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
# 20 شفرة جراحيةFine Science Tools Inc. 10317-14
50 مل أنابيب معقمة مخروطيةالشكل حراري علمي 339652
مجهر نيكون epifluorescence  نيكون -ماجر ساینتفيككسوف TE300
نيكون FITC مكعب ثنائي اللوننيكون -ماجر ساينتفيك96107
CCD كاميرانيكون -ماجر Scientificنيكون كول سناب EZ CCD
نظام التصويرنيكون -ماجر Scientificنيكون NIS-Elements F2.2 نظام التصوير.
ImageJالمعهد الوطني للصحةhttp://imagej.nih.gov/ij/

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Scalpel Loading Fluorescent Dye TransferLucifer Yellow Dye TransferEpifluorescence MicroscopyPhenanthrene Toxicity AssayCell Membrane PerturbationDye Migration AnalysisToxicant Effects AssessmentIn Vitro ToxicologyFunctional Biomarker Assay

مقالات ذات صلة