عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

وناقش العديد من التقارير تطوير أساليب الاستخراج paper- أو التي تعتمد على الأغشية للاستخدام في نقطة من الرعاية (POC) الأجهزة ^1-5 بهدف جعل حساسية رائعة وخصوصية التشخيص الجزيئي للجميع. صاغ منظمة الصحة العالمية (WHO) الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي مبادرة التشخيص على المدى ASSURED (بأسعار معقولة، الحساسة، محددة، وسريعة وقوية، خالية من المعدات وتسليمها لأولئك الذين في حاجة إليها المستخدم ودية) لوصف خصائص مثالية لPOC اختبار ^6. من هذه المبادئ التوجيهية، فإن السمة خالية من المعدات تحديا من نوع خاص لتحقيق التشخيص الجزيئي. ومع ذلك، فإن كل الابتكار في مجال تحقيق هدف الوصول إلى من هم في أشد الحاجة، وليس هناك أمل في تحسن على المدى القريب في أداء الاختبار عن طريق التكيف مع التكنولوجيا الحالية ^7.

نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الدم الكاملالتي لا تتطلب الكيمياء المعقدة أو الأجهزة المخبرية. الاتحاد الدولي للسباحة (الترشيح عزل الأحماض النووية) طريقة تحضير العينة وضعت أصلا لاستخراج الحمض النووي الكريات البيض من الدم الكامل من أجل كشف طليعة الفيروس HIV-1 كجزء من عينة إلى الإجابة نقطة من الرعاية (POC) الكمي PCR (QPCR) الرضع في وقت مبكر للتشخيص (عيد) منصة للاستخدام في بيئات محدودة الموارد ^8-11. استخراج الاتحاد الدولي للسباحة يختلف عن أساليب تنقية التقليدية التي تستخدم الأغشية السيليكا أو جزيئات ممغطس المغلفة السيليكا لربط عكسية الحمض النووي في حضور وكلاء chaotropic ^12. بدلا من ذلك، يستخدم الاتحاد الدولي للسباحة الترشيح الرأسي عبر غشاء الفصل لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم الكامل مباشرة. غشاء التي تحتوي على الحمض النووي شرك يمكن وضعها مباشرة في أنبوب PCR وإما استخدامها على الفور في تفاعل PCR أو الهواء المجفف لاحق التضخيم ^9. تستخدم أي chaotropic وكلاء، والفينول، أو الكحول في استخراج عينة، eliminaتينغ خطوات الغسيل واسعة اللازمة لإزالة مثبطات QPCR قوية مستمدة من عملية الاستخراج ^13،14.

غشاء الاتحاد الدولي للسباحة يمكن التقاط إما خلايا ⁹ أو الحمض النووي الجيني حررها خلية تحلل ¹¹ قبل يتم إضافة العينة إلى الغشاء. لالتقاط الخلايا، يتم إضافة الدم الكامل مباشرة إلى الغشاء. وهي lysed الخلايا بعد ذلك في غشاء من خلال إضافة 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم. ميزة لهذا الأسلوب هو أنه ينطوي فقط 3 خطوات: 1) عينة بالإضافة. 2) خلية تحلل / غسيل و 3) وضع القرص مرشح في أنبوب QPCR. العيب إلى هذا الأسلوب هو أن غشاء يمكن أن تعقد سوى عدد محدد من الخلايا يتناسب طرديا مع قطر القرص الغشاء. للوصول إلى الحد من الكشف المطلوبة للعيد، و 100 ميكرولتر من الدم الكامل هو مطلوب لإدخال عينة الذي ينطوي على مرشح كبير جدا بحيث يمكن وضعها في أنبوب QPCR. الناشر خلايا الدم مع المنظفات قبل إضافة العينة إلى جمعويضيف غشاء خطوة المعالجة، ولكن يسمح باستخدام مرشح أصغر لنفس حجم العينة. كنا قادرين على إثبات استنساخ عالية، والكشف عن نسخة واحدة، وتقدير حجم اقل من 10 نسخ من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر من الدم باستخدام هذا التكوين اختبار ^11.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الاتحاد الدولي للسباحة كما وضعت أصلا للاستخدامات المختبرية. شطيرة غشاء / فلتر المعروفة باسم وحدة إعداد نموذج الاتحاد الدولي للسباحة يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها لاستخدامها لاحقا. عندما تكون العينات ليكون استخراجه هذه العملية تستغرق مدة 2 دقيقة، ويمكن أداؤها في متفاوتة دفعات الحجم. وQPCR يمكن تشغيلها مباشرة أو المرشحات التي تحتوي على الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من يمكن تخزين حتى أنها مريحة لأداء QPCR. هذه الطريقة مناسبة جدا لتحليل الروتيني للعينات في كل من إعدادات الموارد المنخفضة والعالية.

بيان الأخلاق: العينات الدموية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة لا تعتبر الأبحاث التي تجرى على البشر. وقد تم الحصول على عينات لأغراض التشخيص السريري، والذي كانوا راضين، وقدمت الجزء المتبقي من هذه العينات للفحص البحوث الاتحاد الدولي للسباحة. تم ترميز العينات من هذا القبيل أن المحققين لم يتمكنوا من التأكد بسهولة من هوية الأفراد.

1. إعداد وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة عينة

1. إعداد النشاف لوحة عن طريق قطع 35 × 35 مم ² من 2.6 مم وسادة من القطن 100٪. قطع منصة واحدة في العينة.
2. إعداد فيلم البارافين البلاستيك مع شريط دعم ورقة بواسطة قطعة قطع فيلم البارافين (25 ملم (ح) بنسبة 50 ملم (ث)) ثم اللكم حفرة قطرها 7.14 ملم في وسط الشريط باستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. إعداد شريط واحد لكل عينة.
3. إعداد الغشاء الفاصل ملزمة الدم الزجاج (غشاء القبض) على القرص من خلال اللكم دائرة قطرها 8.35 ملمباستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. لكمة قرص واحد لكل عينة. القرص لديه القدرة على الاحتفاظ الجسيمات من 2.3 ميكرون.
4. تجميع عينة وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة خلال وضع القرص الالتقاط في وسط لوحة النشاف باستخدام ملقط. وضع شريط فيلم البارافين على القرص التقاط الصورة حتى يترك حفرة من الشريط البارافين وسط القرص القبض عرضة للخطر.
5. ضمان أقصى قدر من الاتصال بين القرص ولوحة النشاف التي تمتد على الشريط البارافين قليلا لتغطية لوحة النشاف والضغط على الشريط البارافين بحزم التمسك بها إلى لوحة النشاف حول جميع حواف القرص.
6. جعل العديد من وحدات حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

2. إعداد QPCR أنبوب

1. إعداد قرص الشريط 5.1 ملم من شأنها ترسيخ غشاء القبض على الخلية إلى جانب أنبوب QPCR لمنع غشاء من عرقلة الكشف عن مضان من قبل اللكم دائرة بولي المغلفة المزدوجخاء الشريط التشخيص بمطرقة مدفوعة لكمة من ورقة الشريط. إعداد القرص شريط واحد لكل عينة.
2. إزالة جانب واحد من الشريط اللاصق بطانة. ضع الشريط إلى 200 ميكرولتر أنبوب PCR، الشائكة على جانب واحد وباتجاه الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة ملصق الثانية بطانة. الأنبوب هو الآن على استعداد لاستقبال القرص المعدة.
3. إنتاج أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

3. دبر الدم عينة

ملاحظة: إذا كان يجري إعداد عينة اختبار حقيقية، انتقل إلى الخطوة 4.

1. ذوبان الجليد الخلايا 8e5-LAV ¹⁵ بإيواء نسخة واحدة من طليعة الفيروس HIV-1 تم الحصول عليها من ضمان الجودة مختبر علم الفيروسات (VQA، راش المشيخية / سانت لوقا مركز الطبي، شيكاغو، IL).
   ملاحظة: يتم تخزينها كما الكريات الخلايا المجمدة بتركيز 4000 خلية / ميكروليتر. تم التحقق من عدد الخلايا كما هو موضح سابقا ^9.
2. إعداد سرالتخفيف الاتحاد العالمي للتعليم في تجميد المتوسطة (90٪ مصل بقري جنيني، و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد) لتركيزات تتراوح 1-400 خلية / ميكروليتر.
3. الماصة 10 خلايا ميكرولتر من كل من التخفيفات المسلسل إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة HIV-1 EDTA سلبي تعامل عينة الدم الكامل لكل أنبوب لإنشاء منحنى قياسي من نسخة أرقام 8e5-LAV 10-4،000. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات.

4. تنفيذ الاتحاد الدولي للسباحة استخراج

1. خلايا الدم ليز بإضافة تريتون-X100) إلى تركيز النهائي من 1٪ (11 ميكرولتر 10٪ تريتون-X100 إلى 110 ميكرولتر من الدم الكامل والخلايا من الخطوة 3.3).
2. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات. الدم يجب أن تتحول الأحمر الشفاف.
3. الماصة كل عينة دم على القرص القبض عليه.
   ملاحظة: ختم ضيق المياه بين الشريط البارافين والغشاء القبض يضمن تدفق الدم من خلال الغشاء، واتصالات جيدة بين القبض على مembrane والنشاف التجمع وحة يضمن عينة فتل السريع.
4. السماح عينة لامتصاص من خلال مرشح.
   ملاحظة: الفتائل المحللة الدم إلى لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح القرص القبض عليه. وقد غارقة المحللة في القرص عند ظهوره غير لامع.
5. إضافة 600-1،000 ميكرولتر 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة على القرص القبض عليه.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تضاف غسل العازلة بمثابة إضافة كبيرة الحجم من 600 ميكرولتر. سوف عازلة تشكل قطرات على الشريط البارافين مسعور والفتيل من خلال ثقب إلى القرص في حوالي 20 ثانية. سوف مرشح تغير من اللون الأحمر إلى إزالة مشيرا الأبيض من الهيموغلوبين.
6. فصل القرص من لوحة النشاف مع ملقط وتطبيق القرص إلى الشريط في أنبوب PCR استعداد. إذا كان هناك أي لون أحمر اليسار على مرشح إضافة 50-100 ميكرولتر من غسل العازلة لمسح عامل التصفية قبل وضعه في أنبوب.
   ملاحظة: نادرا، الضغط الزائد تطبيقها أثناء إعدادالاتحاد الدولي للسباحة وحدات النتائج في تقسيم طبقات غشاء أثناء فصل من لوحة النشاف. تجاهل هذه الأقراص وإعداد عينة جديدة.
7. بعد يتم وضع فلتر في أنبوب PCR، وتحليل عينات على الفور. بدلا من ذلك، بين عشية وضحاها الجاف في علبة تحتوي على الكالسيوم كبريتات المجففة، ثم سقف وضعها في الحقيبة احباط مع المجففة السيليكا ومخزن لتصبح جاهزة للتحليل.

5. QPCR رد الفعل

1. إعداد 100 ميكرولتر مزيج الرئيسي QPCR في رد الفعل باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الاشعال وتحقيقات محددة كما هو موضح سابقا ^9،11. تشمل عنصر تحكم التضخيم الداخلية لمراقبة وجود مثبطات التضخيم والتحقق من أن عينة سلبية هي سلبية حقيقية. مما لا شك فيه أن مرشح مغطاة بالكامل مع مزيج الرئيسي وأن المرشح يبقى ثابتة إلى جانب أنبوب في جميع أنحاء رد فعل.
2. أداء التضخيم باستخدام الوقت الحقيقي جهاز PCR كما هو موضح سابقا ^9.

ويرد سير العمل لاستخراج الحمض النووي proviral من الدم الكامل ارتفعت مع خلايا 8e5-LAV في الشكل 1. ويبين الشكل 2 وحدة عينة الاتحاد الدولي للسباحة وإعداد أنبوب QPCR. وتسمح هذه الطريقة لتضخيم كفاءة HIV-1 طليعة الفيروس من خلايا 8e5-LAV في أعداد نسخة مختلفة، كما هو موضح في المنحنى القياسي العينات المفتعلة (الشكل 3). كان PCR كفاءة من 103٪، وتحسب من الكفاءة = -1 + 10 (-1 / المنحدر). كانت معادلة خط ذ = -3.25x + 27.95، مع وجود علاقة من R² = 0.996. منحنى proviral مستوى الحمض النووي فيروس نقص المناعة البشرية يتطابق أيضا التضخيم تكرار للغاية، كما يتضح في الجدول 1. بالإضافة إلى ذلك، الرقابة الداخلية من 500 نسخة Hydroxypyruvate اختزال موجودا لإظهار أنه لا يوجد تثبيط PCR الناتجة عن استخراج الدم مع الاتحاد الدولي للسباحة، بغض النظر عن عدد النسخ من HIV-1 طليعة الفيروس الحالية (الشكل 4). وقد حصلت IC التضخيم بكفاءة في جميع عينات 18 اختبار، بمتوسط ​​الكلوروكوين من 21.92 ± 0.25 و السيرة الذاتية من 1٪.

الشكل 1: سير العمل للكشف عن الحمض النووي proviral من الدم الكامل ارتفعت مع خلايا 8e5-LAV إلى QPCR. (A) من اليسار إلى اليمين، وحدة فينا مستعدة، بعد إضافة الدم إلى الغشاء التقاط وبعد العازلة أضيف غسل. أنابيب (ب) QPCR مع الأقراص القبض على تمسك الشريط المزدوج المغلفة مع مزيج QPCR سيد المضافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الاتحاد الدولي للسباحة في منزل وحدة وإعداد أنبوب QPCR. (A) وتقع قرص غشاء القبض قطرها 8.35 ملم بين مربع 707 لوحة النشاف ورقة رقيقة من الشريط البارافين تحتوي على ثقب 7.14 ملم القطر في وسط بحيث كان مركزه ثقب في الشريط البارافين على القرص القبض على التطبيق المباشر للدم هي lysed من قبل الماصة. (ب) عالق البوليستر الشريط التشخيص 5.1 ملم المغلفة المزدوج على جانب من 200 أنبوب QPCR ميكرولتر. تتم إزالة بطانة الثانية من الشريط إلى فضح سطح لزجة لتطبيق القرص التقاط عندما تصبح جاهزة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: منحنى قياسي من HIV-1 proviral الحمض النووي العينات المفتعلة (A) المؤامرات التضخيم تم الحصول عليها من 100 ميكرولتر من 4 مكررات HIV-1 شمال شرقسلبية للالدم كله ارتفعت مع 4000 و 400 و 40 و 10 خلايا 8e5-LAV مع 500 نسخة / رد فعل الرقابة الداخلية خطوط الصلبة = المؤامرات التضخيم. خط منقط = عتبة. العمودي هو وحدة مضان والمحور السيني هو QPCR عدد دورة. (ب) منحنيات نموذجية من القيم الكلوروكوين تحسب من مؤامرة التضخيم مقابل عدد النسخ سجل الخلايا 8e5-LAV لكل 100 ميكرولتر من الدم الكامل. معادلة الخط: ص = -3.25x + 27.95. R² = 0.996. كفاءة PCR = 103.23٪ تحسب عن طريق الكفاءة = -1 + 10 (-1 / المنحدر) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الرقابة الداخلية تشير إلى أي QPCR تثبيط 500 نسخة Hydroxypyruvate اختزال التضخيم السيطرة البلازميد وأضاف في رد الفعل. صلب خطوط = المؤامرات التضخيم. خط منقط = عتبة. متوسط ​​الكلوروكوين من IC = 21.92 ± 0.25. تراوحت CQS 21،21-22،32. معامل الاختلاف (CV٪) = 1٪، N = 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنرال الكتريك = "1"> الجدول 1: متوسط ​​الكلوروكوين والانحراف المعياري (SD) ومعامل الاختلاف (CV٪) من 4000، 400، 40 و 10 نسخة من منحنى معيار 8e5-LAV مع استخراج الاتحاد الدولي للسباحة وHIV-1 الاشعال محددة و تحقيقات. N = 4. WB = الدم الكامل.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.