Method Article

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

DOI:

10.3791/54296

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقارن هذه الدراسة طريقتين مختلفتين لعزل الخلايا الأحادية البشرية للحصول على الخلايا المتغصنة في المختبر (DCs). يتم اختيار الخلايا الوحيدة عن طريق الالتزام أو إثرائها سلبا عن طريق الفصل المغناطيسي. ستتم مقارنة إنتاجية الخلايا الوحيدة وقابليتها للبقاء جنبا إلى جنب مع قابلية MDDC للبقاء والانتشار والتعبير عن علامة السطح CD11c / CD14 بين كلتا الطريقتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا المتغصنة (DCs) هي خلايا تقدم مستضد للجهاز المناعي تلعب دورا مهما في استجابات الخلايا الليمفاوية وآليات دفاع المضيف والتسبب في الالتهاب. كان عزل ودراسة البلدان النامية أمرا مهما في البحث البيولوجي بسبب خصائصها المميزة. على الرغم من أنها وسطاء رئيسيون أساسيون للجهاز المناعي ، إلا أن التيار المستمر نادر جدا في الدم ، حيث يمثل ما يقرب من 0.1 - 1٪ من إجمالي خلايا الدم أحادية النواة. لذلك ، تعتمد بدائل طرق العزل على تمايز DCs من الخلايا الوحيدة المعزولة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs). من الضروري مراعاة استخدام تقنيات العزل المناسبة التي تجمع بين البساطة والقدرة على تحمل التكاليف والنقاء العالي والإنتاجية العالية للخلايا. وفي هذه الدراسة، ستقارن طريقتان متميزتان لتوليد البلدان النامية. تم اختيار الخلايا الوحيدة عن طريق الالتزام أو إثرائها سلبا باستخدام إجراء الفصل المغناطيسي متبوعا بالتمايز إلى DCs مع IL-4 و GM-CSF. تم تقييم قابلية الحياى وانتشار الخلايا الوحيدة و MDDC والانتشار والنمط الظاهري باستخدام أصباغ الجدوى ومقايسة MTT وتحليل علامات سطح CD11c / CD14 عن طريق تصوير قياس التدفق الخلوي. على الرغم من أن طريقة الفصل المغناطيسي أسفرت عن نسبة أعلى بكثير من الخلايا الوحيدة ذات القدرة التكاثرية الأعلى عند مقارنتها بطريقة الالتصاق ، فقد أظهرت النتائج قدرة كلتا الطريقتين على توليد خلايا وحيدة قادرة على التكاثر والتمايز في وقت واحد إلى CD11c + MDDCs قابلة للحياة بعد سبعة أيام في الثقافة. أسفرت كلتا الطريقتين عن >70٪ CD11c + MDDCs بنسبة 70٪. لذلك ، توفر نتائجنا رؤى تساهم في تطوير طرق موثوقة لعزل وتوصيف البلدان النامية البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية (DCS) هي سطاء الأساسية للأنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. أنها تعمل على إحداث الاستجابة المناعية الأولية وتسهيل تطوير الذاكرة المناعية. هذه الخلايا هي المسؤولة في المقام الأول عن القبض على مستضد والهجرة وتحفيز الخلايا التائية، وبالتالي يشار إلى مستضد الخلايا كما المهنية (ناقلات الجنود المدرعة) 1 .Manipulation من البلدان النامية يمكن استخدامها عبر مجموعة واسعة من المجالات البحثية وفي إعداد سريرية لعلاج مختلفة الأمراض الالتهابية مثل فيروس نقص المناعة البشرية 6،7، سرطان 8، 9 أمراض المناعة الذاتية، والاستجابات التحسسية 10. كما تستخدم البلدان النامية للبحث تعاطي المخدرات من أجل حل آليات ومسارات مجهولة مثل تلك المرتبطة إدمان الكحول 11-14، إدمان المخدرات 13،15، والجمع بين العدوى وتعاطي المخدرات فيروس نقص المناعة البشرية 16-19. هذه الدراسات الجارية والدراسات البحثية المستقبلية طن مجال علم المناعة تجعل في الجيل المختبر من البلدان النامية في غاية الأهمية للبحث. ومع ذلك، هناك العديد من الصعوبات المرتبطة عزل البلدان النامية من الدم البشري لأنها تشكل فقط 0،1-1٪ من مجموع خلايا الدم وحيدات النوى 20.

حتى الآن، بعض الطرق الراسخة لتوليد البلدان النامية في المختبر يتكون من البلاستيك أو الزجاج التزام حيدات 21،22، والكثافة الطرد المركزي التدرج 23، محددا الفصل على علامة مثل خلية تنشيط المغناطيسية فرز 22، فلوري خلية تنشيط الفرز 24، واختيار إيجابية من وحيدات CD14 + باستخدام المغلفة ديكستران النانوية المغناطيسية 25، والعزلة السريع لحيدات العالية النقاء باستخدام مؤتمتة بالكامل السلبية تحديد الخلية 26. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لاختيار ما زال مثيرا للجدل. لذلك، لتحسين تقنيات الجيل العاصمة، وقد وضعت العديد من الطرق التينقاء هذه الخلايا يمكن أن يزيد بشكل كبير من التمايز من CD34 + السلف الخلايا وحيدات تنقية معزولة من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) 27. كما ذكر قبل، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع وشعبية لتوليد الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية (MDDCs) هو استكشاف قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،27. طريقة الالتزام هو طريقة سريعة ومباشرة التي لا تتطلب استخدام معدات معقدة. ومع ذلك، بعض مساوئ هذه العملية تشمل تلوث اللمفاويات، مرونة منخفضة، والوحيدات التلاعب عابر 28. طريقة بديلة لطريقة الالتزام هو العزلة المغناطيسية للحيدات من إجمالي PBMCs، خصوصا مع استخدام عدة تخصيب الوحيدات الإنسان، الذي يهدف إلى عزل حيدات من PBMCs عن طريق الانتقاء السلبية 26. خلال هذا الإجراء، يتم استهداف الخلايا غير المرغوبة لإزالة مع رباعي القسيماتمجمعات الأجسام المضادة والجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران. وميزة هذه الطريقة العزلة هي أن الخلايا المسمى غير المرغوب فيها يتم فصل باستخدام مغناطيس في حين أن الخلايا المستهدفة يمكن سكب بحرية قبالة في أنبوب جديد دون الحاجة للأعمدة. حتى الآن، مع توافر الاجسام المضادة المحددة التي يمكن تسمية السكان الخلية فريدة من نوعها، أصبحت تقنية الفصل المغناطيسي ليس مجرد وسيلة إضافية، بل ضرورة لعزل خلايا نادرة في مجال علم المناعة. على سبيل المثال، تقنيات مثل خلية الفرز المغناطيسي مع المتاحة تجاريا ممغطس أجهزة ماكينتوش-النانوية سهلت تطوير مناهج جديدة للبحوث والتطبيقات السريرية 22،29. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الدراسات والأبحاث الحديثة مقارنة الجيل العاصمة من أساليب الالتزام الوحيدات والتكنولوجيا بالاعمال نقاء العاصمة العالي وقابلية استخدام أجهزة ماكينتوش فصل حيدات 22،30.

ويعرض الدراسة الحاليةمقارنة بين طريقتين لتوليد البلدان النامية الإنسان من وحيدات معزولة عن PBMCs: 1) عزل الوحيدات من الالتزام و2) عزل الوحيدات عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام طقم تخصيب الوحيدات الإنسان التجارية. وتقدم هذه الدراسة أدلة تثبت أن اختيار الإجراء والفصل المغناطيسي السلبي لعزل حيدات يولد أعلى عائد من وحيدات مع عدم وجود اختلافات كبيرة في جدوى الوحيدات بالمقارنة مع حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام. في المقابل، وبعد سبعة أيام، وحيدات معزولة بواسطة مغناطيس متباينة في MDDCs مع قدرة التكاثري أعلى بكثير وأعلى كمية من الخلايا معربا عن إيجابية مزدوج (CD11c و+ / CD14 +) النمط الظاهري دون التأثير على قابلية MDDC. وعموما، تختلف الدراسة الحالية من الدراسات السابقة المشار إليها أعلاه لأنه يدل على قدرة كل من تقنيات لتوليد في وقت واحد وحيدات القادرة على التكاثر والتفريق في CD11c و+MDDCs (> 70٪) بعد سبعة أيام في الثقافة دون المساس حيويتها. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر النهج الحالي لتوصيف أول مرة من CD11c ومختلف / السكان CD14 MDDCs عن طريق التدفق الخلوي التصوير.

وخلاصة القول، منذ البلدان النامية تلعب دور أساسي فيما يتعلق البحوث في مجال علم المناعة، يجب أن تؤخذ العوامل المختلفة في الاعتبار عند النظر في كيفية تشتق منها وما هي الأساليب المستخدمة لعزل والثقافة لهم في المختبر. ولذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تقديم رؤى على طريقتين مختلفتين من العزلة الوحيدات وكيف أن هذه الأساليب تؤثر بشكل مختلف الجدوى الوحيدات والعائد تؤثر في نهاية المطاف شجيري بقاء الخلية، والانتشار، والنمط الظاهري. وسوف تسهم هذه النتائج إلى حد كبير في مجال علم المناعة، وسوف توفر بروتوكول مفصلة من العاصمة العزلة، وتنقية، والتوصيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم استعراض الدراسات الدم البشرية الشاملة والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) من وحدة الاستخبارات المالية، بروتوكول الاتحاد الدولي للرجبي موافقة الاتحاد الدولي للرجبي # 13-0440. تم شراؤها leukopaks الإنسان من بنك الدم المجتمع في ميامي، فلوريدا.

1. عزل PBMCs من قبل ستاندرد تقنية التدرج الكثافة

  1. إجراء التخفيف 1: 1 من الدم مع مخزنة المالحة 1X الفوسفات في قارورة T75.
  2. ماصة 15 مل من كثافة حل التدرج إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي وبعناية طبقة (25-30 مل / أنبوب) من الدم المخفف على هذا التدرج.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1200 x ج مع تسارع وتباطؤ 1 0.
  4. بعد الطرد المركزي، وجمع طبقة واجهة (خلايا الدم البيضاء) في جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (3 دقائق في 1080 x ج). تجاهل طاف في كل مرة.
  5. علاج الخلايا مع عازلة الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم الناشر (ACK) (ليز خلايا الدم الحمراء). إضافة 10 مل من العازلة وفيcubate لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1080 x ج وتجاهل طاف في كل مرة.
  7. حفظ بيليه، والتي سوف تحتوي على PBMCs.
  8. المضي قدما مع طريقة تنقية الوحيدات في الاختيار.

2. الوحيدات تنقية بواسطة أسلوب الالتزام

  1. إعداد كامل مستنبت الخلية التي تحتوي L-الجلوتامين (300 ملغ / مل)، وتستكمل مع البنسلين (50 U / مل) -streptomycin (50 ميكروغرام / مل) و 10٪ مصل بقري جنيني.
  2. السماح PBMCs على الانضمام لحوالي 2 ساعة قبل زرع لهم في قارورة T75 بتركيز 5 × 10 7 خلايا في 10 مل من المتوسط كاملة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ في حاضنة مرطب.
  3. بعد الحضانة، وإزالة الخلايا العائمة غير ملتصقة من قارورة الثقافة وبلطف غسل الخلايا الملتصقة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  4. احتضان الخلايا الملتصقة في كامل خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 2 ميكرولتر / مل من البشر محببة-السن الدنياتحفيز مستعمرة ophage عامل (GM-CSF) وانترلوكين 4 (IL-4) المخزنة في تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
  5. تغيير نصف المتوسط ​​وتجديد السيتوكينات كل 48 ساعة.
  6. السماح 5-7 أيام للتمايز وحيدات في MDDCs.

3. الوحيدات تنقية بواسطة طريقة الفصل المغناطيسي

  1. جمع PBMCs من تقنية التدرج الكثافة القياسية، وتصب في أنبوب البوليسترين 5 مل وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني عازلة في تركيز خلية / مل.
  2. إضافة كوكتيل تخصيب الوحيدات البشري باستخدام 50 ميكرولتر / خلايا مل، وتخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد الحضانة، إضافة الجزيئات المغناطيسية باستخدام 50 ميكرولتر / خلايا مل، وتخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. جلب تعليق خلية تصل إلى الحجم الكلي 2.5 مل بإضافة العازلة في برنامج تلفزيوني، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
  5. وضع أنبوب البوليسترين دون غطاء في الجهاز المغناطيسي وتوضع جانبا في RT لمدة 2.5 دقائق.
  6. بعد مرور فترة الحضانة وفي حركة واحدة متواصلة، والتقاط المغناطيس وتصب المطلوب جزء الوحيدات تنقيته في أنبوب الطرد المركزي 50 مل نظيفة.
  7. احتضان الخلايا الملتصقة في كامل خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 2 ميكرولتر / مل من البشر ومحببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) وانترلوكين 4 (IL-4) المخزنة في تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
  8. كل 48 ساعة، وتغير نصف المتوسط، وتدور باستمرار في 1080 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق بيليه مع وسائل الإعلام الجديدة (CRPMI) والسيتوكينات.
  9. السماح 5-7 أيام للتمايز وحيدات في MDDCs.

4. التريبان الأزرق الاستبعاد الجدوى الفحص

ملاحظة: استخدام هذا الأسلوب للحصول على العائد الخلية وسلامة PBMCs، وحيدات، وMDDCs.

  1. حصاد الخلايا باستخدام معيار التربسين- EDTA وتنفيذ يغسل من القوارير وبيليه الخلية باستخدام برنامج تلفزيوني. اعتمادا على حجم بيليه، وإعادةتعليق في 5 إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني بحل بيليه.
  2. في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، نفذ التخفيف 1: 1 من كاشف الأزرق التريبان مع بيليه خلية المخفف.
  3. من هذا المزيج، قسامة 10 ميكرولتر في خلية العد شريحة وقراءة النتائج باستخدام عداد الخلايا الآلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إذا عداد الخلايا الآلية غير متوفرة، وعدد خلايا مشابهة من الممكن استخدام عدادة الكريات أو عداد دليل.

5. MTT الفحص

  1. لوحة الخلايا بتركيز 4 × 10 4/100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة في كل بئر في لوحة 96-جيدا. اسمحوا 24 ساعة لخلايا للتكيف مع الثقافة.
  2. احتضان وتنفيذ قراءات في 0 (يوم 0)، 36 (يوم 3) و 84 ساعة (يوم 7) على التوالي.
  3. في الانتهاء من الحضانة المطلوب، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحدها.
  4. إعداد 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -2،5-ثنائي الفينيل حل بروميد نتروبلو (الإنتقالي العسكري) (5 ملغ / مل) وذلك بإضافة 10 مل من dimethسلفوكسيد YL ([دمس]) إلى 1 غرام من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS).
  5. إضافة 10 ميكرولتر (5 ملغ / مل) من محلول MTT إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
  6. بعد الحضانة، وإزالة supernatants التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وخليط الإنتقالي العسكري غير محول (حل أصفر اللون).
  7. إضافة 100 ميكرولتر من محلول SDS-DMSO إلى كل بئر واحتضان لمدة ساعة إضافية واحدة.
  8. قراءة الامتصاصية في 540 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة.

6. سطح الخلية تحليل تلطيخ بواسطة التصوير التدفق الخلوي

  1. بعد 7 أيام من التمايز من وحيدات تنقيته، الاستغناء 1X10 6 قسامات خلية من الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات إلى العدد المناسب من 1.5 مل أنابيب.
  2. بدء تلوين سطح الخلية من قبل خلايا منع استخدام 50 ميكرولتر من الحرارة المعطل (مرحبا) في مصل الدم البشري، في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد مرور فترة الحضانة، والخلايا الطرد المركزي في 720 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف.
  4. إلى الخلية بيلير، إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق منها (على سبيل المثال، ومكافحة CD11c وأو مكافحة CD14)، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. في أنابيب منفصلة، ​​وإعداد واحدة الملطخة تألقي عينات / مل) منذ تكون هناك حاجة إليها للحصول على تعويض.
  5. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل خلايا مرتين في 1 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في كل مرة في 720 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. حفظ الخلايا محمية من الضوء، وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني عازلة في تركيز خلية / 100 ميكرولتر لتحليل التدفق الخلوي.
  7. من أجل بوابة على خلايا قابلة للحياة، إضافة 1 ميكرولتر من دابي إلى كل أنبوب قبل الحصول على الخلايا على تدفق التصوير خلية واحدة الخلوي أداة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

7. التحليل الإحصائي

  1. إدخال جميع البيانات في جدول بيانات.
  2. مقارنة النتائج باستخدام اختبار (ت) للطالب و / أو في اتجاه واحد أنوفا حسب الاقتضاء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوحيدات العائد من الفصل المغناطيسي والعالي بالمقارنة مع الوحيدات الغلة عن طريق أسلوب الالتزام

البيانات الواردة في الشكل 1 عرض PBMC وعدد خلايا الوحيدات من خلال طريقة الاستبعاد التريبان الأزرق في يوم من عزل PBMCs وفصل حيدات. في المتوسط، شكلت حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام لنحو 6.2 في المئة من إجمالي PBMCs في حين ش...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وبناء على الصعوبات المعروفة للعزل وتوليد MDDCs من دم الإنسان، هذه الدراسة تهدف إلى تقديم مقارنة شاملة طريقتين راسخة لتوليد MDDCs. الطريقة الأولى مقارنة هو الطريقة التقليدية الراسخة لتوليد MDDCs من خلال استغلال قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،27. طريقة الالتزام بسرعة وفعالية من حيث التكلفة، ولا يتطلب استخدام معدات معقدة. ومع ذلك، بعض مساوئ هذه العملية تشمل تلوث اللمفاويات، مرونة منخفضة، الوحيدات عابرة 22،30،31 التلاعب. الأسلوب البد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يكشف جميع المؤلفين عن مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البحث مدعوم من قبل المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول ، وجائزة K99 / R00 AA021264. تم تلقي دعم مختبري إضافي كجزء من حزمة بدء التشغيل من قسم المناعة ، ومعهد علم الأدوية المناعي العصبي ، وكلية هربرت فيرثيم للطب ، ومكتب البحوث والتنمية الاقتصادية. تم دعم جيانا كاستيليرو من قبل NIH / NIGMS R25 GM061347. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03يجب استخدامه في RT
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Life Technologies10010-023
ACK Lysing BufferQuality Biological118-156-101
RPMI 1640 MidLife Technologies22400-089
Antibiotic-Anti Mycotic (100x)Life Technologies15240-062
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Life Technologies16000-044
RoboSep bufferStemCell20104
EasySep طقم تخصيب الخلايا الأحادية البشريةStemCell19059
TC20 عداد الخلايا الآليBio-Rad145-0101
FITC-Dextran:Sigma AldrichFD4-100MG
صبغة تريبان الزرقاء (0.4٪)Life Technologies15250-061
قارئ متعدد الأوضاع Biotek7131000
XTT كاشف حيوي لملح الصوديوم (XTT)سيجما ألدريتشX4626-100MG
كاشف حيوي ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMS)سيجما ألدريتشD8418-500ML
ثيازوليل أزرق تيترازوليوم بروميد (MTT)سيجما ألدريتشm5655-500MG
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Bio-Rad161-0302
فينازين ميثوسلفات (DMSO)سيجما ألدريتشP9626-1G
معطل (HI) مصل بشريكيميائيS1-100ML
أككوري C6 مقياس التدفقالخلوي BD Accuri653119
FlowSight Amnis Flow CellularEMD Millipore100300

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682(2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

Related Articles