مقالة منهجية

التصوير الكالسيوم في

8.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54311

⸱

أغسطس 6, 2016

 ,  , 
1Department of Zoology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

الملخص

تنشيط البويضة هو عملية عالمية تتضمن سلسلة من الأحداث للسماح للبويضة المخصبة بإكمال الانقسام الاختزالي وبدء التطور الجنيني. أحد جوانب تنشيط البويضات ، المحفوظة في جميع الكائنات الحية التي تم فحصها ، هو التغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2+) الذي يطلق عليه غالبا اسم "موجة Ca2+". في حين أن سرعة وعدد تذبذبات موجة Ca2+ تختلف بين الأنواع ، فإن التغيير في Ca2+ داخل الخلايا هو المفتاح في إحداث الأحداث الأساسية للتطور الجنيني. تشمل هذه التغييرات استئناف دورة الخلية ، وتنظيم mRNA ، وإفراز الخلايا الحبيبية القشرية ، وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي.

في ذبابة الفاكهة الناضجة ، يحدث التنشيط في قناة البيض الأنثوية قبل الإخصاب ، مما يؤدي إلى سلسلة من الأحداث المعتمدة على Ca2+. نقدم هنا بروتوكولا لتصوير موجة Ca2+ في ذبابة الفاكهة. يوفر هذا النهج نظاما نموذجيا قابلا للتلاعب لاستجواب آلية موجة Ca2+ والتغيرات النهائية المرتبطة بها.

المقدمة

أي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيز على البيض (البويضة) تفعيل عنصرا المحافظ في جميع الكائنات درس 1،2. هذا الحدث يبدأ مجموعة واسعة من العمليات معتمد على الكالسيوم 2+، بما في ذلك استئناف دورة الخلية وترجمة من mRNAs المخزنة. وكان نتيجة لهذا الشرط ل Ca 2+، تصور التغييرات عابرة في الخلايا تركيزات الكالسيوم 2+ من الفائدة الرئيسية.

تاريخيا، تم اختيار الكائنات نموذج للدراسات على تفعيل البيض على أساس حجم ومدى توافر بيضها. وقد تم استخدام نهج التصور المختلفة لمتابعة وقياس التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التركيزات في هذه الأنظمة، بما في ذلك: aequorin photoprotein في الأسماك الميداكا 3؛ كاليفورنيا الأصباغ الفلورية الحساسة 2+ مثل FURA-2 في قنفذ البحر والهامستر 4،5. والكالسيوم الأخضر-1-ديكستران في القيطم 6.

حولت توليد وتحسين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) القدرة على تصور كا 2+ ديناميكية في الجسم الحي 7. يتم التعبير عن هذه التركيبات الوراثية في أنسجة معينة وتحد من الحاجة إلى الاستعدادات الأنسجة الغازية 8.

GCaMPs هي بروتين فلوري (GFP) فئة المستندة الخضراء GECIs التي كانت فعالة جدا بسبب بهم عالية الكالسيوم 2+ تقارب، نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقدرة على تخصيص 9-11. في وجود الكالسيوم 2+، مجمع GCaMP يخضع لسلسلة من التغييرات متعلق بتكوين، بدءا من الربط من الكالسيوم 2+ لكالمودولين، أن النتائج في زيادة كثافة الفلورسنت من عنصر GFP 9.

وقد استخدمت GCaMPs نطاق واسع في الأبحاث على الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة لرؤية التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا 12. في تطبيق والأخيرةعلى التكنولوجيا GCaMP لتصور كا 2+ في البيض ذبابة الفاكهة الناضجة قد كشفت عن وجود واحدة عابرة الكالسيوم 2+ موجة في تنشيط البويضة 13،14. يمكن تصور موجة الكالسيوم 2+ في تضخم منخفض خلال الإباضة في الجسم الحي 13 أو في أعلى التكبير باستخدام المجراة سابقا تفعيل الفحص 13،14. في مقايسة خارج الجسم، يتم عزل البويضات الناضجة من المبيض الفردية وتفعيلها باستخدام محلول منخفض التوتر، ويشار إلى عازلة التنشيط، وهو ما ثبت لتلخيص أحداث في الجسم الحي تفعيل 15-17.

هذا الاختبار خارج الحي تمكن من السهل عالية الدقة تصور كا 2+ موجة تحت ظروف تجريبية مختلفة بما في ذلك تعطيل الدوائية، التلاعب المادية والمسوخ الوراثية. توضح هذه المقالة إعداد البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لالسابقين تنشيط الجسم الحي والعشرينالبريد المجهري لاحقة تستخدم لتصور موجة الكالسيوم 2+ باستخدام GCaMP. هذا النهج يمكن استخدامها لاختبار بدء والسيطرة على موجة الكالسيوم 2+ وتحقيق النتائج النهائية.

البروتوكول

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. الاستعداد للتشريح

ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للE. Gavis، جامعة برينستون وويل آخرون. آل 18. نفذ الخطوات التالية قبل يومين من التصوير.

  1. خذ قنينة الطيران التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل من المواد الغذائية الصلبة وإضافة كمية صغيرة من الخميرة المجففة إلى زاوية واحدة، وأقل من 1 غرام كافية.
    ملاحظة: للحصول على معلومات حول قارورة ذبابة أو الطعام انظر "الصيانة ذبابة الفاكهة" 19.
  2. إضافة 1-3 قطرات من الماء لترطيب الخميرة.
  3. تعيين قارورة جانبا في زاوية 45 درجة والسماح 3-5 دقيقة لخميرة لتناول الماء.
  4. في حين أن الخميرة يمتص الماء، حدد زجاجة من الذباب معربا عن UASt- MYR GCaMP5 20 يقودها حوض-VP16GAL4 (المشار إليها باسم GCaMP5) التي ظهرت في الآونة الأخيرة (أ myristoyوقد تم اختيار النموذج ذا الصلة من GCaMP5 لتوفير إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء من خلال الربط في GECI إلى الغشاء في البيضة).
  5. تخدير الذباب في زجاجة مع غاز ثاني أكسيد الكربون 2. تأكد للحفاظ على زجاجة المقلوب حتى لا تفقد الذباب في الغذاء الرطب.
  6. تلميح الذباب تخدير على وسادة CO 2 ونوع 10-15 إناث و 5 ذكور باستخدام الفرشاة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: من هو المعيار ليشمل الذكور إلى الإناث توفير صحية للتشريح.
  7. عندما القارورة من الخطوة 1.3 جاهزة، إضافة الذباب المحدد إلى القارورة. احرص على إبقاء الأفقي قارورة حتى تصبح الذباب النشطة.
  8. ضع القارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 36 ساعة.
  9. العودة الذباب المتبقية من لوحة CO 2 إلى زجاجة أو تجاهل.

2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض

ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للويل وآخرون. الله. 18.

  1. بعد 36 ساعة، تخدير الذباب من القنينة yeasted مع CO 2.
  2. مرة واحدة يتم تخدير الذباب داخل القارورة نصيحة لهم على لوحة CO 2 يمكن فرزها مع فرشاة الطلاء تحت المجهر تشريح.
  3. اختيار الإناث.
  4. عزل اثنين من المبيضين من الإناث. لبروتوكول مفصلة الكامل نرى ويل آخرون. آل 18. باختصار:
    1. وضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون المؤكسج (سلسلة 95) على رقم 1.5، 22 × 40 مم ساترة.
    2. فهم الأنثى مع ملقط في الجزء الأمامي من البطن.
    3. عقد الأنثى تحت المجهر تشريح، استخدم مجموعة ثانية من ملقط لإزالة بلطف الخلفي من الإناث.
    4. تمحو النسيج الخلفي من ملقط الثانية.
    5. ضغط على تجويف البطن مع ملقط الثانية من الجزء الأمامي إلى الخلفي من البطن. يجب المبايض مبهمة اثنين التمسك ملقط عند الخروج من الاناثجنيه.
    6. لمس المبيضين في الزيت.
    7. إزالة أي نوع من الأنسجة من ملقط من قبل محو ملقط.
    8. كرر هذه الخطوات (2.4.1 - 2.4.7) للحصول على ثلاثة coverslips، كل المبايض تحتوي على من ذبابة واحدة.

3. عزل الأفراد الناضجة البيض

  1. تحت المجهر تشريح القياسية مع التكبير المقرر أن 4X، على ساترة الأولى من الخطوة 2.4، فصل اثنين من المبيضين عن طريق تمزيق قناة البيض.
  2. يعرض زوج من ملقط مغلقة في وسط المبيض واحد، مع الحرص على عدم ثقب أي غرف البيض.
  3. إدراج التحقيق تشريح القياسية في وسط المبيض بجانب ملقط مغلقة.
  4. سحب بلطف التحقيق تشريح عن طريق المبيض نحو القطب الخلفي، حيث توجد البيض نضجا (المرحلة 14 غرف البيض).
  5. كرر الخطوات من 3،1-3،4 2-5 مرات اعتمادا على حجم المبيض وعدد من البيض.
    ملاحظة: إضافة CO 2 عادة ما يسبب ترسب بويضة واحدة والتي سوف تظهر أكبر مع الزوائد ظهري أثار من البيض أودعت مسبقا. يجب التخلص من هذه البويضة للتصوير لأنه قد تم تفعيلها داخل الأنثى.
    ملاحظة: من المحتمل أن تفصل بسهولة من النسيج الضام المبيض البيض الناضجة.
  6. إذا لم يكن هناك البيض نضجا مرئية خارج المبيض، ومواصلة بلطف إغاظة مع لجنة التحقيق تشريح.
  7. مرة واحدة البيض نضجا واضحة على ساترة خارج المبيض، والمناورة 3-5 في خط في وسط ساترة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتشغيل التحقيق بلطف على طول الجانب من البيض.
    ملاحظة: تجنب سحب على الزوائد الظهرية وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف البيض.
    ملاحظة: اعتمادا على التصوير في المستقبل انشاء، محاذاة البيض حوالي 200 ميكرون وبصرف النظر عمودي على ساترة لمنطقة التصوير القصوى.
  8. مرة واحدة الانحياز، وإزالة ما تبقى من أنسجة المبيض عن طريق سحبه بعيدا عن البيض الانحياز استخدام وorceps.
  9. إزالة الزيت الزائد بواسطة اللمس مع زاوية مسح لفحص طبي. يجب الحرص على عدم لمس البيض ناضجة مع الطبية مسح البيض الناضجة التي يتم الاتصال بها سوف تضيع.
  10. رسم التقاطع على ساترة مع علامة لتبسيط تحديد العينة تحت المجهر.
  11. تعيين ساترة في مكان آمن وترك الدوائر البيض مستعدة على ساترة للراحة لمدة 5-10 دقائق. وهذا يسمح للبيضة ليستقر في مجال النفط. عينات يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ساعة بعد تشريح.
  12. كرر الخطوات من 3،1-3،11 لبقية لل coverslips مع المبايض عليها.

4. إعداد للتصوير

  1. جلب عازلة تفعيل استعداد 15 إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: عازلة التنشيط هو العازلة منخفض التوتر: 3.3 ملي ناه 2 ص 4، 16.6 ملي KH 2 PO 4، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 5٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000، 2 مم CaCl 2، جلبت لدرجة الحموضة 6.4 مع 1: 5 نسبة هيدروكسيد الصوديوم: KOH.لمزيد من المعلومات راجع Mahowald، 1983 15. أجزاء مأخوذة من العازلة التنشيط يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة أشهر، وعند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. بعناية نقل coverslips مستعدة العازلة التنشيط والماصات الزجاجية إلى مرفق التصوير.
    ملاحظة: A-حقل واسع، متحد، القرص الغزل أو ضوء المجهر ورقة يمكن استخدامها. نحن نوصي باستخدام مجهر مقلوب. وقد تم الحصول على نتائجنا تمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر.
  3. وينبغي اختيار هدف مناسب لتصوير البويضة الناضجة بأكمله (هنا: 20X 0.7 NA).
  4. تركيب أول ساترة المعدة إلى المرحلة المجهر. الحرص على عدم كسر لل coverslips على المسرح.
  5. نوعيا تحديد مجال الرؤية مع غرفة بيضة ناضجة من أجل التنشيط. لا صورة ثقب غرف البيض أو تلك مع blebbing في الغشاء.
    ملاحظة: للحصول على خطوات 4،6-4،7، وأوامر البرنامج تختلف تبعا المجهر والشركة المصنعة.
  6. تعيين الفقرة التصويرمتر عن الإثارة القياسية GFP (488 نانومتر) والانبعاثات (500-580 نانومتر). كذلك وضعت وجهة نظر مشرق الميدان من أجل رؤية وتوجيه البويضة الناضجة والنفط النازحين.
  7. اختيار أقل Z-الطائرة حيث البيض نضجا واضحة ووضع كامل Z-كومة الواجب اتخاذها لمدة 40 ميكرون في ما يقرب من 2 ميكرون لكل خطوة. تعيين المعلمات حتى لا يكون هناك أي تأخير بين اكتساب Z-المكدس. تعيين سلسلة من الوقت لالتقاط ما يقرب من 30 دقيقة.

تفعيل 5. التصوير فيفو السابقين البيض

  1. بدء التقاط الصور.
  2. انتظر 1-2 كامل Z-المداخن التي سيتم اكتسابها. وهذا يدل على البويضة الناضجة قبل التنشيط.
  3. سحب ما يقرب من 300 ميكرولتر من العازلة التنشيط إلى ماصة الزجاج.
  4. تحديد المواقع غيض من ماصة زجاجية تحتوي عازلة تفعيل بزاوية 45 درجة فوق ساترة، تتحرك ببطء ماصة في مسار الشعاع حتى يتم مباشرة فوق البويضة الناضجة التي يجري تصويرها. ماصة الزجاج ينبغييكون 1-2 سم فوق الزيت.
  5. إضافة 1-2 قطرات من العازلة التنشيط في أقل من 5 ثوان من ماصة الزجاج. وهذا ينبغي أن تحل محل النفط. تجنب إضافة عازلة تفعيل الزائد أو لمس البيض مع ماصة الزجاج لأنها يمكن أن تسبب تشريد البويضة الناضجة. والحرص على عدم لمس ساترة مع ماصة وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغيير في الطائرة أو فقاعات الهواء التنسيق لتشكيل في مجال النفط الغمر بين الهدف وساترة.
  6. في حين مضيفا عازلة تفعيل خلال الحصول على الصور، والتحقق من قناة مشرق الميدان للتأكد من أن النفط قد نزحوا من المنطقة العازلة التنشيط.
    ملاحظة: سوف تظهر هذه الجملة لأول مرة كما ظل بسبب ماصة كسر مسار الشعاع ولكن سوف يؤدي أيضا إلى ظهور قطرات النفط الصغيرة. يمكن أن تبقى بعض قطرات النفط المرتبطة البويضة الناضجة التي سوف تؤثر على النتائج التجريبية وجودة الصورة.
  7. إذا لم يتم النازحين النفط من إضافة الأولية من تكرار عازلة تفعيل الخطوات 5،4-50.6.
  8. بمجرد النازحين النفط بنجاح، والسماح للسلاسل الزمنية لتشغيل حتى الانتهاء.
    ملاحظة: نظرا لتورم من البويضات في التنشيط، وبعض الدوائر البيض تتحرك بشكل كبير من المستوى البؤري أو مجال الرؤية على إضافة عازلة التنشيط. في هذا الوضع، والتوقف عن اقتناء وتركيب ساترة المقبلة.
  9. بعد اكتمال تسلسل الحصول على الصور، وحفظ البيانات.

6. بعد اكتساب معالجة الصور

  1. فتح مجموعة البيانات باستخدام فيجي (http://fiji.sc/Downloads#Fiji)، أو ما يعادلها برامج معالجة الصور، وحدد الملفات ذات الصلة لتحليلها.
  2. لبناء الإسقاط من البيانات التي حصل عليها تحديد: صورة> الأكوام> Z المشروع.
  3. تحديد بداية Z-شريحة ووقف Z-شريحة، وعادة الفرع بأكمله. اختر نوع الإسقاط، عادة لمجموعة 'كثافة ماكس ". خانة علامة 'كل الأطر الزمنية "لتطبيق الإعدادات المحددة إلى سلسلة كاملة.
  4. إذاوقد تم تصوير أكثر من قناة واحدة الفلورسنت، استخدم أداة القنوات لتمكين التنقل بين الألوان، وجعل المركبة، أو جعل الرمادي صورة. صورة مختارة> الألوان> القنوات الأداة.
  5. لضبط سطوع الصورة وعلى النقيض اختر صورة> ضبط> السطوع / التباين.
  6. لتصدير صورة واحدة، نقل المنزلق الزمني لإطار ذات الصلة، وحدد ملف> حفظ باسم> الحياة السياسية في فرنسا، أو أي شكل المفضل.
  7. اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ.
    سوف نلاحظ معدل الإطار من برامج التصوير تكون هناك حاجة لإعطاء الطابع الزمني على الصورة.
  8. تصدير سلسلة زمنية كفيلم حدد: ملف> حفظ باسم> AVI، ثم حدد معدل الإطار (~ 7 إطارات في الثانية الواحدة).
  9. اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ.
  10. لحفظ الملف المعدل في شكل فيجي، حدد ملف> حفظ.

النتائج

هنا لقد أثبتنا كيفية تحضير البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لتفعيل خارج الحي. البيض تعبر عن GECI تمكين التصوير من الكالسيوم 2+ ديناميكية في تنشيط البويضة وبداية التطور الجنيني (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أن الاعتماد على GCaMP المستخدمة، وتحديدا وجود مجموعة myristoyl، قد يكون لها نتائج اختلافات نوعية طفيفة 13 14. لقد أثبتنا أيضا دور للالأكتين وظيفية خلال تفعيل البيض من خلال إضافة المانع من بلمرة الأكتين، مثبط حركة الخلايا D، إلى المخزن المؤقت تفعيل (الشكل 2) 14.

وحفظها ومتطلبات الهيكل الخلوي في تنشيط البويضة. في C. ايليجانس بعد الإخصاب، وإعادة تنظيم مكونات هيكل الخلية لإعداد الجنين خلية واحدة لدوري الدرجة الاولى غير متناظرة 21،22. في قنفذ البحر وانقطاع cytoskeleوقد تبين التل إعادة تنظيم التالية تفعيل تؤثر على دورة الخلية عن طريق منع مقلص تشكيل حلقة 23. يبقى دور الأكتين في التوسط موجة الكالسيوم 2+ وظيفة المصب لها في تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة إلى أن توضح تماما.

في ذبابة الفاكهة، وشارك في تصور كا 2+ موجة والأكتين الهيكل الخلوي يمكن تحقيقه باستخدام هذا خارج الحي تفعيل الفحص. سلسلة زمنية من قنوات متعددة يمكن الحصول عليها وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يمكن أن تتطابق مع التغييرات في المؤسسة الأكتين في البويضة (الشكل 3).

figure-results-1
الشكل 1: واحدة الكالسيوم 2+ موجة في سلسلة ذبابة الفاكهة البيض وقت التنشيط من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 بعد لddition العازلة تفعيل (ه). ارتفاع الكالسيوم حشوية 2+ ينشأ في القطب الخلفي (B) ويكاثر (BF) مع سرعة متوسط ​​ما يقرب من 1.5 ميكرون / ثانية. وعادة ما لوحظ بدء موجة بعد 3 دقائق من إضافة العازلة التنشيط. بعد التنشيط، ومستويات الكالسيوم داخل الخلايا من البويضة الناضجة ترجع إلى ما قبل تفعيل مستويات (G، H). رؤية فيلم التكميلي 1 (مجموع الوقت 33 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إضافة مثبط حركة الخلايا D لتنشيط العازلة يشوش كاليفورنيا2+ انتشار الموجات. السلاسل الزمنية من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 التالية إضافة عازلة تفعيل تحتوي على 10 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D التركيز النهائي (ه). في حين يتم بدء 2+ موجة الكالسيوم في القطب الخلفي (A)، وخطر ذلك ولا تصل الأمامي من البيضة (F) (السهام البيضاء للدلالة على جبهة الموجة). أبعد وقد لوحظت تغييرات الكالسيوم 2+ أكثر من 30 دقيقة). رؤية فيلم التكميلي 2 (مجموع الوقت 30 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل (3): شارك في التصور أكتين والكالسيوم 2+ في Eتفعيل زز في سلسلة ذبابة الفاكهة. وقت خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 (سماوي) وUASp -F-Tractin.tdTomato (أرجواني) بعد إضافة عازلة تفعيل (ه). و2+ موجة الكالسيوم يبادر من القطب الخلفي وتسترد كما في الشكل 1. يبدو أكتين أن تغيير مع مرور الوقت، السهام البيضاء (A مباراة H). ومن المقرر أن تنقل العينة أثناء التقاط الصور لعدم وجود الكالسيوم 2+ الكشف عن إشارة في وسط البويضة الناضجة. الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا البروتوكول هي عزل البويضات الناضجة دون ضرر. يمكن تحقيق ذلك عن طريق مناورة غير اليهودي للبيض باستخدام مسبار التشريح. ستمكن الممارسة من تنفيذ هذا التلاعب دون الإضرار بالبويضات. الخطوة الثانية الحاسمة هي تجنب فقدان العينة عند تطبيق مخزن التنشيط على البيضة الناضجة في الزيت. يجب أن يتم تطبيق المخزن المؤقت للتنشيط ببطء ودون ملامسة الغطاء. قد تكون هذه الخطوة صعبة إذا كان إعداد المجهر لا يسمح بالوصول السهل إلى العينة. ينصح بنقل الأجزاء الإبطية من المجهر ، مثل حاضنة درجة الحرارة.

يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول من أجل تصور العوامل الأخرى الموسومة بالفلورسنت ، بدلا من Ca2+ عند تنشيط البيض. بشكل عام ، يمكن تحليل المراحل المختلفة من تطور ذبابة الفاكهة أو نتائج إضافة مخزن مؤقت مختلف باستخدام هذا البروتوكول.

قد تكون هناك حاجة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لم تكن الإعدادات الموجودة على المجهر مثالية لتصور الإشارة من العينة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زيادة أو تقليل طاقة الليزر ، وتغيير نطاق الالتقاط وضبط معلمات Z-stack. قد تكون مشكلة أخرى هي خروج البيض باستمرار من مجال الرؤية عند إضافة مخزن مؤقت للتنشيط. إذا حدث هذا بانتظام ، اترك البيض الناضج يستقر على الأغطية لفترة أطول من الوقت ، من 15 إلى 20 دقيقة. احذر من أن استخدام زيت عالي اللزوجة سيغير إزاحة الزيت عن طريق التنشيط العازل.

هذه التقنية المعروضة هنا محدودة بمسافة العمل للهدف ، وجفاف البويضات الناضجة والقدرة على تشريح البويضات الناضجة دون ضرر. ومع ذلك ، عند مقارنتها بطرق التصوير في الجسم الحي حيث تمر البويضة الناضجة عبر الأنثى البالغة وتترسب 13 ، فإن طريقتنا تتيح المزيد من الدقة المكانية ، وخيار التلاعب الجسدي بالبويضة الناضجة قبل التنشيط والقدرة على اختبار دور تنشيط البويضة دون الإخصاب.

هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة لهذه التقنية ، بما في ذلك اختبار تركيبات المراسل للمكونات الخلوية عند تنشيط البويضة وتصور موجة Ca2+ في خلفيات متحولة 14،24. جنبا إلى جنب مع الأدوات التجريبية والوراثية ، يتيح اختبار تنشيط البيض خارج الجسم الحي المقدم هنا دراسة الزناد والانتشار والتأثيرات النهائية لموجة Ca2+ المحفوظة عالميا.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لورا بامبتون، أليكس ديفيدسون، ريتشارد بارتون، Arita أتشاريا للحصول على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة. ماريانا Wolfner لمناقشة تفعيل البيض. مات ايلاندز لدعم التصوير. ونان هو جين تاو عن الدعم العام في المختبر.

وأيد هذا العمل من قبل جامعة كامبريدج، للرماية لTTW [منحة رقم 097814].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخميرة الجافة النشطةفليشمان s# 2192
تشريح المجهرLeicaMZ6ستعمل مختلفة
مصباحMircotec الألياف البصريةMF0-90ستعمل مختلفة
مناديل طبيةKimberly-Clark CorporationKLEW3020 
قلم تحديدStabilo841/46OHPen عالمي ، أسود - متوفر في معظم المتاجر الثابتة. عرض دقيق 0.4 مم
CO2< / sub> pad  Genesee Scientific59-114 (789060 Dutscher)
زلة الغطاء رقم 1.5 ، 22 × 50 ممدولي- No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mmMenzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T & nbsp ؛
زيت الهالوكربون ، سلسلة 95شركة منتجات الهالوكربون.الموزع في أوروبا:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 SVWR Chemicals24627.188يمكن استخدامها بدلا من زيت الهالوكربون ، سلسلة 95
FulpsFine Science Tools11252-00في حين أن هذه الأداة يجب أن تكون نظيفة ، فإن استخدام الأوتوكلاف ليس ضروريا ، فالإيثانول سيكون كافيا.
مسبارأدوات العلومالدقيقة 10140-01
ماصة زجاجيةفيشربراند ،FB50251ماصات باستور ، زجاج ، غير متصل ، طول 150 مم   ؛
قارورةريجينا للصناعاتP1014GPPS  80 مم × 25 مم

المراجع

  1. Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
  2. Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
  3. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
  4. Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
  5. Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
  6. Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
  7. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
  8. Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
  9. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  11. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  13. Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
  14. York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
  15. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  16. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  17. Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
  18. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
  19. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  20. Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
  21. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  22. Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
  23. Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23(2004).
  24. Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Z Stack
التصوير الكالسيوم في
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.