مقالة منهجية

سرعة الكشف الجزيئي والتمايز من فيروسات الأنفلونزا A و B

15.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54312

⸱

يناير 30, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف فحص سريع، استنادا الجزيئي الأنفلونزا A و B. الأنفلونزا فحص يكشف كل هدف خلال 15 دقيقة من خلال توظيف التضخيم متساوي مع الاشعال مخصصة للانفلونزا تليها الكشف عن الهدف مع تحقيقات منارة الجزيئية. الأنفلونزا A و B الفحص هو سهل الاستعمال ويتطلب الحد الأدنى من التدريب العملي على الوقت لتنفيذ.

الملخص

الانفلونزا هي مرض تنفسي معدي يسببه فيروس الإنفلونزا A و B في البشر ويسبب قدرا كبيرا من معدلات الاعتلال والوفيات كل عام. الأنفلونزا A و B فحص كان أول اختبار انفلونزا السريع الجزيئي التنازل CLIA المتاحة. الأنفلونزا A و B اختبار يعمل من خلال توظيف التضخيم متساوي مع الاشعال مخصصة للانفلونزا تليها الكشف عن الهدف مع تحقيقات منارة الجزيئية. هنا، أداء الأنفلونزا A و B فحص على المجمدة، أرشفة مسحة البلعوم (NPS) العينات المخزنة في المتوسط ​​النقل الفيروسي (VTM) وبالمقارنة مع فحص لوحة في الجهاز التنفسي.

تم تقييم أداء الأنفلونزا A و B فحص عن طريق مقارنة النتائج إلى طريقة لوحة إشارة الجهاز التنفسي. وكانت حساسية لمجموع فيروس الأنفلونزا A 67.5٪ (95٪ CI (CI)، 56،6-78،5) وكانت خصوصية 86.9٪ (CI، 71،0-100). لفيروس أنفلونزا اختبار B، وكانت حساسية وخصوصية 90.2٪ (CI، 68،5-100) و98،8٪ (CI، 68،5-100)، على التوالي.

هذا النظام لديه ميزة من وقت الاختبار أقصر بكثير من أي فحص الجزيئي المتاحة حاليا الآخرين وإجراء بسيط، خالية من ماصة يعمل على مغلقة، ونظام متكامل صغيرة البصمة. وعموما، فإن الإنفلونزا A و B فحص تقييمها في هذه الدراسة لديه القدرة ليكون بمثابة نقطة من الرعاية أنفلونزا السريع الاختبار التشخيصي.

المقدمة

عدوى فيروس الانفلونزا تؤدي إلى قدر كبير من معدلات الاعتلال والوفيات كل عام 1، 2، 3. يتميز الانفلونزا غير معقدة أعراض الدستورية والجهاز التنفسي مثل الحمى، وألم عضلي، صداع، وسعال غير منتج 4 و 5. الأفراد الأكبر سنا، والأطفال الصغار، والمرضى الذين يعانون من نقص المناعة، والمرضى الذين يعانون من أمراض المصاحبة الأساسية هي في خطر أعلى للمضاعفات خطيرة مثل الالتهاب الرئوي، والتهاب عضلة القلب، وأمراض الجهاز العصبي المركزي، أو وفاة 6 و 7.

عدوى الإنفلونزا هي فريدة من نوعها من الفيروسات التنفسية الأخرى في أن الإدارة سريعة من العلاج المضاد للفيروسات خلال 48 ساعة من ظهور الأعراض يمكن أن تقلل من شدة المرض وطول 8. وقد تم التعرف السريع على الانفلونزا أيضاتبين للحد من استخدام المضادات الحيوية غير الضرورية 9 و 10. وعلاوة على ذلك، والمرضى في المستشفى مع عدوى الإنفلونزا يجب أن توضع في غرف معزولة مع الاحتياطات المناسبة لمكافحة العدوى. ومع ذلك، أمراض الجهاز التنفسي التي تسببها الفيروسات غير الأنفلونزا يمكن أن يكون من الصعب التمييز سريريا من الأنفلونزا. لهذا السبب، اختبار سريع ودقيق التشخيص للأنفلونزا مهم جدا لإدارة المريض السريرية.

تتوفر للكشف وتحديد فيروسات الأنفلونزا عدة فحوصات. وتستخدم السريع مستضد أنفلونزا اختبارات الكشف (RIDTs) على نطاق واسع في الممارسة السريرية كنقطة من الرعاية الاختبارات لأنها سهلة الاستخدام وتوفير النتائج في غضون 15 إلى 30 دقيقة 11، 12؛ ومع ذلك، حساسيتهم تختلف على نطاق واسع (10-80٪) اعتمادا على الشركة المصنعة والسكان التي يجري اختبارها، ونوع الإنفلونزا، وsubtyبي 13 و 14 و 15. المقايسات مضان المباشرة (DFAS) توفر الحساسيات متفوقة على RIDTs، ولكن في وقت المعالجة هو أكبر (~ 3 ساعة)، ويجب أن تستكمل من قبل التقنيين المهرة 16، 17. وكانت ثقافة الفيروسية المعيار الذهبي لتشخيص الإنفلونزا، وتحسنت حساسية على كل RIDTs وDFAS 18. ومع ذلك، يمكن أنفلونزا ثقافة الفيروسية تتخذ في أي مكان 2-14 د لاستكمال، وتناقص فائدتها في مساعدة إدارة المريض 19. وأخيرا، النووية اختبارات حمض التضخيم (NAAT) قد حلت محل تقنيات الثقافة باعتبارها المعيار الذهبي الجديد في تشخيص الأنفلونزا. تعتبر NAAT ليكون لها أكبر حساسية للكشف عن انفلونزا في غضون ساعات قليلة. ومع ذلك، NAAT هي فحوصات أغلى وتتطلب معدات متخصصة وخبراء التكنولوجيا لأداء 5 ، 20، 21، 22، 23، 24، 25.

الأنفلونزا A و B فحص الموصوفة هنا هو أول الجزيئي اختبار انفلونزا السريع-التنازل عن CLIA ما هو متاح بسهولة. هذا الاختبار يعمل من خلال توظيف رد الفعل الخدش نوكلياز داخلية التضخيم (قرب) الذي يستخدم التضخيم متساوي مع الاشعال مخصصة للانفلونزا تليها الكشف عن الهدف مع تحقيقات منارة الجزيئية. هذا الاختبار يميز الأنفلونزا A من B، يتطلب 2 دقيقة لإعداد وتجهيز عينة واحدة، ويتطلب ما مجموعه 15 دقيقة لإكمال.

هنا، نقدم بروتوكول لفحص الأنفلونزا A & B. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بيانات العينة وضع مقارنة أداء الأنفلونزا A و B فحص على مسحة البلعوم المحفوظة (NPS) الأصناف المدرجة المخزنة في المتوسط ​​النقل الفيروسي (VTM) إلى الجهاز التنفسي فحص لوحة آخر الممرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأخلاق بيان: إن استخدام العينات السريرية أن تتم الموافقة عليها وفقا للمبادئ التوجيهية للمركز السرطان مجلس المراجعة المؤسسية ميموريال سلون كيترينج على اليسار.

1. قبل تشغيل الفحص

ملاحظة: الأنفلونزا A و B فحص والموافقة على عينات مسحة البلعوم ومسحات البلعوم المخزنة في وسائل الإعلام نقل الفيروسية. يتم تضمين مسحات في عدة ويجب استخدامها لتحقيق الأداء الأمثل. ومع ذلك، رايون، رغوة، توافدوا يمكن أيضا مسحات أو مسحات الأنف البوليستر أن تستخدم لجمع عينات مسحات الأنف.

  1. لجمع مسحة عينة الأنف، تضاف مسحة في فتحة الأنف الذي يحتوي على الصرف الأكثر وضوحا أو التي هي الأكثر ازدحاما. مع دوران طيف، ودفع مسحة في الأنف حتى يتحقق المقاومة وتناوب عدة مرات ضد جدار الأنف قبل إزالة ببطء من الأنف. تخزين مسحات ونقلها في قارورة تحتوي على 3 مل من وسائل الاعلام وسائل النقل الفيروسي (VTM).
    ملاحظة: عناية خاصة لapproprيجب أن تؤخذ جمع العينات iate كما كفاية جمع العينات قد تسفر عن نتائج خاطئة.
    ملاحظة: يجب أن يتم اختبار عينات مسحة في أقرب وقت ممكن بعد جمع. ومع ذلك، فإنها يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 ساعة أو مبردة في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة إذا الاختبار ولم يتسن على الفور. العينات التي تم جمعها طازجة مثالية لأداء الاختبار الأمثل. غير لائق معالجة عينة، والتخزين، و / أو وسائل النقل قد تسفر عن نتائج خاطئة.
    ملاحظة: وكإجراء وقائي، يتعين على الأفراد أداء هذا الاختبار علاج جميع العينات كما قد تكون معدية عن طريق اتباع الاحتياطات العالمية عند التعامل مع العينات.
  2. جلب جميع العينات إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاختبار.
    ملاحظة: جميع المكونات الاختبار للاستخدام مرة واحدة فقط، وينبغي ألا تستخدم لإجراء اختبارات متعددة. لا تخلط مكونات عدة من الأرقام الكثير مختلفة. لا تستخدم الكواشف عدة الماضي تاريخ انتهاء صلاحيتها.
  3. جلب المتلقي عينة الأزرق لروم درجة الحرارة قبل الاختبار. قاعدة اختبار البرتقال ويمكن اختبار دون الحاجة لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. ترك كل قطعة اختبار في التفاف احباط حتى مباشرة قبل الاستعمال. تشغيل الأداة عن طريق الضغط على زر الطاقة على الجانب الصك. أدخل المستخدم معرف ثم اضغط على "موافق".

2. تشغيل اختبار

  1. لبدء عملية الاختبار، المس "تشغيل اختبار 'على الشاشة الصك. أدخل هوية المريض باستخدام لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة أو الماسح الضوئي الباركود ثم اضغط على "موافق". فتح الغطاء وإدراج قاعدة اختبار البرتقال في حامل قاعدة اختبار البرتقال.
  2. تأكد من أن يتم عرض الاختبار الصحيح على الشاشة ثم اضغط على "موافق". إدراج المتلقي عينة الأزرق في استقبال صاحب العينة الأزرق.
    ملاحظة: لا تقم أبدا بفتح المتلقي عينة قبل وضعه في أداة لأن هذا سيمنع شطف العازلة من الوصول إلى درجة حرارة التشغيل الصحيحة وقد تؤثر على أداء الاختبار.
  3. انتظر المتلقي عينة في عملية الاحماء. عند المطالبة من قبل الصك، وإزالة ختم احباط ووضع مسحة المرضى لفحصها في استقبال العينة.
    ملاحظة: عند إزالة احباط، ضع إصبعين على حافة استقبال عينة للتأكد من أن يبقى في مكانه.
  4. بقوة مزيج من مسحة في السائل لمدة 10 ثانية، يضغط رئيس مسحة ضد الجانب المتلقي عينة كما كنت مزجها للمساعدة في طرد عينة من مسحة. اضغط على "موافق" للمتابعة. إذا اختبار مسحات المخزنة في المتوسط ​​النقل الفيروسي، دوامة VTM لمدة 10 ثانية ثم إضافة 200 ميكرولتر إلى المتلقي العينة.
  5. اضغط على خرطوشة نقل بيضاء في استقبال عينة الأزرق. مواصلة الضغط على المتلقي عينة حتى يرتفع المؤشر البرتقال.
  6. رفع وثم ربط خرطوشة نقل إلى قاعدة الاختبار. مراقبة مؤشر البرتقال ينزل مرة واحدة يتم إرفاق نقل خرطوشة بشكل صحيح. إغلاق غطاء ولا تفتح حتى "اختبار كامل"تظهر رسالة على الشاشة.

3. مراقبة الجودة

  1. لمس "تشغيل QC اختبار 'على الشاشة الرئيسية. حدد اختبار مراقبة الجودة ليتم تشغيلها. تأكيد نوع الاختبار لمطابقة عينة QC المعدة للاختبار عن طريق لمس "موافق"، وبعد على الشاشة يطالب لاستكمال الاختبار.

4. النتيجة التفسير

  1. بعد اختبار تشغيل اكتمال، ومراقبة نتائج الاختبار المعروضة على الشاشة مع التفسيرات لوجود الأنفلونزا A، B، أنواع فرعية غير معروفة. للحصول على نتائج غير صحيحة كرر الاختبار.

5. صيانة وتنظيف

  1. تنظيف الصك والمنطقة المحيطة بها مقاعد البدلاء يوميا مع الايثانول 70٪ أو 10٪ من محلول التبييض. رش محلول التنظيف على خالية من الوبر قماش مبللة، لتنظيف. لا تصب الحلول مباشرة على الصك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الدراسة، تم جمع العينات المحفوظة NPS من المرضى المنومين عرض من أعراض تشبه الانفلونزا في ميموريال سلون كيترينج للسرطان (MSKCC) أثناء تفشي الانفلونزا بين 15 ديسمبر 2012 و 1 مارس 2013. وقدمت العينات NPS في 3 مل من VTM واختبارها كجزء من الممارسة السريرية الروتينية مع الفحص الجزيئي الذي يكتشف فريق من فيروسات الجهاز التنفسي (RP)، بما في ذلك الإنفلونزا A، A-1، A-3، و ب. وخلال فترة الدراسة، وقدمت 3675 العينات مصادر القدرة النووية إلى MSKCC المختبرات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فيروسات الأنفلونزا هي أسباب عالمية كبيرة من معدلات الاعتلال والوفيات. التشخيص السريع والدقيق للأنفلونزا هو واحد من مفاتيح رئيسية لإدارة تفشي انفلونزا خلال موسم التنفسي. الاختبارات الأخرى التي تعتمد على مستضد هي سريعة وسهلة لأداء. ومع ذلك، لديهم حساسية منخفضة 13. من ناحية أخرى، تحسنت الاختبارات الجزيئية التقليدية حساسية، ولكنها تتطلب التكنولوجيين مختبر أكثر من ذوي الخبرة لأداء وأكثر تكلفة. الأنفلونزا A و B الفحص الموضحة في هذه الدراسة والبروتوكول هو، ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر موظفي خدمة علم الأحياء الدقيقة السريرية في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان للمساعدة في جمع العينات السريرية. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال اتفاقية بحثية بين MSKCC و Alere Scarborough (SK2013-0262).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (عالمي) ، NAT-024 (الولايات المتحدة)
Alere i Influenza A & B 24 Test KitAlere425-000 (عالمي) ، 425-024 (الولايات المتحدة)
Alere i ماسح الباركودAlereEQ001001
Alere Universal PrinterAlere55115 (عالمي) ، alereiprinter ( الولايات المتحدة)
200 وميكرو ؛ ل ماصة
200 ومايكرو ؛ ل أطراف
منها وسيط نقل فيروسيRemelM4-RT
دقيقةماصة يمكن التخلص

المراجع

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة