تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصنيع منصة زراعة خلايا الكبد ثلاثية الأبعاد الناشئة ، والسقالة البلورية الغروية المقلوبة ، والتقنيات المصاحبة لتقييم سلوك خلايا الكبد. تعمل المسام التي يمكن التحكم فيها في الحجم والترابط والقدرة على اقتران بروتينات المصفوفة خارج الخلية بسقالة بولي (إيثيلين جلايكول) (PEG) على تحسين أداء خلية Huh-7.5.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القدرة على الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد في المختبر، لغرض اختبار السمية الخلوية الاكسيوبيوتك "، ودراسة عدوى الفيروس وتطوير عقاقير تستهدف الكبد، يتطلب منصة في الخلايا التي تستقبل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية المناسبة. وقد استخدمت النظم الهندسية أنسجة الكبد الأخيرة ثلاثية الأبعاد (3D) السقالات تتألف من الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية، بالنظر إلى احتباس الماء العالية وقدرتها على توفير المحفزات الميكانيكية التي تحتاجها الخلايا. وكان هناك اهتمام متزايد في السقالة مقلوب الكريستال الغروية (ICC)، والتطورات الأخيرة، والذي يسمح منظمة عالية المكانية، مثلي النمط والتفاعل خلية مغاير، وكذلك المصفوفة (ECM) التفاعل بين الخلايا خارج الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكول لافتعال سقالة للمحكمة الجنائية الدولية باستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) وطريقة الجسيمات الرشح. لفترة وجيزة، يتم إجراء شعرية من الجسيمات microsphere، وبعد ذلك وقبل البوليمريضاف حل ص، بلمرة بشكل صحيح، ثم تتم إزالة الجزيئات، أو تتسرب، وذلك باستخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، رباعي هيدرو الفوران). حل النتائج شعرية في السقالة المسامية العالية مع أحجام المسام للرقابة وinterconnectivities أن السماح لوسائل الإعلام للوصول إلى خلايا أكثر سهولة. هذا الهيكل الفريد يسمح مساحة عالية للخلايا التمسك فضلا عن سهولة الاتصال بين المسام، والقدرة على معطف المحكمة الجنائية الدولية سقالة PEGDA مع البروتينات ويظهر أيضا تأثير ملحوظ على أداء الخلية. نحن نحلل مورفولوجية السقالة وكذلك الخلايا سرطانة الكبد السلوك (هاه 7.5) من حيث الجدوى وتعمل لاستكشاف تأثير هيكل المحكمة الجنائية الدولية والطلاء ECM. وعموما، فإن هذه الورقة بروتوكول تفصيلي لسقالة الناشئة التي لها تطبيقات واسعة في هندسة الأنسجة، وخاصة الهندسة أنسجة الكبد.
المقدمة
الكبد هو الجهاز أوعية دموية للغاية مع العديد من المهام، بما في ذلك إزالة السموم من الدم، والتمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك، وإنتاج البروتينات في الدم. أنسجة الكبد لديها معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) المجهرية، التي تتألف من أنواع متعددة الخلايا، نفيق الصفراء، والجيوب، ومناطق مختلفة التكوين بايوماتريكس وتركيزات الأكسجين مختلفة. ونظرا لهذا الهيكل تفصيلا، فقد كان من الصعب لخلق نموذج الكبد السليم في المختبر 1. ومع ذلك، هناك الطلب المتزايد على وظيفية نماذج في المختبر استضافة خلايا الكبد البشرية كمنصات لسمية اختبار المخدرات 2 ودراسة الأمراض المرتبطة الكبد 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. للمحكمة الجنائية الدولية سقالة التصنيع (الشكل 1)
- إعداد البوليسترين (PS) السياج (القطر = 6 مم؛ 8-13 طبقات من الخرز).
- لإعداد العفن، وقطع نصائح من من 0.2 مل أنابيب microcentrifuge واقية من الغليان على مستوى 40 ميكرولتر. تلتزم الجزء العلوي من قطع الأنابيب إلى 24 × 60 مم 2 المجهر زلات غطاء زجاجي مع الغراء واقية من الماء.
- وضع المجالات PS (قطر = 140 ميكرون) الواردة في تعليق المياه إلى 20 مل قارو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتظهر نتائج ممثلة لتوصيف الهيكلي للسقالة المحكمة الجنائية الدولية والمقارنة بين فعالية كل ICC حالة سقالة في زراعة خلايا الكبد وأوضح أدناه. شروط سقالة للمحكمة الجنائية الدولية المستخدمة في هذه النتائج هي الطلاء الكولاجين 0 ميكروغرام / مل (باري)، و 20 ميكروغرام / مل (الكولاجين 20)، 200 ميكروغرام / مل (الكولاجين 200)، و 400 ميكروغرام / مل (الكولاجين 400) والأولي هاه 7.5 خلية رقم البذر هو 1X10 6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
والسقالات هندسة الأنسجة تتطور بسرعة لتقديم كل الاشارات الجسدية والكيميائية الحيوية اللازمة لتجديد وصيانة أو إصلاح الأنسجة لتطبيق استبدال الجهاز، ودراسة الأمراض وتطوير الأدوية، وغيرها الكثير 57. في هندسة الأنسجة الكبد وخلايا الكبد البشرية الأولية يفقد بسرعة وظائف الأيض مرة واحدة معزولة عن الجسم، وخلق حاجة كبيرة لالسقالات الهندسية وتطوير منصات للحفاظ على وظائف الكبد. وقد استخدمت التيار في منصات ثقافة الكبدية المختبر الحيوية المختلفة. وقد تركزت الأبحاث في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة أبحاث زمالة الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01) وبرنامج البحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني، CRP10-2012-07).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2 مل أنبوب PCR | Axygen Scientific | PCR-02D-C | غراء غوريلا مقاوم للغليان |
| Gorilla Glue، Inc. | يعتمد على البائع. تم شراء هذا من متجر محلي. | ||
| شرائح زجاجية | VWR 631-1575 | الأبعاد: 24 & مرات ؛ 60 مم < سوب > 2 < / سوب> | |
| كرات البوليسترين | فيشر Scientific | TSS # 4314A | القطر = 140 & micro ؛ m; 3x104< / sup> الجسيمات لكل مليلتر و 1.4٪ توزيع حجم |
| الإيثانول | ميرك | 1.00983.1011 | المطلق لتحليل EMSURE; تمييع إلى 70٪ مع Milli-Q |
| المياه بالموجات فوق الصوتية الحمام | Elma | S10H | فرن المعدات |
| Nabertherm | N7 / H | ||
| 200 & micro ؛ ل طرف ماصة | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| شاكر هزاز | VWR | 444-0142 | |
| البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ميرك | 1.09727.0100 | Mw< / sub> = 4 كيلو دالتون ؛ ينتج عن أكريلاسیون مونومرات PEG وتنقية الراسب الناتج ماكرومر PEGDA مع Mw< / sub> = 4.6 & nbsp ؛ كيلو دالتون | |
| جهاز طرد مركزي | بيكمان كولتر | معدات | |
| 392932 أكريليت بولي (إيثيلين جلايكول) - سكسينيمديل فاليرات | لايسان بيو | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw< / sub> = 3.4 كيلو دالتون |
| 2-هيدروكسي -4 '- (2-هيدروكسي إيثوكسي) -2-ميثيل بروبيوفينون | سيجما ألدريتش | 410896 | |
| دوامة | VWR | 58816-123 | معدات |
| جهاز طرد مركزي دقيق | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M & nbsp ؛ | #PM996 | أبقى عند 9 "مع يسمح بكثافة 10.84 ميغاواط / سم < سوب > 2 < / sup> |
| Bluewave 200 أضواء كاشفة للأشعة فوق البنفسجية | Blaze Technology ؛ | 120008 ، 122300 | |
| رباعي هيدروفوران (THF) | ميرك | 107025 | |
| شاكر مداري | هايدولف | 543-123120-00-5 | |
| كولاجين من النوع الأول | سيجما ألدريتش | C3867-1VL | من الفئران. 1x ، بدون CaCl 2< / sub> & amp MgCl2; الرقم الهيدروجيني = 7.2 |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16٪ وزن / حجم AQ. 10 × 10 & nbsp ؛ مل |
| بارافورمالدهايد | VWR | 43368.9M | معدات |
| المنطقة الحرة 4.5 مجفف التجميد | Labconco | معدات | |
| 7750020 Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | معدات |
| مسح المجهر الإلكتروني | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| الأجسام المضادة الأولية المضادة للفأر ضد الكولاجين من النوع الأول | Abcam | ab6308 | |
| الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر المقترن بلوحة Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| ، ثقافة الأنسجة 24 بئر ، قاع مسطح (Nunclon) ؛ | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 2.5 جم / لتر جلوكوز مع L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P / S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 مم أطباق الاستزراع غير المعالجة من Corning | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25٪ معدات Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | ؛ 37 & nbsp ؛ ° C ، 5٪ رطوبة |
| Forma Steri-Cycle CO2< / sub> حاضنات | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| طقم الحية / الميتة للبقاء / السمية الخلوية لخلايا الثدييات | Life Technologies | L3224 ؛ | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | كاشف أحادي الصوديوم والملح (MSR) |
| Infinite 200 PRO قارئ الصفيحة الدقيقة ؛ | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | # 1610407 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| الأجسام المضادة الأولية المضادة للفأر (ضد CYP3A4 ، الألبومين) سانتا | كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-53850 ؛ sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 المسمى Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC المياه | ثيرموفيشر Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c مقياس الطيف الضوئي | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix ؛ | مختبرات Bio-Rad | 1708840 | |
| SYBR تختار Master Mix لتقنية CFX | Life 4472937 | ||
| Primers (سيتم اختيارها) CFX96 | |||
| نظام الوقت الفعلي ، C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH ؛ |
المراجع
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
