يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زرع تنافسية لتقييم المكونة للدم للياقة الخلايا الجذعية

15.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54345

⸱

أغسطس 31, 2016

 , 
1INRS-Institut Armand-Frappier, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لإعداد تجارب تنافسية لزراعة نخاع عظم الفأر لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم دون تنقية مسبقة للخلايا الجذعية عن طريق فرز الخلايا.

الملخص

التعريف القياسي الذهبي للخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) هو خلية عند نقلها إلى متلقي مشعع سيكون لها القدرة على إعادة إنتاج خلايا الدم لعمر المتلقي. يشرح هذا البروتوكول كيفية إعداد اختبار وظيفي لمقارنة قدرات HSC لمجموعتين مختلفتين من الخلايا ، مثل نخاع العظام من الفئران من نمطين وراثيين مختلفين ، وكيفية تحليل الفئران المتلقية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يستخدم البروتوكول مكافئات HSC بدلا من فرز الخلايا للتوحيد القياسي ويناقش مزايا وعيوب كلا النهجين. نناقش كذلك الاختلافات المختلفة في البروتوكول الأساسي ، بما في ذلك عمليات الزرع التسلسلية ، والحد من فحوصات التخفيف ، والمقايسات الموجهة ، وعمليات الزرع غير التنافسية ، بما في ذلك المزايا والاستخدامات المفضلة لهذه الأساليب المتنوعة. هذه المقايسات أساسية لدراسة وظيفة HSC ويمكن استخدامها ليس فقط للتحقيق في الجوانب الجوهرية الأساسية ل HSC في علم الأحياء ولكن أيضا لتطوير المقايسات قبل السريرية لزرع نخاع العظم وتوسيع HSC في الثقافة.

المقدمة

تكون الدم هو عملية التجدد الذي يضمن يشير استكمال خلايا الدم التي فقدت بسبب الاصابة، والإشعاع وموت الخلايا. وتكفل هذه العملية عن طريق الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) الموجودة إلى حد كبير في نخاع العظام الكبار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية المكونة للدم يمكن أن تستخدم لأغراض علاجية في اضطرابات المناعة الذاتية، والأورام الخبيثة الدموية ونقص المناعة 1. وبالتالي فإن هناك حاجة إلى فهم أفضل للآليات التي تنظم وظيفة شهادة الثانوية العامة، بما في ذلك توسيع التكاثري، وقدرتها على الوصول إلى وتدبر نخاع العظام المتلقي بعد زرع. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت مؤخرا وأفادت العديد من علامات سطح الخلية، بما في ذلك أفراد الأسرة SLAM CD150 وCD48، لإثراء مستقبلي HSCs الكبار وHSCs الجنين إلى ما يقرب من 50٪ نقاء 2-4، وقياس معيار الذهب للHSCs وظيفي لا يزال مقايسة في الجسم الحي إعادة إسكانها ل تحديد قدرتها على إعادة بناء الدم جإنتاج الذراع في مضيف المشع 5.

وقد وضعت في الجسم الحي نسيلي إعادة إسكانها فحص البداية حتى ومكولوتش 6 ومنذ ذلك الحين تم تنقيح وتوسيع نطاقها. كما هو محدد في الأصل، HSCs ضمان مدى الحياة إنتاج خلايا الدم من خلال تجديد الذات والتمايز. نقل HSCs إلى مستلم المشع مما يسمح لنا بتقييم: قدرتهم على التمييز من خلال تحليل مختلف الأنساب خلايا الدم (الخلايا اللمفية تي، الخلايا الليمفاوية B، المحببة، وحيدات) وقدرتها على التجديد الذاتي من خلال زرع التسلسلي. ان الفحص عادة ما تنطوي على المقارنة بين وظيفة و / أو كمية من اثنين من السكان من HSCs، على سبيل المثال، خلايا القادمة من اثنين من الفئران من المورثات أو الخلايا المختلفة التي تم التعامل أو غير المعالجة مع العوامل المختلفة التي يمكن أن تؤثر على صيانة أو توسعة HSCs في الثقافة. الخيمرية المانحة، أو مساهمة نقل المانحة HSCs رس إنتاج خلايا الدم ومن ثم يمكن تحديدها من قبل تحليل التدفق الخلوي في الدم المحيطي ونخاع العظام باستخدام علامات سطح الخلية أو وسائل أخرى من شأنها أن تميز الخلايا المانحة من المتلقي، أو المضيف. علامات الأكثر استخداما على نطاق واسع هي بالتأكيد الاليلين لجين Ptprc أو مستضد CD45 الكريات البيض 7 الذي اخترناه لالأمثلة الواردة أدناه.

وإعادة تعمير فحص نسيلي يمكن أن تكون تنافسية أو غير تنافسية. في وضع غير تنافسي، يتم نقل السيطرة واختبار HSCs في الفئران المتلقي منفصلة وستكون النتيجة لكل نوع من الخلايا أن يكون مستقلا عن الآخر. في وضع تنافسي، ويتم قياس وظيفة كل من اختبار ومراقبة HSCs ضد السكان من منافس HSCs. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الإعداد تنافسية ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لحالات غير تنافسية. كلا النهجين لها مزاياها وحدودها، ونحن سوف مقارنتها بالتفصيل فينقاش. نحن أيضا وصف أساليب مختلفة لضمان العدالة في عدد من HSCs المزروعة، وشرح كيفية التكيف مع الفحص لتقدير حجم HSCs من فحص تخفيف الحد (LDA)، وتقديم أمثلة على كل من زرع الناجحة وغير الناجحة لتفسير النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق الحيوان المؤسسية ويتبع المجلس الكندي بشأن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان.

ملاحظة: للحفاظ على ظروف خالية من مسببات الأمراض معقمة / محددة الإسكان، وإجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل المباشر من الفئران الحية داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو غطاء تدفق الصفحي. نظيفة أو تعقيم أقفاص، وأجهزة الزجرية، المواد الإسكان، طعام والمياه المقدمة للحيوانات بشكل مناسب. استخدم فقط العقيمة، والإبر المتاح للحقن ولأخذ عينات الدم. العقيم تقنية حاسمة خلال إعداد والكسب غير المشروع.

1. إعداد الفئران مستلم

  1. تحديد الفئران المتلقي مع الشقوق الأذن (أو أي طريقة أخرى وافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية 8) لتمكين الأفراد متابعة الطرفية الدم ونخاع العظام إعادة بمرور الوقت. وزن الفئران لمرحلة ما بعد الزرع المتابعة. لناالفئران مستلم البريد التي هي ما بين 7 و 12 أسابيع من العمر (أقل من 25 غراما).
    ملاحظة: في المثال المقدمة، كانت ولدت CD45.1 + CD45.2 + الفئران المتلقي في المنزل عن طريق عبور C57BL / 6 الفئران مع الفئران B6.SJL مسانج.
  2. أشرق الفئران المتلقي مع جرعتين من 450 راد لتدمير النشاط للدم. إعطاء الجرعة الأولى قبل يوم واحد زرع والثانية 1-2 ساعة قبل الزرع.
    ملاحظة: يمكن للأشعة السينية أو أشعة غاما على حد سواء استخدامها تبعا لتوافر المرافق المناسبة.

2. إعداد المانحة والمنافس خلايا نخاع العظام

  1. الموت ببطء المانحة (الاختبار والمراقبة؛ CD45.2 +) ومنافس (CD45.1 +. B6.SJL) الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم أو باستخدام الطرق المعتمدة من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية المحلية.
  2. وضع الفئران على عودتهم والساقين مفتوح على مصراعيه، في طبق بتري فارغة أو على شاش معقم (للحفاظ على سطح العمل النظيفة) طnside خزانة السلامة البيولوجية. الرطب الجلد والفراء مع الايثانول 70٪ / 30٪ H 2 O (ت / ت).
  3. قطع القدم مع شفرة جراحية أو مقص حاد. خفض فتح الجلد على طول الساق والانسحاب بعيدا الجلد باستخدام ملقط مسنن. قطع العضلات الزائدة.
  4. خلخل عظم الفخذ من خلال سحب على عظم الساق واستخدام شفرات مقص ضد عظام الحوض كقوة مضادة. فصل الساق والفخذ من الرضفة وإزالة البتات المتبقية من العضلات والأوتار. وضع العظام في 2-3 العقيمة مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة.
  5. جمع خلايا نخاع العظام عن طريق تنظيف العظام مع 5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
    1. عقد العظام بلطف مع ملقط وادخال ابرة 25 G تعلق على شغل حقنة 1 مل إلى واحدة من نهاية العظام. اضغط على المكبس وجمع الخلايا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. كرر حسب الحاجة حتى وسط العظام هو الأبيض.
  6. فصل الخلايا عن طريق تكرار يمر من خلال إبرة لالحصول على تعليق خلية واحدة. تجنب فقاعات والقوة الزائدة. ملاحظة: استخدام إبرة أكبر قليلا (22 G) لتحسين بقاء الخلية على هذه الخطوة.
  7. تمر الخلايا من خلال مصفاة النايلون 70 ميكرون لضمان تعليق خلية موحد ولإزالة الأنقاض وكتل.
  8. إزالة قسامة لعد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي تعليق خلية المتبقية في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة ضبط كثافة الخلية كما هو مطلوب في برنامج تلفزيوني العقيمة (10 8 خلية / مل). تبقي الخلايا على الجليد.

3. إنشاء خلية المانحة حكمه شهادة الثانوية العامة

  1. نقل ما يعادل 3 × 10 6 خلايا (30 ميكرولتر) في 5 مل جولة أنبوب البوليسترين السفلي لالتدفق الخلوي تلطيخ. إضافة حجم مساو من الأجسام المضادة الخالي من الملصقات ضد CD16 / CD32 لمنع تلطيخ غير محددة (المخفف في عازلة تلطيخ (تستكمل برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ زلال المصل البقري (BSA) و 1 ملي EDTA) لتركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل). احتضان 5 دقائق على RT.
  2. إضافة 90 ميكرولتر مزيج الرئيسي الأجسام المضادة تألقي مترافق أعد العازلة تلطيخ: كوكتيل النسب المعقدة البيروكسيديز (B220، CD3e، CD11b، GR1، Ter119)، Sca1، CD117، CD135، CD150. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، ومحمية من الضوء.
    ملاحظة: يجب تحديد التخفيفات المناسبة لكل الكثير من الأجسام المضادة. انظر جدول المواد للالتخفيفات المستخدمة في هذه الدراسة.
  3. إضافة 2 مل العازلة تلطيخ للخلايا، ودوامة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. صب طاف بيليه resuspend بنقر.
  4. إضافة 10 ميكرولتر-تألقي مترافق streptavidin المخفف في عازلة تلطيخ (انظر المواد الجدول). احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة، ومحمية من الضوء. يغسل كما في الخطوة 3.3 لإزالة streptavidin غير منضم.
  5. الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع لا يقل عن ستة أجهزة الكشف عن 9. تحديد وتيرة لين - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + الخلايا (يقدر HSCs) في كل عينة باستخدام القالب تحليل هو مبين في الشكل (2) وكما ذكرت سابقا 10،11.
    ملاحظة: تكرار HSCs وظيفية في غضون ذلك السكان يمكن أن تقدر ما بين 1/3 و 1/5 2،12.
  6. إنشاء حكمه شهادة الثانوية العامة المقدرة لجميع العينات 11، وذلك باستخدام عينة واحدة (عادة المنافس، B6.SJL CD45.1 + في هذا المثال)، والأساس كما هو موضح أدناه وفي الشكل 2.
    1. حساب عدد الخلايا المطلوبة باستخدام الصيغ التالية:
      #transplanted HSCs / المتلقي = 5 × 10 5 خلايا س يقدر شهادة الثانوية العامة تردد (كما هو محدد لعينة أساسية، وهذا الرقم هو عادة بين 75 و 125 لwildtype C57BL / 6 الفئران) 10-12.
      ملاحظة: في الشكل 2، على عينة A، والنتيجة هي 139 HSCs.
      إجمالي # زرع الخلايا (لعينات أخرى، على سبيل المثال نموذج B في الشكل 2) = # العابرةزرعت تردد HSCs / شهادة الثانوية العامة.
      ملاحظة: في الشكل 2، العينة B، والنتيجة هي 197826 (أو ما يقرب من 2 × 10 5) مجموع خلايا نخاع العظام.
  7. حساب مجموع أعداد الخلايا المطلوبة لكل متلق الكسب غير المشروع لكل عينة باستخدام نتائج التي تم الحصول عليها أعلاه.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا الرقم 5 × 10 5 لعينة خط الأساس (منافس).
    1. مضاعفة عدد تم الحصول عليها من الخطوة 3.7 على عدد من الفئران المتلقي وإضافة ما يكفي من الخلايا لمدة سنتين على الأقل الفئران إضافية للتعويض عن حجم القتلى في المحقنة.
  8. مزيج منافس (على سبيل المثال، CD45.1 +) والخلايا اختبار (CD45.2 +) في 1: 1 شهادة الثانوية العامة النسبة المكافئة المحسوبة في الخطوة 3.6 وضبط الحجم النهائي ل 200 ميكرولتر في الحقن باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة.
    ملاحظة: للحصول على مجموعة من خمسة الفئران المتلقي أن حجم اقترح بالتالي يكون 1.4 مل على الأقل، تحتوي على 3.5 × 10 6 منافس خلايا نخاع العظم (أو973 HSCs المقدرة للعينة (أ) في الشكل 2)، وعدد مماثل من الخلايا اختبار (في الشكل 2، أي ما يعادل العينة B سيكون 197826 × 7 = 1384782 خلايا نخاع العظام).

4. زرع نخاع العظم

  1. الاحماء الفئران المتلقي المشع في الخطوة 1.2 مع مصباح الحرارة الأحمر لضمان تمدد في الأوعية الدموية، وجعل الذيل الأفقي الأوردة أكثر وضوحا.
  2. إعداد 1 مل السلين حقنة مزودة إبرة G 27 (أو أصغر). نضح ما يقرب من 750 ميكرولتر من تعليق خلية استعداد (للفئران 3 المتلقي). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في حقنة.
  3. إدراج الماوس في جهاز زجرية. دراسة الذيل والبحث في الأوردة ذيل الجانبية التي يجب أن تكون واضحة للعيان على جانبي الذيل. مسح موقع الحقن مع الايثانول. ادخال الإبرة شطبة تصل، بالتوازي مع الجلد واضغط بلطف على المكبس. وينبغي أن يكون حقن سهلا. إذا القوة هي إعادةفلكل وإبرة ليس في الوريد.
    ملاحظة: الفئران أقدم لها سمكا الجلد، والتي قد تجعل العثور على الوريد أكثر صعوبة. إذا كانت الإبرة ليست في هذا السياق، أعد القريبة الإبرة إلى موقع الحقن الأولي.
  4. إزالة الإبرة والضغط على موقع الحقن مع شاش معقم لبضع ثوان لوقف النزيف. نقل الماوس في قفص نظيفة.
    ملاحظة: استخدم نفس المحاقن والإبر لمدة ثلاث حقن، وبعد ذلك إبرة قد تصبح مملة جدا.
  5. لمرحلة ما بعد الزرع المتابعة، حقن 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني تحت الجلد لترطيب الفئران على مدى الأيام الخمسة الأولى. إضافة المضادات الحيوية في المياه الصالحة للشرب لمنع العدوى (إذا لزم الأمر، اختياري). وزن الفئران كل 2-3 أيام خلال الأسابيع الثلاثة الأولى والموت ببطء الفئران التي فقدت أكثر من 15-20٪ من قبل زرع وزن الجسم (أو كما هو محدد من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية المحلية).

5. تحليل الدم المحيطي

  1. جمع قطرة من الدم (أpprox. 50-100 ميكرولتر) في أنابيب EDTA.
    1. لجمع الدم من الوريد الفك السفلي، واستخدام مشرط أو إبرة 22 G على اختراق جلد الوجه بالقرب من بقعة أصلع تقع تحت عظام الفك ووضع أنبوب جمع لاستقبال قطرة دم 13. جمع الدم في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا بعد زرع لمتابعة متعددة النسب إعادة.
  2. إضافة 1 مل الطازجة RT خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة (9 أجزاء 0.16 M NH 4 الكلور + 1 جزء 0.17 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.65) إلى قطرة من الدم التي تم جمعها في الخطوة 5.1.1. مزيج عينة نقل إلى 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع مناسبة لالتدفق الخلوي. اسمحوا الوقوف لمدة 4 دقائق على RT.
  3. إضافة 4 مجلدات من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. مزيج من قبل تحول نهاية إلى نهاية، ونقل على الفور على الجليد. الطرد المركزي 10 دقيقة في 200 x ج في 4 درجات مئوية.
  4. صب طاف بيليه resuspend بنقر. وينبغي أن يكون طاف واضح والأحمر. إضافة 2 مل تلطيخ العازلة ودوامة لفترة وجيزة. الطرد المركزي 5 دقائق في 200 XGAر 4 درجة مئوية.
  5. صب طاف بيليه resuspend بنقر.
  6. المضي قدما مع التدفق الخلوي تلطيخ باستخدام بروتوكول عام مفصل في الخطوات 3،1-3،3 والأجسام المضادة التالية للحصول على مزيج الرئيسي: CD45.1، CD45.2، CD3e، CD19، GR1.
  7. الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع لا يقل عن ستة أجهزة الكشف عن 9. تحديد وتيرة الخلايا المشتقة من الجهات المانحة لكل النسب (الخلايا الليمفاوية CD19 + B، الخلايا الليمفاوية CD3e + T، GR1 المحببة مشرق) في كل عينة باستخدام قالب التحليل الوارد في الشكل (3) وكما نشرت 10،11.

6. تحليل نخاع العظم إعادة إعماره

  1. جمع خلايا نخاع العظام على النحو المفصل في القسم 2. وصمة عار الخلايا لتحليل التدفق الخلوي باستخدام بروتوكول عام مفصل في الخطوات 3،1-3،3 والأجسام المضادة التالية للحصول على مزيج الرئيسي: النسب الكوكتيل، Sca1، CD117، CD135، CD150، CD45.1 ، CD45.2. كشف لينEAGE كوكتيل الأجسام المضادة باستخدام streptavidin ملون تألقي مترافق كما هو موضح في الخطوة 3.4.
  2. الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع ثمانية على الأقل للكشف عن 9. إذا تتوفر ستة فقط، إضافة CD135 على نفس القناة كلوحة النسب كما سيتم استبعاد CD135 خلايا +. تحديد وتيرة لين المستمدة من المانحين - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs في كل عينة باستخدام قالب التحليل الوارد في الشكل (4) وكما نشرت 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وصف عام للإعداد زرع تنافسية، بما في ذلك زرع الثانوية (التي تناقش أدناه) يمكن العثور عليها في الشكل 1. ويمكن الاطلاع على تحليل تمثيلي للنخاع قبل زرع العظام HSCs في الشكل 2. معلومات أكثر تفصيلا عن استبعاد الحلل و الخلايا الميتة يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 9.

أرقام 3 و 4

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لتقييم اللياقة البدنية النسبية للمانحين (اختبار) HSCs ضد منافس يعرف HSCs. وضع المنافسة يزيد من حساسية النسبية للفحص (أكثر عرضة للكشف عن انخفاض معتدل في اللياقة البدنية الخلايا الجذعية) ويوفر الرقابة الفنية الداخلية لفعالية التشعيع والحقن. ومع ذلك، فإنه لا ينبغي أن تستخدم كتدبير المطلق للشهادة الثانوية العامة اللياقة البدنية. لا يعني انخفاضا في إعادة تنافسية تلقائيا أن أن HSCs لا أداء جيدا في ظل غياب المنافسة. على الرغم من أنه يمكن القول بأن وضع تنا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لروكسان هيتو-أربور للمساعدة في تصميم الشكل ومظاهرة من الإجراءات. وأيد البحوث في المختبر من قبل جائزة الانتقال من مؤسسة كول، ديسكفري منح لا. 419226-2012 من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (صندوق قادة CFI منح رقم 31377). KMH هو جديد Chercheur-Boursier لفون للبحوث كيبيك - سانتيه (FRQS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب Microtainer مع K2EDTABD Biosciences365974
20 G إبرةBD حقنةلأخذ عينات الدم من الوريد الفكي
السفلي LabQuake Shaker المشواةThermo   ScientificC415110
منقى مضاد للفأر CD16 / CD32 (استنساخ 2.4G2 ، Fc Block)BD Biosciences5531422.50 & mu ؛ جم / مل
Pe-Cy7 مترافق مضاد للفأر CD3e (استنساخ 145-2C11)eBioscience25-00310.25 & mu ؛ جم / مل
PE المترافق المضاد للفأر CD19 (استنساخ 1D3)eBioscience12-01930.25 & mu ؛ جم / مل
APC-eFluor780 (ما يعادل APC-Cy7) - مترافق مضاد للفأر GR1 (استنساخ RB6-8C5)eBioscience47-59310.25 & mu ؛ جم / مل
FITC مترافق مضاد للفأر CD45.1 (استنساخ A20)eBioscience11-04532.50 & mu ؛ جم / مل
eFluor450 مترافق مضاد للفأر CD45.2 (استنساخ 104)eBioscience48-04541.00 & mu ؛ جم / مل
مضاد للإنسان / الفأر CD45R (B220) (استنساخ RA3-6B2)eBioscience13-04521.25 & mu ؛ جم / مل
مضاد للفأر البيوتينيل CD3e (استنساخ 145-2C11)eBioscience13-00311.25 & mu ؛ جم / مل
مضاد للفأر البيوتينيل CD11b (استنساخ M1 / 70)eBioscience13-01121.25 & mu ؛ جم / مل
البيوتينيل المضاد للفأر GR1 (استنساخ RB6-8C5)eBioscience13-59311.25 & mu ؛ جم / مل
البيوتينيل المضاد للفأر TER119 (استنساخ TER119)eBioscience13-59210.625 & mu ؛ جم / مل
V500 ستربتافيدينBD Biosciences561490.5 & mu ؛ جم / مل
PE المترافق المضاد للفأر CD117 (استنساخ 2B8) BDBiosciences5533550.25 & mu ؛ جم / مل
PE-Cy7 مترافق مضاد للفأر Ly6A / E (Sca1) (استنساخ D7)BD Biosciences5581620.25 & mu ؛ جم / مل
PerCP-eFluor710 مترافق مضاد للفأر CD135 (استنساخ A2F10)eBioscience46-13510.5 & mu ؛ جم / مل
Alexa fluor 647 مترافق مضاد للفأر CD150 (استنساخ TC15-12F12.2)Biolegend1159180.625 & mu ؛ جم / مل لا تحمل BD Biosciences و eBioscience نفس حقنة التوبركولين المستنسخة
1 مل معحقنة BD27 G 309623
1 مل حقنة توبركولين مع 25 جم إبرةBDحقنة 309626
70 مو ؛ مصفاة الخلايا المتحركةBD Falcon352350
إبرة

المراجع

  1. Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
  2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  3. Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
  4. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  5. Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
  6. Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
  7. Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
  8. Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
  9. Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
  10. Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
  11. Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279(2011).
  12. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  13. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  14. Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
  15. Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
  16. Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
  17. Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
  18. Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
  19. Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
  20. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
  21. Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
  22. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  23. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الزراعة التنافسيةتحضير نخاع العظمتحليل قياس التدفق الخلويمكافئات الخلايا الجذعيةمقايسة التخفيف المحدودالزراعات المتسلسلةمقايسات التوطينالزراعات غير التنافسيةخيمرات نخاع العظم
زرع تنافسية لتقييم المكونة للدم للياقة الخلايا الجذعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.