يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لإعداد تجارب تنافسية لزراعة نخاع عظم الفأر لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم دون تنقية مسبقة للخلايا الجذعية عن طريق فرز الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع تنافسية لتقييم المكونة للدم للياقة الخلايا الجذعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التعريف القياسي الذهبي للخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) هو خلية عند نقلها إلى متلقي مشعع سيكون لها القدرة على إعادة إنتاج خلايا الدم لعمر المتلقي. يشرح هذا البروتوكول كيفية إعداد اختبار وظيفي لمقارنة قدرات HSC لمجموعتين مختلفتين من الخلايا ، مثل نخاع العظام من الفئران من نمطين وراثيين مختلفين ، وكيفية تحليل الفئران المتلقية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يستخدم البروتوكول مكافئات HSC بدلا من فرز الخلايا للتوحيد القياسي ويناقش مزايا وعيوب كلا النهجين. نناقش كذلك الاختلافات المختلفة في البروتوكول الأساسي ، بما في ذلك عمليات الزرع التسلسلية ، والحد من فحوصات التخفيف ، والمقايسات الموجهة ، وعمليات الزرع غير التنافسية ، بما في ذلك المزايا والاستخدامات المفضلة لهذه الأساليب المتنوعة. هذه المقايسات أساسية لدراسة وظيفة HSC ويمكن استخدامها ليس فقط للتحقيق في الجوانب الجوهرية الأساسية ل HSC في علم الأحياء ولكن أيضا لتطوير المقايسات قبل السريرية لزرع نخاع العظم وتوسيع HSC في الثقافة.
المقدمة
تكون الدم هو عملية التجدد الذي يضمن يشير استكمال خلايا الدم التي فقدت بسبب الاصابة، والإشعاع وموت الخلايا. وتكفل هذه العملية عن طريق الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) الموجودة إلى حد كبير في نخاع العظام الكبار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية المكونة للدم يمكن أن تستخدم لأغراض علاجية في اضطرابات المناعة الذاتية، والأورام الخبيثة الدموية ونقص المناعة 1. وبالتالي فإن هناك حاجة إلى فهم أفضل للآليات التي تنظم وظيفة شهادة الثانوية العامة، بما في ذلك توسيع التكاثري، وقدرتها على الوصول إلى وتدبر نخاع العظام المتلقي بعد زرع. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت مؤخرا وأفادت العديد من علامات سطح الخلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق الحيوان المؤسسية ويتبع المجلس الكندي بشأن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان.
ملاحظة: للحفاظ على ظروف خالية من مسببات الأمراض معقمة / محددة الإسكان، وإجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل المباشر من الفئران الحية داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو غطاء تدفق الصفحي. نظيفة أو تعقيم أقفاص، وأجهزة الزجرية، المواد الإسكان، طعام والمياه المقدمة للحيوانات بشكل مناسب. استخدم فقط العقيمة، والإبر المتاح للحقن ولأخذ عينات الدم. العقيم تقنية حاسمة خلال إعداد والكسب غير المشروع.
<....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وصف عام للإعداد زرع تنافسية، بما في ذلك زرع الثانوية (التي تناقش أدناه) يمكن العثور عليها في الشكل 1. ويمكن الاطلاع على تحليل تمثيلي للنخاع قبل زرع العظام HSCs في الشكل 2. معلومات أكثر تفصيلا عن استبعاد الحلل و الخلايا الميتة يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 9.
أرقام 3 و 4
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لتقييم اللياقة البدنية النسبية للمانحين (اختبار) HSCs ضد منافس يعرف HSCs. وضع المنافسة يزيد من حساسية النسبية للفحص (أكثر عرضة للكشف عن انخفاض معتدل في اللياقة البدنية الخلايا الجذعية) ويوفر الرقابة الفنية الداخلية لفعالية التشعيع والحقن. ومع ذلك، فإنه لا ينبغي أن تستخدم كتدبير المطلق للشهادة الثانوية العامة اللياقة البدنية. لا يعني انخفاضا في إعادة تنافسية تلقائيا أن أن HSCs لا أداء جيدا في ظل غياب المنافسة. على الرغم من أنه يمكن القول بأن وضع تنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لروكسان هيتو-أربور للمساعدة في تصميم الشكل ومظاهرة من الإجراءات. وأيد البحوث في المختبر من قبل جائزة الانتقال من مؤسسة كول، ديسكفري منح لا. 419226-2012 من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (صندوق قادة CFI منح رقم 31377). KMH هو جديد Chercheur-Boursier لفون للبحوث كيبيك - سانتيه (FRQS).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب Microtainer مع K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G إبرة | BD حقنة | لأخذ عينات الدم من الوريد الفكي | |
| السفلي LabQuake Shaker المشواة | Thermo Scientific | C415110 | |
| منقى مضاد للفأر CD16 / CD32 (استنساخ 2.4G2 ، Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 & mu ؛ جم / مل |
| Pe-Cy7 مترافق مضاد للفأر CD3e (استنساخ 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 & mu ؛ جم / مل |
| PE المترافق المضاد للفأر CD19 (استنساخ 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 & mu ؛ جم / مل |
| APC-eFluor780 (ما يعادل APC-Cy7) - مترافق مضاد للفأر GR1 (استنساخ RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 & mu ؛ جم / مل |
| FITC مترافق مضاد للفأر CD45.1 (استنساخ A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 & mu ؛ جم / مل |
| eFluor450 مترافق مضاد للفأر CD45.2 (استنساخ 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 & mu ؛ جم / مل |
| مضاد للإنسان / الفأر CD45R (B220) (استنساخ RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 & mu ؛ جم / مل |
| مضاد للفأر البيوتينيل CD3e (استنساخ 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 & mu ؛ جم / مل |
| مضاد للفأر البيوتينيل CD11b (استنساخ M1 / 70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 & mu ؛ جم / مل |
| البيوتينيل المضاد للفأر GR1 (استنساخ RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 & mu ؛ جم / مل |
| البيوتينيل المضاد للفأر TER119 (استنساخ TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 & mu ؛ جم / مل |
| V500 ستربتافيدين | BD Biosciences | 56149 | 0.5 & mu ؛ جم / مل |
| PE المترافق المضاد للفأر CD117 (استنساخ 2B8) BD | Biosciences | 553355 | 0.25 & mu ؛ جم / مل |
| PE-Cy7 مترافق مضاد للفأر Ly6A / E (Sca1) (استنساخ D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 & mu ؛ جم / مل |
| PerCP-eFluor710 مترافق مضاد للفأر CD135 (استنساخ A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 & mu ؛ جم / مل |
| Alexa fluor 647 مترافق مضاد للفأر CD150 (استنساخ TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 & mu ؛ جم / مل لا تحمل BD Biosciences و eBioscience نفس حقنة التوبركولين المستنسخة |
| 1 مل مع | حقنة BD | 27 G 309623 | |
| 1 مل حقنة توبركولين مع 25 جم إبرة | BD | حقنة 309626 | |
| 70 مو ؛ مصفاة الخلايا المتحركة | BD Falcon | 352350 |
المراجع
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
