يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري

10.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54349

⸱

أغسطس 24, 2016

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول للكشف، والأحداث الانصهار واحدة بوساطة كمين بين الجسيمات الشحمية وطبقات ثنائية معتمدة في قنوات ميكروفلويديك باستخدام TIRFM الاستقطاب، مع حساسية جزيء واحد و~ 15 مللي ثانية قرار الوقت. ويمكن الكشف عن الدهون والافراج عن البضائع القابلة للذوبان في وقت واحد. يتم قياس حجم الجسيمات الشحمية، الانتشارية الدهون، والمسام الانصهار خصائص.

الملخص

في عملية في كل مكان من الانصهار غشاء فتح المسام الانصهار يؤسس أول اتصال بين اثنين من مقصورات منفصلة سابقا. خلال العصبي أو إطلاق هرمون عبر إيماس، يمكن للمسام الانصهار مفتوحة عابر وعلى مقربة مرارا وتكرارا، وتنظيم البضائع إطلاق حركية. ديناميات المسام أيضا تحديد طريقة إعادة التدوير الحويصلة. نتائج إعادة عزل لا رجعة فيها في عابرة الانصهار، "تقبيل والفر"، في حين أن تمدد يؤدي إلى الانصهار الكامل. من أجل فهم أفضل ما هي العوامل التي تحكم ديناميات المسام، وضعنا مقايسة لمراقبة الانصهار غشاء باستخدام الاستقطاب الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري مع حساسية جزيء واحد و~ 15 قرار الوقت مللي ثانية في كيميائيا واضحة المعالم في نظام المختبر. الانصهار وصفت من fluorescently الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتينات الخامس الفخ (الخامس سيارات الدفع الرباعي) مع مستو طبقة ثنائية تحمل تي الافخاخ، معتمدة على وسادة لينة البوليمر (تي سيمبول تكنولوجيز، التي تدعمها ر طبقة ثنائية)، ورصدها. يستخدم فحص قنوات تدفق الموائع الدقيقة التي تضمن الحد الأدنى من استهلاك عينة في حين تزويد كثافة ثابتة من سيارات الدفع الرباعي. استغلال تعزيز إشارة السريع على نقل بطاقات الدهون من سيارات الدفع الرباعي إلى SBL خلال الانصهار، ويتم رصد حركية نقل الدهون صبغ. حساسية TIRF المجهري يسمح تتبع العلامات الدهون الفلورسنت واحدة، والتي من الانتشارية الدهون وحجم الدفع الرباعي يمكن استخلاصه لكل حدث الانصهار. الدهون مرات الإفراج صبغة يمكن أن تكون أطول بكثير مما كان متوقعا للمرور دون عوائق من خلال المسام مفتوحة بشكل دائم. باستخدام نموذج يفترض يرجع إلى المسام الخفقان التخلف الإفراج الدهون، المسام "الانفتاح"، وجزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة خلال الانصهار، يمكن تقدير. وعلامة القابلة للذوبان يمكن أن تكون مغلفة في سيارات الدفع الرباعي لرصد وقت واحد من الدهون والإفراج البضائع القابلة للذوبان. وتشير هذه القياسات بعض المسام قد ختم بعد فقدان جزء من البضائع القابلة للذوبان.

المقدمة

الانصهار الغشاء هو عملية بيولوجية عالمية المطلوبة للاتجار داخل الخلايا من الدهون والبروتينات، إفراز، والتسميد، والتنمية، ويلفها دخول الفيروس إلى الكائنات المضيفة 1-3. بالنسبة لمعظم تفاعلات الاندماج داخل الخلايا بما في ذلك الإفراج عن الهرمونات والناقلات العصبية عبر إيماس، يتم توفير الطاقة لدمج اثنين من طبقات ثنائية الدهون عن طريق تشكيل لحزمة أربعة الحلزون بين (الفخ) البروتينات وما شابه ذلك للذوبان N-ethylmaleimide تراعي بروتين عامل مرفق مستقبلات، الراسية في الحويصلة (الخامس الفخ) والغشاء الهدف (تي الفخ) 4 على التوالي. متشابك الحويصلة إيماس هو تفاعل الاندماج أكثر ينظم بإحكام ويحدث خلال ميلي ثانية واحدة بعد وصول ل1،4،5 المحتملين عمل. المسام الانصهار، الاتصال الأولي بين اثنين من الصمامات مقصورات، يمكن أن تومض مفتوحة ومغلقة عدة مرات قبل إعادة طبع أو توسيع بصورة لا رجعة فيها 5-7. النتائج السابقةفي عابرة، "قبلة وتشغيل" الانصهار، في حين يؤدي الأخيرة إلى الانصهار الكامل. العوامل التي تحكم التوازن بين هذين الوضعين الانصهار وآليات تنظيم المسام الخفقان ليست مفهومة جيدا 5،8.

مطلوبة البروتينات كمين لإيماس. وألغت متشابك الانصهار الحويصلة على الانقسام من الافخاخ التي كتبها أعصاب 9. وأظهرت التجارب الانصهار السائبة باستخدام الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) أن الافخاخ ليست مطلوبة فقط، ولكن أيضا ما يكفي لدفع الغشاء الانصهار 10. في هذا الاختبار بكميات كبيرة، وسيارات الدفع الرباعي أعادت مع الخامس الافخاخ (الخامس SUV) ومخدر مع الفوسفورية الفلورسنت (N - (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4-YL) -phosphoethanolamine (NBD-PE) و ( N - (lissamine رودامين B السلفونيل) -phosphoethanolamine (LR-PE) ويخلط مع حويصلات غير المسماة التي تحتوي على تي الافخاخ (ر-SUV) في البداية مضان بنك دبي الوطني-PE في الخامس سيارات الدفع الرباعي ومروي التي كتبها فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق ) إلى LR-PE. كما مختبرالهنداوي الخامس سيارات الدفع الرباعي تلتحم مع غير المسماة تي سيارات الدفع الرباعي، يتم تقليل كثافة سطح fluorophore في الغشاء الآن جنبا إلى جنب، والزيادة الناتجة في دبي الوطني-PE مضان تقارير مدى الدهون خلط 10. كما فحص الجزء الأكبر من السهل إعداد وتحليل، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة آليات بوساطة كمين الانصهار 10-14. ومع ذلك، لديها العديد من القيود، مثل انخفاض حساسية وضعف قرار الوقت. الأهم من ذلك، باعتبارها قياس الفرقة، فإنه المتوسطات النتائج على كل الأحداث مما يجعل التمييز بين الالتحام والانصهار، وكذلك الكشف عن وسيطة hemifusion الصعبة.

وعلى مدى عدة مجموعات العقد الماضي، بما في ذلك بلدنا، وضعت فحوصات جديدة لرصد الأحداث الانصهار في مستوى حويصلة واحدة 15-27. تستخدم ها وزملاؤه الخامس سيارات الدفع الرباعي المربوطة على سطح ومراقبة الانصهار مع حرية تي سيارات الدفع الرباعي 18،19. تم رصد الدهون خلط باستخدام الحنق بين زوج من fluorophores محددة الدهون مسريرا في الخامس وتي سيارات الدفع الرباعي، على التوالي، وذلك باستخدام الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري 18. وفي وقت لاحق، استخدم مختبر Brunger من نوع دهون، تسمية واحدة جنبا إلى جنب مع علامة محتويات للكشف في وقت واحد من الدهون ومحتويات خلط 20،28. وشملت كلا من الدهون وعلامات محتويات في ارتفاع، تركيزات التبريد الذاتي. أدى اندماج مع سيارات الدفع الرباعي غير المسماة في مضان dequenching 20،28.

وتنصهر الآخرين الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ 15-17،21-27،29. الهندسة المستوية من الهدف (تي فخ الحاوي) يحاكي أفضل طبقة ثنائية عملية الانصهار الفسيولوجية، الحويصلات المنحنية للغاية صغيرة مع غشاء البلازما المسطحة. مجموعة ستاينم المستخدمة الأغشية التي تغطي المسام تشكيلها مع تي الافخاخ، علقت اكثر من مسامية الركيزة نيتريد السيليكون والكشف عن الانصهار مع الفردية-سيارات الدفع الرباعي ضد استخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهري 23. الآخرين وتستخدم الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ، معتمد على ركيزة الزجاج 15-17،21،22،24-27،29. ميزة كبيرة لاستخدام طبقات ثنائية المدعومة (SBLs) هي أن TIRF المجهري يمكن استخدامها للكشف عن الالتحام والانصهار الأحداث مع ممتازة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ودون تدخل من الخامس سيارات الدفع الرباعي الحرة، على الرغم من استخدام على microfluidics يوفر الدقة حدث واحد باستخدام معيار بعيدة الميدان epifluorescence المجهري 24.

ومصدر القلق الرئيسي هو ما إذا كان وكيف التفاعلات الركيزة طبقة ثنائية تؤثر دعم جودة طبقة ثنائية وعملية الاندماج. تقدم العمل في وقت مبكر استخدام SBLs مستو التي تم دعمها مباشرة على الزجاج أو الكوارتز الركيزة 15-17. وقدمت هذه SBLs عن طريق الامتزاز، انفجار، ونشر والانصهار الأغشية تي سيارات الدفع الرباعي على الركيزة. وقد أدرك ذلك قريبا، مع ذلك، أن حذف عنصر تي كمين رئيسي، SNAP25، من SBLs أعد بهذه الطريقة أدى إلى الخامس SUV الالتحام والانصهار حركية indistinguishable من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام كامل تي الافخاخ 17. لأنه مطلوب SNAP25 تماما عن الانصهار في الجسم الحي 30،31، وضعت أهمية فسيولوجية من هذه المحاولات المبكرة موضع تساؤل. تغلبت مجموعة تام لهذا التحدي باستخدام تشكيل طبقة ثنائية الخاضعة لسيطرة دعم أفضل 21. وهي تستخدم انجميور-بلودجيت ترسب على النشرة الأولى خالية من البروتين من سيمبول تكنولوجيز، تليها انصهار أن أحادي الطبقة مع تي سيارات الدفع الرباعي 21. وأدى ذلك إلى الانصهار تعتمد-SNAP25.

لتجنب القطع الأثرية المحتملة المرتبطة طبقة ثنائية المدعومة مباشرة على ركيزة الزجاج دون الحاجة إلى استخدام أساليب انجميور-بلودجيت، Karatekin وآخرون قدم، بولي رطب (جلايكول الإثيلين) (PEG) وسادة لينة بين طبقة ثنائية والركيزة 24. أدى هذا التعديل أيضا في تعتمد-SNAP25 الانصهار 24. قد طبقات ثنائية خففت على طبقة البوليمر لينة من المعروف للحفاظ على الغشاء أفضلاستخدمت التنقل البروتين وظيفة 32، والدراسات الانصهار مع الفيروسات 33. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن طبقات ثنائية مضاد للفيروسات للاحتفاظ بعض القدرة في تقرير المصير، شفاء وهي قوية جدا 34،35. أولا، واشتملت على جزء من المتاحة تجاريا سلاسل PEG، مرتبطة الدهون في غشاء تي سيارات الدفع الرباعي. عندما انفجرت هذه تي سيارات الدفع الرباعي وتشكل طبقة ثنائية مستو على ركيزة الزجاج وفرشاة PEG تغطي كلا منشورات من طبقة ثنائية مستو. لأنه هو الدافع وراء تشكيل مستو طبقة ثنائية الإذعان لسلاسل PEG المحيطة تي سيارات الدفع الرباعي على سطح الزجاج ماء، انفجار الحويصلية وتشكيل طبقة ثنائية مستو لا تعير اهتماما نسبيا لتكوين الدهون المستخدمة. ومع ذلك، عندما يتم إدراج كميات كبيرة من الكوليسترول في الدم، وزيادة خصائص متماسكة من سيارات الدفع الرباعي، وسيارات الدفع الرباعي قد لا تنفجر من تلقاء أنفسهم. إذا كان هذا هو الحال، ناضح صدمة أو ثنائي التكافؤ أيونات يمكن استخدامها للمساعدة على مستو تشكيل طبقة ثنائية 25.

وكما ذكر أعلاه، في هذه ا ف باملنهجية فرشاة PEG تغطي جانبي مستو، بدعم طبقة ثنائية. الفرشاة التي تواجه قناة تدفق الموائع الدقيقة يساعد على منع التصاق غير محددة من واردة الخامس سيارات الدفع الرباعي التي هي أيضا تغطيها عادة مع طبقة الربط. تشكيل المجمعات الخامس وتي كمين يبدأ من N-ترميني غشاء القاصي والعائدات في مراحل نحو المجالات غشاء الداني 36. ل-سيارات الدفع الرباعي الخامس للتفاعل مع تي سيمبول تكنولوجيز، والخامس والحاجة تي فخ N-تيرميني لتبرز فوق فرش PEG، والذي يبدو أن هذا هو الحال في ظل ظروف الفحص. يمكن تكييفها ارتفاع فرشاة لدراسة البروتينات الأخرى من الافخاخ من خلال تغيير كثافة من الدهون مضاد للفيروسات وPEG طول سلسلة 37،38. فائدة أخرى من فرش PEG تغطي الأسطح القريبة من طبقات ثنائية الصمامات هي أنها تحاكي بيئة مزدحمة من الأغشية الحيوية التي تكتظ 30،000-40،000 بروتينات الغشاء لا يتجزأ لكل متر مربع ميكرون 39. تماما مثل سلاسل PEG في هذا الاختبار، وREPUطبقة البروتين lsive تغطي الأغشية البيولوجية يجب أن تكون دفعت جانبا للسماح للاتصال بين اثنين من طبقات ثنائية فوسفورية للانصهار تحدث.

تستخدم قنوات تدفق الموائع الدقيقة في هذا الاختبار، كما أنها توفر مزايا فريدة من نوعها. أولا، تدفق ميكروفلويديك يتيح المزيد من ترسب موحد للتي سيارات الدفع الرباعي لنشر والصمامات لتشكيل تي SBL. الثانية، وحجم قناة صغيرة (<1 ميكرولتر) يقلل من استهلاك عينة. ثالثا، كميات صغيرة المطلوبة تسمح التجربة بأكملها التي ستجرى تحت تدفق مستمر. تدفق يزيل ضعيفة، ويفترض غير تحديدا، الالتزام الخامس سيارات الدفع الرباعي من SBL 16. كما يقيم كثافة ثابتة من الخامس سيارات الدفع الرباعي فوق تي سيمبول تكنولوجيز، وتبسيط التحليل الحركي 17. وأخيرا، وتتميز الحويصلات رست بسهولة من تلك الخطوط التي يحملها تدفق 25. الرابعة، وعدة قنوات ميكروفلويديك يمكن استخدامها على نفس ساترة، كل يحققون في حالة مختلفة. وهذا يسمح مقارنة الظروف الدورينانوغرام نفس العملية التجريبية. وقد استخدم نهج مماثل من قبل مجموعة فان Oijen لدراسة الاندماج بين فيروس الإنفلونزا، وSBLs خففت 33.

في TIRF المجهري، واضمحلال الأسي الحقل زائل (مع التحلل ثابت ~ 100 نانومتر) حدود مضان الإثارة إلى تلك الجزيئات التي هي في مكان قريب جدا من واجهة زجاجية عازلة. هذا يقلل من مساهمة جزيئات الفلورسنت التي هي أبعد، ويزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ويتيح حساسية جزيء واحدة مع أوقات التعرض إطار 10-40 مللي ثانية. يؤدي مجال زائل أيضا إلى زيادة إشارة على الانصهار: كما نقل الدهون وصفت من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز، وجدوا أنفسهم، في المتوسط، في حقل الإثارة أقوى. هذه الزيادة في مضان أقوى لالجسيمات الشحمية أكبر.

إذا تم استخدام الضوء المستقطب لتوليد مجال زائل، تساهم آثار إضافية للتغيرات في مضان على رransfer من التسميات من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز. بعض الأصباغ الدهون لديها ثنائي القطب الانتقال الموجهة بزاوية متوسط ​​يفضل فيما يتعلق طبقة ثنائية التي هي جزء لا يتجزأ منها. وهذا يخلق فرقا في مقدار مضان المنبعثة من fluorophores عندما يكونون في سيارات الدفع الرباعي مقابل SBL، لأن شعاع الاستقطاب سوف تثير الأصباغ في الأغشية اثنين بشكل مختلف. عن السابق، فإن شعاع الإثارة التفاعل مع ثنائيات الاقطاب الانتقال الموجهة نحو سيارات الدفع الرباعي كروية، في حين أن لهذا الأخير، وسوف تقتصر توجهات ثنائي القطب من قبل هندسة SBL مسطحة. على سبيل المثال، عند استخدام الصورة مستقطب الضوء الساقط (الاستقطاب وضعها الطبيعي لطائرة من الإصابة)، الإثارة أكثر كفاءة عندما الصبغة هي في SBL من في سيارات الدفع الرباعي لمواز الموجهة الدهون صبغ انتقال ثنائي القطب لغشاء 29،40 (مثل تلك التي الجاذبة أو لم 41-43). يظهر SUV مخدر مع مثل هذه fluorophore خافت عندما الاحواض على سيمبول تكنولوجيز (الشكل 7، Representat إيف نتائج). كما يفتح المسام الانصهار ويربط الأغشية سيارات الدفع الرباعي وSBL، تحقيقات الفلورسنت منتشر في SBL وتصبح أكثر عرضة للولع مجال زائل الاستقطاب يالي 25،27،29. وبالتالي، فإن إشارة مضان متكاملة حول الموقع الانصهار يزيد بشكل حاد خلال نقل الصبغة من سيارات الدفع الرباعي في SBL 27 (الشكل 3) والشكل (7). عاملا إضافيا يسهم في إشارة التغييرات التي ترافق الاندماج وdequenching من العلامات الفلورية كما هي المخفف أنها عندما نقل إلى SBL. مساهمة dequenching عادة طفيفة مقارنة آثار تسوس الميدانية والاستقطاب زائل في مقايسة الموصوفة هنا، لأنه فقط جزء صغير ( figure-introduction-1 ) من الدهون وصفت.

الزيادة إشارة على الانصهار يمكن استغلالها لاستخلاص الخصائص الانصهار المسام بمقارنة ذلك الوقت،1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>، المطلوبة للدهون للهروب من خلال المسام التي هي قابلة للاختراق بحرية إلى الدهون إلى الافراج عن الوقت الفعلي، figure-introduction-2 . إذا جداول مرتين قابلة للمقارنة، ستكون النتيجة هي أن المسام يعرض مقاومة تذكر لتدفق الدهون. ومع ذلك، إذا كان الافراج عن الوقت الفعلي هو أطول بكثير من الوقت لاطلاق سراح محدودة الانتشار، وهذا من شأنه أن يشير إلى عملية، مثل الخفقان المسام، وتأخير الافراج عن الدهون. الافراج عن الوقت محدودة الانتشار، figure-introduction-3 ، ويعتمد على حجم الجسيمات الشحمية الصمامات ودهون، الانتشارية. يتطلب تقديراتها هذه المعلمتين ليكون كميا. حساسية جزيء واحد من الفحص تسمح الانتشارية الدهون المراد قياسها من خلال تتبع عدة fluorophores الدهون واحد بعد إطلاق سراحهم في SBL لكل حدث الانصهار 26. حجم كل حويصلة الصماماتويمكن تقدير 27 عن طريق الجمع بين (ط) شدة صبغة الدهون واحد، (ب) التغير في مضان الكلي حول موقع رسو السفن بعد أن يتم نقل جميع fluorophores في سيمبول تكنولوجيز على الانصهار، (ج) المعروفة كثافة العلامات على سيارات الدفع الرباعي الدهون، و (د) من منطقة في الدهون. بالنسبة لكثير من الأحداث الانصهار، تم العثور على الأوقات الافراج عن الدهون الفعلية لتكون أبطأ بكثير مما كان متوقعا من قبل تحت سيطرة نشر الافراج عن 27، كما لوحظ سابقا على افتراض حجم SUV موحد 44. على افتراض التخلف الإفراج الدهون ومن المقرر أن المسام الخفقان، وهذا نموذج كمي يسمح تقدير "انفتاح المسام"، جزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة أثناء الانصهار 27.

كلما كان ذلك عمليا، فمن المهم لاختبار آليات الاندماج باستخدام كل من الدهون ومحتويات بطاقات القابلة للذوبان. على سبيل المثال، يمكن أن يؤخر الإفراج الدهون من خلال عمليات أخرى من الخفقان المسام، مثل تقييد انتشار الدهون من البروتينات الفخ الذي تحيط رانه المسام. إذا كانت هذه هي الحالة، ثم الإفراج عن محتويات سيسبق الإفراج عن تسميات الدهون، شريطة المسام كبيرة بما فيه الكفاية للسماح بمرور تحقيقات القابلة للذوبان. خلل أكثر أساسيا في نهج يمكن أن يكون في افتراض أن نقل الدهون المسمى إلى SBL يحدث من خلال المسام الانصهار الضيق الذي يربط بين SBL إلى الحويصلة التي احتفظت إلى حد كبير شكل قبل الانصهار. يمكن نقل الدهون في SBL ايضا ان ينتج من اتساع السريع للمسام الانصهار مع ما يصاحب ذلك، غاية الانهيار السريع من سيارات الدفع الرباعي في غشاء سيمبول تكنولوجيز، كما سبق واقترح بناء على بيانات الافراج عن الدهون وحدها 29. رصد كل الدهون ومحتويات الافراج في وقت واحد، فقد وجد أن العديد من المسام أعادت بعد إطلاق سراح جميع العلامات الدهون، ولكن احتفظت ببعض البضائع القابلة للذوبان من 27. هذا يدل على أن بعض الجسيمات الشحمية لا ينهار على الأقل في SBL بعد الانصهار، والتي نقل الدهون الصبغة في SBL يحدث من خلال المسام الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، لحدث IPID ومحتويات الافراج في وقت واحد 27، مما يجعل من غير المرجح أن تخلف الإفراج الدهون يرجع إلى إعاقة انتشار الدهون من البروتينات كمين المحيطة المسام 45.

بروتوكول الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL التي لم ترصد إطلاق محتويات قابلة للذوبان ونشرت من قبل Karatekin وروثمان 25. هنا، يتم تضمينها المزيد من التطورات الأخيرة، ورصد أي وقت واحد من الدهون والافراج عن محتويات وتقدير خصائص سيارات الدفع الرباعي، الدهون، والانصهار المسام 27. يبدأ البروتوكول مع تعليمات لإعداد الخلايا الموائع الدقيقة، التي تربط بولي (ميثيل siloxane) (PDMS) المطاط الصناعي كتلة تحتوي على أخاديد مع ساترة زجاج 25. بعد ذلك، يتم شرح إعداد الخامس سيارات الدفع الرباعي مع كل من الدهون ومحتويات علامات. القسمين 4 و 5 توفر تعليمات لتجميع الخلايا الموائع الدقيقة، وتشكيل SBLs في الموقع والتحقق من وجود عيوب وسيولة، وإدخال VSأوفس في تدفق الخلايا والكشف عن الأحداث الانصهار. ويقدم القسم 6 تعليمات لتحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد كتلة PDMS لتشكيل قناة ميكروفلويديك

figure-protocol-1
الشكل 1. التصنيع الدقيق من قالب خلية تدفق وإعداد كتلة PDMS. (A) تصميم خلية تدفق أربع قنوات التي تناسبها على الزجاج ساترة 24 × 60 ملم (القاع). يتم ترتيب ستة تصاميم مماثلة لتناسب على رقاقة السيليكون 10 سم (أعلى). (ب) قطع كتلة من PDMS سميكة حوالي 5-8 ملم على الناخس حفرة. (C) الإدراج من الأنابيب في حفرة لكمة باستخدام زوج من ملاقط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الحصول على قالب خلية تدفق مثل واحد في الشكل 1A. قنوات النموذجية هي 0،3-1 ملم واسعة، وارتفاع 70-100 ميكرون، و 1-2 سم طويلة. صنع قالب لناجي تقنيات ضوئيه القياسية في منشأة غرف الأبحاث 25 أو النظام إذا كان الوصول غرف الأبحاث غير متوفر. بدلا من ذلك، آلة قالب مع أبعاد أكبر من مادة مناسبة.
    ملاحظة: يمكن للموظفين غرف الأبحاث تدريب وتوجيه المستخدمين غير مجرب (الوصول إلى مرفق غرف الأبحاث يقتصر دائما للمستخدمين مع التدريب المناسب) في تصميم وترتيب قناع، تنظيف ويفر، وضوئيه. مرة واحدة يتم الحصول على القالب، يمكن استخدامه خارج غرف الأبحاث مرارا وتكرارا، شريطة أن يوضع في طبق مغلقة والحرص على استبعاد الغبار.
  2. تحضير خليط من ~ 100 مل PDMS (سيليكون قاعدة المطاط الصناعي) و~ 10 مل من عبر رابط (وكيل علاج) في كوب من البلاستيك القابل للتصرف. قطع رأس ماصة المتاح للتعامل مع PDMS لزجة أكثر سهولة. تزن PDMS في كوب من البلاستيك كما pipetting ليست دقيقة.
  3. يقلب الخليط جيدا. إزالة العديد من فقاعات الهواء عن طريق التفريغ في مجفف فراغ (حوالي 20دقيقة). كما يتم وضع الكأس في ظل فراغ، فإن الفقاعات تنمو في البداية في الحجم، وزيادة حجم الخليط إلى حد كبير. السيطرة على الفراغ التي يتم تطبيقها والتأكد من الكأس هي عميقة بما فيه الكفاية لتجنب تسرب.
  4. صب انخفاض كبير من خليط PDMS نزع الغاز في كوب طبق بتري (150 ملم × 20 ملم) واضغط على رقاقة على PDMS مع القالب مواجهة. هذا تتجنب الفقاعات التي محاصرون تحت الرقاقة. سوف فقاعات المحاصرين توسيع وقد تقلب رقاقة عندما يوضع الطبق في الفرن. الآن صب PDMS نزع الغاز على القالب على رأس الرقاقة حتى يتم تغطيته بنحو 5-8 ملم من إيضاحية. في حالة حدوث فقاعة الهواء بلطف إزالته مع طرف ماصة.
  5. خبز نظام تطوير إدارة الأداء في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. ضمان أن الطبق هو مستوى.
  6. استخدام شفرة مشرط جديدة لقطع كتلة PDMS التي تحتوي على هياكل قناة مصبوب. وقطع كتلة يحتاج لتناسب على ساترة (راجع الخطوة 4.1.9).
  7. قشر خارج قطع كتلة من الطبق وررالآس وضعها على قطعة من رقائق الألومنيوم نظيفة.
    ملاحظة: كتل عبر ربط إيضاحية يمكن الاحتفاظ به لبضعة أشهر. على رقاقة واحدة، وهناك 6 مجموعات من قنوات التدفق (الشكل 1A)، لذلك يمكن أن تنتج 6 PDMS كتل في صب PDMS واحد. بعد الاستغناء عن 6 من كتل PDMS، وقطع فضفاضة نظيفة من PDMS، لكن على خلاف ذلك لا تقم بإزالة PDMS المتبقية قبل صب وعبر ربط الدفعة القادمة، والتي سوف تتطلب سوى نحو نصف PDMS المستخدمة في الدفعة الأولى. قالب جيد يمكن أن تستمر لعدة سنوات.
  8. استخدام الناخس حفرة للتنقيب عن طريق كتلة PDMS في الحركة المستقيمة واحد (الشكل 1B). تبدأ على الجانب الأخاديد القناة. تأكد من إزالة مثقبة قطعة من PDMS. كرر هذا للجميع الثقوب ثمانية من تصميم أربع قنوات.
  9. وضع الجانب قناة كتلة PDMS إلى أسفل على قطعة جديدة وخالية من التجاعيد من رقائق الألومنيوم. تخزين كتلة لمدة تصل إلى بضعة أشهر في مربع الجافة، من الناحية المثالية في مجفف.
  10. دفع الأنابيب (0.25 ملم معرف، 0.76 مم OD) عن الثلث في حفرة لكمة باستخدام زوج من ملاقط (الشكل 1C). قطع الأنابيب مائلة لتسهيل الإدراج. ترك أنابيب طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى خزان سيارات الدفع الرباعي وضخ حقنة، على التوالي. بعد وضع رقاقة تجميعها على المجهر، وقطع الأنابيب مرة أخرى إذا كانت طويلة جدا.
  11. للاتصال الحقن مضخة، وقطع قطعة قصيرة من أكبر أنابيب السيليكون (ID 0.51 ملم، 2.1 ملم OD) وإدراج أنبوب أرق في جانب واحد. هذه الكتلة الاستخدام استعداد للPDMS يمكن الاحتفاظ به لبضعة أشهر.

2. ساترة التنظيف

  1. coverslips نظيفة وفقا للبروتوكول وصفها في Karatekin وروثمان 25 باستخدام مزيج مؤكسد قوي من حامض الكبريتيك (H 2 SO 4) وبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). تنفيذ هذا الإجراء في غرف الأبحاث، ومراقبة احتياطات السلامة المناسبة. بدلا من ذلك، استخدام غرف الأبحاث تنظيفها جoverslip ما هو متاح تجاريا (انظر قائمة المواد).

3. إعداد الخامس السيارات رباعية الدفع تحتوي على كل من الدهون وتسميات المحتوى

figure-protocol-2
يتم خلط الشكل 2. تخطيطي من إعداد سيارات الدفع الرباعي. الدهون في أنبوب زجاجي (1) ويبخر المذيب لتشكيل الفيلم الدهون عن طريق تناوب الأنبوب في حمام مائي (2). تتم إزالة آثار المتبقية من المذيبات تحت فراغ عالية (3). ورطب الفيلم الدهون في المخزن إعادة تحتوي على المنظفات والبروتين في حين vortexed (4). إذا محتويات صبغ هو أن تكون مغلفة، يتم تضمينه في هذه الخطوة، وكذلك في الخطوة التخفيف (5). التخفيف من تركيز المنظفات أقل من تركيزه مذيلة حاسم يؤدي إلى الحويصلية تشكيل. ومدال المنظفات بعيدا بين عشية وضحاها (6). لتي سيارات الدفع الرباعي لتشكيل SBL بما في ذلك بنك دبي الوطني-PE (الأخضر)، وطرحت الحويصلات في التدرج الكثافة والتي تم جمعها فيواجهة بين طبقتين (7A). لفصل الخامس سيارات الدفع الرباعي مع علامة المحتوى مغلفة من صبغة خالية تشغيل العينة على عمود الحجم الاستبعاد وجمع في 0.5 مل الكسور (7B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد 4 لتر من العازلة إعادة، التي تحتوي على 25 ملي HEPES-كوه، 140 ملي بوكل، 100 ميكرومتر EGTA و1 ملم DTT، ودرجة الحموضة 7.4. استخدام أكثر من المخزن المؤقت لغسيل الكلى و 100 مل لخطوات أخرى.
    ملاحظة: يمكن استخدام مخازن أخرى، ولكن من المهم للحفاظ على الأسمولية عازلة ثابتة طوال التجربة واختيار الظروف التي البروتينات وظيفية. لإعداد الخامس سيارات الدفع الرباعي التي تحتوي على تسميات الدهون فقط وتي سيارات الدفع الرباعي، اتبع Karatekin وروثمان 25.
  2. كما يتم تخزين مخزون الدهون في -20 درجة مئوية في الكلوروفورم أو الكلوروفورم: الميثانول (2: 1، ت / ت)، واسمحوا قارورة تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح لتجنب التكثيف.
  3. شطف أنبوب زجاجي مع الكلوروفورم لإزالة كميات ضئيلة من المنظفات وخلط الدهون في نسبة المرجوة مع كمية النهائي من 1 مكرومول في خليط من الكلوروفورم والميثانول (2: 1، ت / ت). فقط استخدام المحاقن الزجاجية / أنابيب للتعامل مع المذيبات العضوية / الدهون الذائبة.
    ملاحظة: الدهون المستخدمة هنا هي POPC: SAPE: DOPS: الكولسترول: PEG2000-مخدر: هل في نسبة المولي من 57.4: 15: 12: 10: 4،6: 1 لالخامس كمين تحتوي على حويصلات وPOPC: SAPE: DOPS: نسبة الكولسترول في الدم : PI الدماغ (4،5) ف 2: PEG2000-مخدر: دبي الوطني-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5) لتي فخ سيارات الدفع الرباعي. انظر المواد للحصول على التفاصيل. تركيبة الدهون أخرى يمكن استخدامها.
  4. يتبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين، أو في المبخر الدوار. تزج غيض من أنبوب في حمام مائي (37 درجة مئوية) يسخن فوق أعلى درجة حرارة انصهار الدهون لانتاج فيلم الدهون متجانسة وتجنب التغيرات الكبيرة في درجات الحرارة في حين تبخر المذيب. بدء فراغ في جميع أنحاء300 مليبار حتى يتم تشكيل فيلم الدهون، ثم يستمر ل~ 2 دقيقة في أعلى مستوى ممكن فراغ في المبخر الدوار.
  5. إزالة أنبوب زجاجي والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء وإزالة آثار ما تبقى من المذيب عن طريق وضع أنبوب في مجفف تحت فراغ عالية لا يقل عن 2 ساعة. هذه الخطوة يمكن أيضا تشغيل بين عشية وضحاها.
  6. لترطيب الفيلم الدهون المجففة، وإعداد خليط من المنظفات (ن الأوكتيل-β-D-glucopyranoside، OG) والبروتين (الخامس الافخاخ)، وتعتبر الدار في المخزن إعادة (500 الحجم النهائي ميكرولتر). الحفاظ على تركيز المنظفات النهائي ~ 2 مرات أعلى من تركيز مذيلة الحرج (CMC، 20-25 ملم لOG) وضبط الحجم النهائي بحيث المنظفات لنسبة الدهون هو> 10. حل Sulforhodamine ب (SRB) مسحوق في حل البروتين المنظفات للحصول على التركيز النهائي من 10-50 ملم تعتبر الدار التي تهز بلطف الحل. ضبط الأسمولية المخزن المؤقت إعادة عند إضافة تركيزات عالية للدار عن طريق الحد من التعاونncentration من كلوريد البوتاسيوم وفقا لذلك.
    ملاحظة: نسبة الدهون إلى البروتين (LP) لتي الافخاخ عالية (LP ~ 20000، ~ 70 تي الافخاخ للمتر ميكرون 25). أعلى بكثير الكثافة تي كمين في سيمبول تكنولوجيز قد يؤدي إلى المجاميع البروتين نشطة مع انخفاض كبير في معدلات الانصهار 17،24. ليرة لبنانية لالخامس الافخاخ هو أقل بكثير (LP 200 ~، ~ ​​7000 ضد الافخاخ لكل ميكرون 2)، على مقربة من كثافة الخامس الفخ وجدت في الحويصلات المشبكية 46،47. لضمان وظيفة البروتين بعد التعبير المؤتلف وتنقية الخامس وتي الافخاخ من المفيد إجراء انصهار معظم بسيط فحص 48 قبل الذهاب من خلال جميع الخطوات من واحد فحص حويصلة الانصهار.
  7. يهز بلطف أنبوب زجاجي قبل تحسنت تحتوي على فيلم الدهون المجففة مع إضافة الحل البروتين المنظفات-SRB من الخطوة 3.6. في محاولة لتجنب خلق فقاعات. تواصل يهز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. تمييع المنظفات خمسة أضعاف بإضافة إعادةالعازلة التي تحتوي على SRB (إضافة 2 مل، 2.5 الحجم النهائي مل) بينما vortexing لبسرعة لتجنب التدرجات تركيز. تواصل يهز لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: أطول زيادة حضانة كفاءة البروتين إعادة. التخفيف السريع يقلل من تركيز المنظفات أدناه اللجنة العسكرية المركزية ويؤدي إلى تشكيل الجسيمات الشحمية صغيرة.
  9. Dialyze تعليق الحويصلة أولا ضد ~ 1 لتر من العازلة إعادة لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم ضد 3 L من العازلة إعادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 4 غرام من المازة البوليسترين، وذلك باستخدام 20،000 أنبوب غسيل الكلى MWCO أو الكاسيت. استخدام الأكواب مختلفة لغسيل الكلى من الحويصلات مع وبدون SRB لمنع التلوث.
  10. تتوازن عمود هلام الترشيح مع العازلة إعادة. تشغيل تعليق الحويصلة من خلال عمود فصل SRB مجانا من الخامس سيارات الدفع الرباعي مع SRB مغلفة. استخدام عازلة إعادة دون SRB كما شاطف مرة واحدة لديها عينة كاملدخلت العمود. جمع الخامس سيارات الدفع الرباعي في 0.5 مل الكسور.
  11. تحقق نجاحا التغليف SRB بتركيزات مروي الذاتي عن طريق قياس SRB مضان قبل وبعد إضافة المنظفات لقسامة من الحويصلات 16. باستخدام مطياف مضان، تثير عينة في 550 نانومتر، ومسح انبعاث SRB بين 570 نانومتر و 630 نانومتر. نتوقع زيادة أضعاف 4-8 في مضان تعتبر الدار اعتمادا على كمية مغلفة على إضافة المنظفات مثل الغشاء بالفاعلات وتضعف SRB الافراج عنهم.
  12. تميز الانتعاش الدهون والبروتين باستخدام مضان الطيفي 24 و SDS-PAGE هلام الكهربائي، على التوالي. استخدام أسلوب تلطيخ حساسة، خاصة بالنسبة للارتفاع ليرة لبنانية عينات ر الدفع الرباعي (انظر قائمة المواد). وعادة ما يتم فقد حوالي 50٪ من كل من الدهون والبروتين إدخال أثناء إعداد مما أدى إلى ليرة لبنانية قريبة من القيمة الاسمية.
  13. تميز الأحجام سيارات الدفع الرباعي باستخدام الضوء الديناميكي نثر 24 أو الإلكترون microscoالحمر 48. مخزن تعتبر الدار التي تحتوي الخامس سيارات الدفع الرباعي في 4 درجات مئوية تصل إلى ~ 3-4 أيام. لا تجميد، وتجميد والذوبان يكسر غشاء والنشرات مغلفة SRB.

4. سيارات الدفع الرباعي SBL فيوجن الفحص لمراقبة الدهون الإصدار فقط

  1. تشكيل طبقة ثنائية بدعم المربوطة ضمن قنوات تدفق الموائع الدقيقة
    1. وضع كتلة PDMS (الخطوة 1.11) في ظل فراغ عالية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل التجربة لإزالة الغازات المذابة. وهذا يقلل كثيرا من خطر فقاعات الهواء في القنوات ميكروفلويديك خلال التجربة الانصهار.
    2. بدوره على الإعداد المجهر وتسخين المرحلة وصاحب العينة (الأرقام 3 و 4) إلى درجة الحرارة المطلوبة.
    3. تصفية المخزن المؤقت إعادة استخدامها لتخفيف الحويصلات من خلال مرشح 0.45 ميكرون أو أصغر حجم المسام.
    4. تمييع ~ 30 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PE وصفت تي سيارات الدفع الرباعي أو (-سيارات الدفع الرباعي الجبهة الوطنية) خالية من بروتين الجسيمات الشحمية التحكم (الأسهمحل 0.5-1 ملي الدهون) مع ~ 60 ميكرولتر من العازلة. التركيز النهائي ليست حرجة هنا.
    5. ديغا هذا الخليط باستخدام حقنة 3 مل. اضغط على معظم الهواء فوق العينة في حين عقد حقنة عموديا. ختم طرف (إبرة الحرة) باستخدام فيلم البارافين وخلق الفراغ الذي ادى الى انخفاض المكبس. اضغط على برميل حقنة لتسريع التفريغ من الحل. كرر هذه العملية عدة مرات حتى لا تحدث أكثر من فقاعات عند تطبيق فراغ.
    6. استخدام إبرة تحت الجلد بقطر أكبر قليلا من الأنابيب التي تعلق على كتلة PDMS لكمة ثقب في الغطاء من أنبوب microcentrifuge. تأكد من أن لكمات من قطعة من البلاستيك ليس داخل أنبوب لأنها قد تسد أنابيب متصلة مدخل قناة ميكروفلويديك في وقت لاحق.
    7. ملء حل سيارات الدفع الرباعي نزع الغاز في أنبوب microcentrifuge وجود ثقب في الغطاء ووضعه في حامل على المسرح المجهر لكي تتوازن إلى درجة الحرارة المحددة.
    8. ررالآس ساترة تنظيفها سابقا (قسم 2) في نظافة البلازما وتشغيل البلازما الجوية لمدة 5 دقائق. وضع ساترة تعامل البلازما (الجانب المعالج تواجه متابعة) على رأس عدد قليل من الأنسجة خالية من الوبر بمثابة وسادة.
    9. إزالة رقائق الألومنيوم من كتلة PDMS نزع الغاز ووضع حجر على رأس ساترة. عند إعادة استخدام كتلة PDMS وضع على وفصل قطعة من شريط لاصق على الجانب القناة لتنظيفه. اضغط على PDMS كتلة على ساترة باستخدام زوج من ملاقط لجعلها عصا، ولكن لا تضغط من الصعب جدا مثل الزجاج قد كسر.
    10. وضع خلية تدفق تجميعها على خشبة المسرح المجهر وتوصيل الأنابيب إلى خزان سيارات الدفع الرباعي وضخ حقنة، على التوالي. الشريط ساترة لمرحلة (الشكل 3B).
    11. بدء الشفط سيارات الدفع الرباعي في 3 ميكرولتر / دقيقة حتى يملأ الحل القنوات تماما (~ 2.25 ملم / ثانية لس 300 ميكرومتر قناة المقطع العرضي 75 ميكرون). عندما حلول لجميع القنوات بدأت تتحرك صعودا والعشرينه أنابيب على الجانب الخروج، والحد من تدفق إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة، واحتضان لمدة 30-45 دقيقة.
      ملاحظة: الوقت بين علاج البلازما الشريحة الزجاجية وتتدفق من سيارات الدفع الرباعي في قناة يجب أن لا تتجاوز 10-20 دقيقة مثل تأثير العلاج البلازما هي عابرة.
    12. تحقق القنوات لأي تسرب. استخدام الهدف الهواء 10-20X لمراقبة دبي الوطني-PE مضان من بنك دبي الوطني-PE التي تحتوي على تي أو الجبهة الوطنية-سيارات الدفع الرباعي. تثير دبي الوطني fluorophores باستخدام الليزر 488 نانومتر. التسريبات هي صعبة للكشف عن استخدام إضاءة ساطعة المجال.
    13. وضع أنبوب العازلة مع إعادة نزع الغاز في حامل والسماح للحرارة يوازن التغيرات السريعة كما هو الحال في درجة الحرارة قد يسبب تشوهات في سيمبول تكنولوجيز. وقف التدفق والانتظار ~ 1 دقيقة للتأكد من توقف تدفق تماما وسوف يستنشق أي فقاعة الهواء في الأنبوب قبل تبديل أنابيب مدخل إلى المخزن المؤقت نزع الغاز.
    14. شطف جميع القنوات مع العازلة نزع الغاز ليغسل سيارات الدفع الرباعي غير منضم.
    15. التبديل إلى higheص الهدف التكبير TIRF (60X، النفط، NA 1،45-1،49) والتحقق من أن طبقة ثنائية تبدو متجانسة وخالية من أي عيوب على نطاق واسع واضحة مثل بقع داكنة أو الأنابيب الدهون تمتد خارجا من سيمبول تكنولوجيز.
  2. تحقق سيولة طبقة ثنائية
    1. إذا وحدة FRAP مخصصة ليست متاحة، أو إذا كان تسلسل FRAP لا يمكن برمجتها، ثم نوعيا سيولة الغشاء اختبار النحو التالي.
      1. إغلاق الحجاب الحاجز الحقل إلى حجم صغير (~ 40 ميكرون قطر) وضبط 488 نانومتر ضوء الإثارة كثافة من خلال برنامج (20-80 مللي واط، أو 15-60 NW / ميكرون 2) لتبييض مضان دبي الوطني-PE في كشفها المجال بشكل كبير، ولكن ليس تماما. لطبقة ثنائية السوائل، في حالة مستقرة، وينبغي أن تكون كثافة مضان في وسط منطقة تتعرض أقل مما كانت عليه في الحواف، مع دخول سليمة جزيئات دبي الوطني-PE المنطقة المكشوفة وتنتشر على مسافة معينة قبل التبييض. في المقابل، إذا كان-الالتزام سطح Sفشل UVs وأن تنفجر، أو لسبب آخر طبقة ثنائية بدعم ليست السوائل، ويجب على جميع fluorophores في منطقة تتعرض التبييض.
        ملاحظة: يتم إعطاء قيم كثافة الليزر في هذا المجال ولاحقة الخطوات كنقطة انطلاق الخام وينبغي أن يكون الأمثل لمجموعة معينة من الظروف.
      2. وقف الإضاءة وتشغيله مرة أخرى بعد بضع دقائق للتحقق من نتائج القياسات حالة مستقرة
    2. برمجة تسلسل FRAP لقياس كمي، إن أمكن. رؤية الملفات الإضافية وأسطورة المقابلة للحصول على التفاصيل.
      ملاحظة: في بعض الأحيان سيارات الدفع الرباعي الانضمام إلى ساترة الزجاج، لكنه يفشل في انفجار وتشكيل طبقة ثنائية السوائل. إذا حدث هذا، وشطف القنوات مع العازلة إعادة نزع الغاز التي تحتوي على 10 ملي المغنيسيوم 2+ للمساعدة في تشكيل طبقة ثنائية معتمد. استخدام التبييض مضان لتقييم طبقة ثنائية سيولة كما في 4.2. مرة واحدة يتم تشكيل طبقة ثنائية السوائل، وشطف مع المغنيسيوم 2+ خالية ريكوعازلة nstitution.
  3. إدخال الخامس سيارات الدفع الرباعي في القنوات تدفق الموائع الدقيقة
    1. ديغا إعادة العازلة واستخدامه لتمييع الحل الأسهم الخامس سيارات الدفع الرباعي من قبل عامل من حوالي 10 مارس - 10 مايو اعتمادا على تركيز الأسهم الخامس سيارات الدفع الرباعي. تهدف لتخفيف التي ينتج عنها حوالي 10-100 الأحداث الانصهار في غضون 60 ثانية في مجال الرؤية.
      ملاحظة: العديد من اندماج زيادة مضان الخلفية (لأن كل ودائع الحدث LR-PE أو لم تسميات الدهون في SBL) وجعل الكشف وتحليل الأحداث الانصهار صعوبة. في المقابل، معدل الانصهار التي هي النتائج المتدنية جدا في الفقراء إحصاءات أو يتطلب اكتساب العديد من الأفلام. لتركيز الخامس سيارات الدفع الرباعي من 0.1 ملي الدهون، تبدأ من خلال تمييع 5 ميكرولتر الأسهم سيارات الدفع الرباعي في المخزن إعادة 995 ميكرولتر ثم تمييع 5-50 ميكرولتر من هذا في 950-995 عازلة ميكرولتر إعادة.
    2. دعونا درجة الحرارة يوازن قبل وقف تدفق وinserتينغ أنبوب مدخل إلى الحل الخامس SUV المخفف.
    3. ضبط زاوية TIRF والاستقطاب على النحو التالي.
      1. بعد وضع الاستقطاب المطلوب من خلال تناوب شعاع الإثارة، وضبط الميل للمرآة القائد الموقف من الحزم عن طريق السائر المحركات من خلال البرنامج. تحرك ببطء موقف شعاع الليزر من مركز الهدف في المستوى البؤري الخلفية إلى جانب واحد خارج المركز. مراقبة الضوء من هدف في الجانب الأمامي الخروج مع زاوية زيادة فيما يتعلق محور موضوعي كما يتم نقل الموقف أكثر خارج المركز.
      2. علما أن موقف السيارات عندما يختفي شعاع تخرج لأول مرة في الهدف، أي عندما يتحقق TIR أولا.
      3. ببطء حفاظ على تحريك الموقف شعاع مزيد من خارج المركز في حين رصد مضان من على سطح الأرض. علما أن موقف السيارات عندما يختفي مضان السطح عندما شعاع انتقلت بعيدا جدا خارج المركز.
      4. اختيار positio شعاع ن بين الحدين تحديدها أعلاه. للحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء والمزيد من تعزيز إشارة على الانصهار، واختيار عمق الاختراق الضحلة (شعاع موقف أقرب إلى حافة الهدف) الذي لا يزال يوفر إضاءة موحدة للviewfield.
        ملاحظة: من الأفضل للحفاظ على نفس الموقف TIR شعاع (نفس عمق الاختراق) لجميع التجارب بعد الأمثل الإعدادات. تأكد الدورية الاستقطاب لا تؤدي إلى تغييرات في موقف شعاع.
    4. تدفق الخامس سيارات الدفع الرباعي في قناة بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة، وهو ما يمثل متوسط ​​سرعة تدفق خطية من ~ 1.5 ملم / ثانية لشريحة من 75 ميكرون س 300 ميكرون. التبديل إلى الإعدادات الإثارة / انبعاث لمراقبة الدهون خلط (LR أو هل فقط).
  4. مراقبة الانصهار بين الخامس سيارات الدفع الرباعي واحدة وSBL

.jpg و"/>
الشكل 3. الإعداد pTIRF التجريبية. (أ) تمثيل تخطيطي من الخامس سيارات الدفع الرباعي وتي SBL على ركيزة الزجاج. كاذبة الصور الملونة TIRFM من واحد حدث الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL تبين الدهون لرسو السفن (1) والإفراج عن صبغ الدهون في سيمبول تكنولوجيز (2)، يليه تبيض وانخفاض كثافة مضان (3). يظهر كثافة مضان الإجمالية (مجموع القيم بكسل في × 5.3 ميكرون مربع 5.3 ميكرون) إشارة. وسجلت (ب) ساترة المستعبدين إلى كتلة PDMS على مرحلة ساخنة. أنبوب مدخل للقنوات ميكروفلويديك رسم عينات من أنبوب في صاحب العينة المعدنية (يمين) يستنشق عن طريق ضخ حقنة (يسار). تحت المضخة وحدة الانبعاثات المزدوجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

OAD / 54349 / 54349fig4.jpg "/>
. يتم إنشاء الشكل 4. تخطيطي من الإعداد التجريبية موجة زائل في واجهة زجاجية عازلة في قناة ميكروفلويديك. يتم تشكيل SBL على الزجاج والخامس سيارات الدفع الرباعي ويستنشق من صاحب العينة المعدنية (أعلى اليمين) من خلال القناة إلى حقنة (أعلى اليسار). M، مرآة، DM، مرآة مزدوج اللون. L، عدسة، F، فلتر، P، المستقطب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستمرار إثارة ومراقبة الخامس SUV مضان باستخدام نانومتر 561 (لLR-PE) أو 638 نانومتر (للم) ليزر اعتمادا على fluorophore تأسست في الخامس سيارات الدفع الرباعي. كما الخامس سيارات الدفع الرباعي تصل إلى قناة تدفق وقفص الاتهام على والصمامات مع سيمبول تكنولوجيز، تبدأ إشارة الخلفية مضان تتراكم.
  2. ضبط شدة الإثارة الليزر من خلال برنامج لتبييض مستمر الخلفيةمضان مثل هذا في الالتحام والانصهار جديدة الأحداث حالة مستقرة ويمكن بسهولة أن يلاحظ.
    ملاحظة: إذا تبيض بطيء جدا، وسوف مضان الخلفية تكون مرتفعة للغاية. إذا تبييض سريع جدا، وسوف إشارات من سيارات الدفع الرباعي رست ومن fluorophores تطلق في SBL تتلاشى بسرعة، وتقصير نافذة خلالها انصهار سيارات الدفع الرباعي رست يمكن الكشف أو يمكن تتبع على fluorophore. لمتحمس LR-PE في 561 نانومتر، 2،5-7،5 السلطة ميغاواط توهج 190 دائرة ميكرون قطر (100-250 NW / ميكرون 2) هي قيمة معقولة للبدء. ل638 نانومتر الإثارة من فعل، 0،8-1،6 ميجاوات على مدى 190 ميكرون دائرة قطرها (30-60 NW / ميكرون 2) يمكن استخدامها لاختبارات أولية.
  3. اكتساب العديد من الأفلام في مواقع مختلفة في قناة معينة. تحقق دبي الوطني-PE مضان للتحقق من أن SBL لم يكن لديك عيوب في هذه المواقف. الحصول على الأفلام كامل الإطار في الحد الأقصى لمعدل (~ 50 لقطة / ثانية) أو منطقة اقتصاص من الفائدة عند أعلى معدل الإطار (إلى~ 100 هرتز) لمدة 60 ثانية.
  4. الانتقال إلى قناة ميكروفلويديك آخر وتكرار التسجيلات لأمراض أخرى. وتشمل الضوابط سلبية مثل SBL أو سيارات الدفع الرباعي خالية من البروتين، إضافة المجال حشوية القابلة للذوبان في الخامس كمين VAMP2 (CDV) مثل مثبط أو علاج ضد سيارات الدفع الرباعي مع عصبي الكزاز (30 دقيقة عند 37 درجة مئوية) في واحد أو أكثر القنوات على نفس ساترة.
  1. تنظيف وإعادة تدوير PDMS
    1. من أجل إعادة كتلة PDMS، وشطف القنوات ميكروفلويديك مع ~ 200 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في معدل التدفق من 5 ميكرولتر / دقيقة. وأخيرا، ونضح الهواء عبر الأنابيب والقنوات.
    2. فصل PDMS كتلة بلطف من ساترة عن طريق الضغط عليه قليلا. وضعه على قطعة نظيفة من رقائق الألومنيوم. تخزينها في مجفف فراغ. ويمكن إعادة استخدامها عدة مرات.
    3. لتنظيف أكثر شمولا شطف القنوات مع المنظفات أو محلول هيدروكسيد الصوديوم قبل 70٪ من الإيثانول. بدلا من ذلك، إزالة جميع الأنابيب جيئة وذهابا م في PDMS ويصوتن كتلة لمدة 30 دقيقة في الأيزوبروبانول، قبل التجفيف وإدخال أنابيب جديد.

5. سيارات الدفع الرباعي SBL فيوجن الفحص لمراقبة الدهن والمحتوى الإصدار في وقت واحد

  1. لرصد اللون المزدوج من الدهون في وقت واحد ومحتويات قابلة للذوبان الإفراج عنهم، اتبع نفس الخطوات كما في الباب 4، باستثناء الجسيمات الشحمية استخدام المسمى مع كل من الدهن (لم) ومحتويات قابلة للذوبان (SRB) التسمية، كما هو موضح في القسم مغلفة 3. تعتبر الدار في 10 ملي وفي البداية عالية مروي النفس.
  2. باستخدام التكوين أظهرت تخطيطي في الشكل (4)، تثير SRB ولم مضان في وقت واحد باستخدام 561 نانومتر و 638 نانومتر ليزر، على التوالي. مرآة مزدوج اللون (640 نانومتر) انشقاقات انبعاث إلى شعاعين التي تعمل من خلال مسافة قصيرة (595/50 نانومتر) وطويل فلتر (700/75 نانومتر) الطول الموجي للكشف عن SRB ولم الانبعاثات، على التوالي. ومن المتوقع الحزم الانبعاثات اثنين جنبا إلى جنب على رقاقة EM-CCD.
jove_title "> 6. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات FRAP
    1. استخدام برنامج MATLAB المنصوص عليها في معلومات تكميلية لتقدير معامل الدهون نشرها، D. يقرأ البرنامج قائمة من الملفات OME-TIFF 49، بالكشف عن منطقة المبيض، المؤامرات القيم متوسط ​​بكسل في منطقة المبيض بوصفها وظيفة من الوقت، ويناسب منحنى الانتعاش مما أدى إلى نموذج من Soumpasis 50 لاستخراج وقت الانتعاش، figure-protocol-3 حيث ث هو نصف قطر الدائرة ابيض.
      ملاحظة: تم توفير برنامج MATLAB في وقت سابق 25 لتحليل الأفلام FRAP باستخدام ملفات نيكون ND2. يقرأ البرنامج الحالي OME-TIFF ملفات 49، وذلك لأن معظم صيغ الملفات يمكن بسهولة تحويلها إلى OME-TIFF. تحليل كمي لبيانات FRAP هو أسهل وأكثر دقة عندما تبيض غير لحظية، وbleacالمنطقة هد هي عبارة عن دائرة، وتبيض خلال قراءة من لا يكاد يذكر. على الرغم من أن هذه المعايير غير راض بدقة في القياسات FRAP بسيطة الموصوفة هنا، وهو تقدير معقول للمعامل الانتشار ويمكن الحصول على. لتقدير أكثر دقة، استخدم تتبع الأصباغ الدهن واحدة (القسم 6.3).
  2. تحليل معدل لرسو السفن، ومعدل الانصهار وأوقات تأخير لرسو السفن إلى الانصهار
    1. استخدام يماغيج لفتح فيلم لتحليل وضبط السطوع والتباين على تحديد واضح لرسو السفن الحويصلة ودمج الأحداث. بدء تشغيل البرنامج المساعد SpeckleTrackerJ 26. يرى سميث وآخرون. 26 وعلى شبكة الإنترنت ثائق SpeckleTrackerJ للحصول على الإرشادات للاستخدام.
    2. التعرف على جميع سيارات الدفع الرباعي رست مؤخرا في SpeckleTrackerJ. للتمييز بين سيارات الدفع الرباعي التي ترسو بإحكام من تلك التي ترتد من سيمبول تكنولوجيز، فرض مدة رسو السفن الحد الأدنى من عدد قليل من الإطارات. حفظ المسارات، وأكرر لجميع الأفلام.
      ملاحظة: للحصول على وثيقةمعدل ملك، كل ما يهم هو تحديد عندما رست سيارات الدفع الرباعي، وذلك فقط في الإطار الأول فيها سيارات الدفع الرباعي رست احتياجات ليتم تسجيلها في هذه المسارات. لن تؤخذ بقية المسارات بعين الاعتبار في التحليل. ومع ذلك، لصناعة السيارات في تتبع كل سيارات الدفع الرباعي حتى التبييض أو الصمامات يساعد سيارات الدفع الرباعي العلامة التي تم تتبعها بالفعل.
    3. تحديد جميع الحويصلات التفجير. لهذه، ينبغي أن يشمل جميع المسارات لقطة من الإطار الأول رست سيارات الدفع الرباعي حتى الإطار الأول الذي الانصهار هو واضح من زيادة مفاجئة في مضان من بقعة تتبعها. وتستخدم هذه المدد من هذه المسارات لحساب التأخير لرسو السفن إلى الانصهار. حفظ جميع المسارات. أكرر للجميع الأفلام.
    4. لتحليل مجموعة من البيانات لرسو السفن أو الانصهار، تجميع قائمة من الملفات مساره من الأفلام ذات الصلة، وتشغيل البرامج MATLAB تزويد Karatekin وروثمان 25. اتبع الإرشادات التي يتم توفيرها جنبا إلى جنب مع البرامج.
      ملاحظة: برامج مؤامرة نائب الرئيسulative الالتحام والانصهار الأحداث بوصفها وظيفة من الزمن، استنادا إلى المعلومات المستخرجة من الملفات مسار. وتقدر معدلات الالتحام والانصهار من سفوح هذه المؤامرات. للحصول على بيانات الانصهار، كما يحسب التأخير لرسو السفن إلى الانصهار وتآمر توزيعها باعتباره مؤامرة البقاء على قيد الحياة، أي احتمال أن الاندماج لم يحدث حتى الان من جانب تأخير تعطى بعد لرسو السفن.
  3. الدهون الانتشارية
    1. لكل حدث الانصهار، وتتبع الدهون الفلورسنت واحدة عندما تصبح ملحوظ عندما يكون لديهم تنتشر بما فيه الكفاية بعيدا عن موقع الانصهار (الشكل 6). استخدام SpeckleTrackerJ لتتبع، وحفظ المسارات لمزيد من التحليل باستخدام MATLAB. اعتمادا على حجم الحويصلة الصمامات، وعادة ما يمكن تتبع 3-30 fluorophores واحدة. لأن مسارات أطول مرغوبة لحساب figure-protocol-4 ، في محاولة لتعقب جزيئات واحدة طالماممكن، وذلك باستخدام التصحيح اليدوي للمسارات إذا لزم الأمر.
    2. حساب متوسط ​​تربيع النزوح (MSD) لاحد مسارات علامة الدهون التي تستمر> 40-50 الإطارات (حوالي ~ 1.5 ثانية). استخدام MSD لحساب معامل الدهون نشرها، figure-protocol-5 . يرى سميث وآخرون. 26 وستراتون وآخرون. 27 لمزيد من التفاصيل.
  4. واحدة الدهون صبغ كثافة، سيارات الدفع الرباعي SBL عامل تخفيض كثافة، وحجم الحويصلة
    1. قياس مجموع القيم بكسل من علامة الدهون في بكسل 3 × 3 (خ 0.8 ميكرون 0.8 ميكرون) المنطقة المحيطة علامة ل~ 15 لقطة قبل وبعد التبييض علامة في خطوة واحدة. طرح كثافة خلفية بمعدل متوسط ​​على الإطارات بعد التبييض من شدة ما قبل التبييض المتوسط ​​قبل التبييض للحصول على كثافة علامة الدهون تتبعها. تكرار قياس العديد من علامات ممكن عمليا من أجل معين فيلم.
    2. رسم توزيع شدة التسمية الدهون واحد، figure-protocol-6 ، وتناسب التمويه لتقدير متوسط.
    3. حساب تأخير بين وقت وقوع انصهار وعندما انتهى مسار علامة الدهون واحدة صدر في هذا الحدث في تبييض خطوة واحدة. الحصول على تبيض مرة لfluorophore في سيمبول تكنولوجيز، figure-protocol-7 ، من خلال التآمر على وظيفة الناجين من التأخير والمناسب لالأسي.
      ملاحظة: نظرا لأن الاستقطاب الأزواج الحقل الإثارة أكثر ضعيفة إلى fluorophores على سيارات الدفع الرباعي، وتبيض مرة من سيارات الدفع الرباعي عادة ما يكون أبطأ بكثير (27).
    4. تقدير figure-protocol-8 وعامل تخفيض كثافة لصبغ الدهون عندما تكون في سيارات الدفع الرباعي بالنسبة إلى عندما يكون في سيمبول تكنولوجيز، بعد ستراتون 27 (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> figure-protocol-9 ومن شدة صبغة واحدة في SUV).
      ملاحظة: إذا كانت تبيض يكاد يذكر، figure-protocol-10 سيكون مساويا لشدة رست figure-protocol-11 يتم إيداع (النقطة (1) في الشكل 3A، اللوحة اليمنى)، مقسوما على كثافة الإجمالية التي تم التوصل إليها بعد كل fluorophores في سيمبول تكنولوجيز على الانصهار (خط متقطع وصفت figure-protocol-12 في الشكل 3). ولكن نظرا لتبييض السريع في سيمبول تكنولوجيز، figure-protocol-13 عادة لا يتم التوصل إليها وتقدير دقيق ل figure-protocol-14 يتطلب تركيب حركية الافراج عن تعبير 27 التي مدفوع الكيجن على حد سواء figure-protocol-15 (انظر 6.4.3) و figure-protocol-16 . يتم توفير تعابير منفصلة في ستراتون وآخرون 27 للحالات حركية محدودة المسام ونشر الإصدار المحدود؛ أفضل الأحوال تناسب يختلف من حال إلى حال (انظر 6.5.1 لحالة حركية محدودة المسام).
    5. حساب مساحة الحويصلة عن الأحداث الفردية من 27 figure-protocol-17 ، أين figure-protocol-18 هي كثافة سيارات الدفع الرباعي رست، figure-protocol-19 هو يعني كثافة من صبغة الدهون واحد في سيمبول تكنولوجيز، figure-protocol-20 هو عامل تخفيض كثافة لصبغ الدهون عندما يكون في سيارات الدفع الرباعي بالنسبة إلى عندما يكون في سيمبول تكنولوجيز، وأوجه 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> هو كثافة المساحي المعروف الأصباغ الدهون.
  5. خصائص الانصهار المسام
    1. على افتراض الإفراج غير محدودة المسام، وتناسب حركية الإفراج عن العلامة الدهون إلى 27 figure-protocol-21 ، أين figure-protocol-22 هي كثافة سيارات الدفع الرباعي رست قبل الانصهار وكما هو معرف معلمات أخرى في وقت سابق. استخدام قيمة figure-protocol-23 تم الحصول عليها في 6.4.3 كمعلمة ثابتة، واستخراج أفضل تناسب تقديرات ل figure-protocol-24 و figure-protocol-25 .
    2. تقدير جزء من الوقت المسام مفتوحة، ف 0، ومن المقرر أن المسام الخفقان 27 افتراض التخلف الإفراج الدهون:60. figure-protocol-26 = figure-protocol-27 حيث A فيس هي المنطقة الحويصلة (القسم 6.4.5)، (ب) هو ارتفاع المسام (عادة المتخذة ليكون ~ 15 نانومتر)، ص ص ≈ 3 نانومتر هو نصف قطر المسام فعالة كما يراها التسميات الدهون نشرها ويتضمن نصف سمك طبقة ثنائية (~ 2 نانومتر)، figure-protocol-28 هو انتشارية الدهون (محسوبة في 6.3)، و figure-protocol-29 هو الوقت المناسب لنسبة الدهون في أن يصدر من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز (من 6.5.1).
    3. لتأكيد أن الاسمية ف 0> 1 إلى المسام مفتوحة بالكامل، ف 0 = 1، تناسب دوام كثافة إلى المعادلة 4 من ستراتون وآخرون. 27، حركية وتوقع لالمسام مفتوحة بشكل دائم. وينبغي أن يكون هذا مناسبا أفضل من fittinز التعبير في 6.5.1 لالمسام مفتوحة بشكل دائم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الجودة SBL

ومن الأهمية بمكان للتحقق من جودة وسيولة من سيمبول تكنولوجيز قبل التجربة الانصهار. يجب أن يكون مضان في الجانب السفلي، والزجاج من قناة ميكروفلويديك موحد، من دون أي عيوب واضحة. إذا مرت فقاعة الهواء على الرغم من أن قناة، فإنه عادة ما يترك ندوبا واضحة على SBL. إذا كان هناك مثل هذه الندوب الكبيرة الحجم / العيوب، لا تستخد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التنفيذ الناجح لفحص الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL الموصوفة هنا يعتمد بشكل كبير على عدة خطوات رئيسية، مثل إعادة الوظيفية للبروتينات إلى الجسيمات الشحمية، الحصول على SBLs ذات نوعية جيدة، واختيار المعلمات التصوير الصحيحة للكشف عن جزيئات واحدة. على الرغم من أنه قد يستغرق بعض الوقت والجهد للنجاح، مرة واحدة ويتم تنفيذ الفحص بنجاح، فإنه يوفر ثروة من المعلومات حول عملية الانصهار غير متوفرة من أي في المختبر الانصهار الفحص الأخرى التي نوقشت في مقدمة. المعدلات التي ترسو سيارات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر فلاديمير بولييف (Yale West Campus Imaging Core) على تصميم وبناء مجهر TIRF المستقطب ، وديفيد باديلي (جامعة ييل) للمساعدة في أجهزة الكشف بلونين ، وجيمس إي روثمان (جامعة ييل) وبن أوشونيسي (جامعة كولومبيا) وأعضاء مجموعاتهم لتحفيز المناقشات. يتم دعم EK من قبل جائزة Kavli Neuroscience Scholar من مؤسسة Kavli ومنحة المعاهد الوطنية للصحة 1R01GM108954.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> الكواشف < / strong>
Milli-Q (MQ) ماءMillipore
KOHJ.T. بيكر3040-05
الإيثانول 190 برهان ديكون
الأيزوبروبانولفيشر الكيميائيةA416P4
هيبسأمريكي BioAB00892
كوليد الصوديوم (KCl)AmericanBioAB01915
DithiothreitolAmericanBioAB00490
N< / em>-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'< / em>-[2-حمض الإيثانسلفونيك] (HEPES)AmericanBioAB00892
EGTAAcros Organics409911000
Buffers
المخزن المؤقت HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.4)25 ملي متر HEPES-KOH, 140  mM KCl, 100  مو م EGTA, 1  mM DTT
Solvents< / strong>
Chloroform جي تي بيكر9180-01في زجاجة زجاجية ، تحذير ، ارتد معدات الوقاية الشخصية
الميثانولجي تي بيكر9070-03في زجاجة زجاجية ، تحذير ، ارتد معدات الوقاية الشخصية
مضغوط لحام بحقنة هاميلتونفار.أحجام الزجاج فقط مع الأنابيب الزجاجية مع الميثانون (الكلوروفورم / الميثانون ، 2: 1 ، الخامس / الحجم)
أنابيب زجاجية بيركس فيستا 11 مل ، غطاء لولبي 16 × 100 مم أنبوب الثقافةPyrex   ؛70825-16نظيف جيدا ، اشطفه بالكلوروفورم
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn< em>-glycero-3-phosphocholine، 16:0-18: 1 PC (POPC)Avanti Polar Lipids850457تأتي الدهون المذابة في CHCl3< / sub> أو كمسحوق مجفف في قوارير محكمة الغلق. Aliquot عند الافتتاح. قم بتخزين المزيد كأغشية دهنية مجففة تحت جو خامل عند -20 درجة مئوية احتفظ بالمخزون في CHCl 3 < / sub > / MeOH (2: 1 ، v / v) عند -20 درجة مئوية ، دعنا نأتي إلى RT قبل فتح
1،2-dioleoyl-sn< / em>-glycero-3-phospho-L-serine (ملح الصوديوم) ، 18: 1 PS (DOPS)Avanti Polar Lipids840035نفس النحو الوارد أعلاه.
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine ، 18: 0-20: 4 PE (SAPE) AvantiPolar Lipids850804كما هو مذكور أعلاه.
L- & alpha ؛ فوسفاتيديلينوسيتول -4،5-ثنائي الفوسفات (الدماغ ، الخنازير) (ملح الأمونيوم) ، الدماغ PI (4،5) P2< / sub>Avanti Polar Lipids840046كما هو مذكور أعلاه.
1،2-dioleoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine-N< / em>- (7-nitro-2-1،3-benzoxadiazol-4-yl) (ملح الأمونيوم) ، 18: 1 NBD PEAvanti Polar Lipids810145كما هو مذكور أعلاه.
1،2-ديولويل-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine-N< / em>-[ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم) ، 18: 1 PEG2000 PEAvanti Polar Lipids880130كما هو مذكور أعلاه.
الكوليسترول (صوف الأغنام ، >98٪)Avanti Polar Lipids700000كما هو مذكور أعلاه.
زيت DiD. زيت DiIC18 (5) (1،1'-Dioctadecyl-3،3،3 '، 3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)المجسات الجزيئيةD-307
Rotavapor R-210BuchiR-210حمام حراري فوق Tm من الدهون المستخدمة
OG n-Octyl-&beta ;-D-GlucopyranosideAffymetrix0311مخزن عند -20 درجة ؛ C ، دعنا نأتي إلى RT قبل فتح
شاكر - Eppendorf Thermomixer REppendorf
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes ، 20k MWCO ، 3 & nbsp ؛ MLLife Technologies66003
Bio-Beads SM-2 AdsorbentsBio-Rad1523920
OptiPrep   تدرج الكثافة متوسطSigma-AldrichD1556
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، Thinwall ، فائق الوضوح ، 13.2 & nbsp ؛ مل ، 14 × 89 ممبيكمان كولتر41121703
بيكمان SW41 Ti الدوار
SuflorhodamineBالمجسات الجزيئيةS-1307
Econo-Column   ؛ أعمدة الكروماتوغرافيا ، 2.5 & مرات ؛ 10 سمBio-Rad7372512
Sepharose CL-4BGE Healthcare17-0150-01
SYPRO Orange Protein Gel StainMolecular ProjectsS-66505,000x Concentrate in DMSO
PDMS block< / strong>
Sylgard 184 مجموعة المطاط الصناعي السيليكون ، PDMSDow Corning3097358-1004
طبق بتري زجاجي من بيركس ، 150 × 20 مم ، مكتمل بغطاءCorning3160-152
Hole puncher - لكمة خزعة قابلة لإعادة الاستخدام ، 0.75   ؛ ممالدقةالعالمية 504529
آلة التثقيب اليدوية  SYNEOMHPM-UNV
مثقاب .035 × .026 × 1.5 304 SS TiN المغلفة لكمة مستديرةSYNEOCR0350265N20R4قطر الحفر: 0.9 مم ، حجم تجويف الثقب: 0.74 مم
أنابيب Tygon Microbore ، معرف 0.25 مم ، 0.76 مم ODCole-Parmer06419-000.010 "ID, 0.030"
OD أنابيب سيليكون (معرف 0.51 مم ، 2.1 مم ODCole-Parmer95802-000.020 "ID, 0.083" OD
<قوي>غطاء زجاجي - تنظيف غرف الأبحاث < / قوي>
Schott Nexterion غطاء زلة الزجاج DSchott1472305
منظف البلازماHarrickPDC-32G
pTIRF الإعداد والملحقات< / قوي>
IX81 جسم المجهرأوليمبوسIX81
EM CCDكاميرا Andorixon-ultra-897
لوحة حرارية ، مرحلة المجهر الساخنTokai HitMATS-U52RA26
مل محاقن زجاجية هاميلتون (4x)هاميلتون81365
د.ك علميةKDS-230
< td colspan = "4" ><قوي>تحضير الجسيمات الشحمية < / قوي > تستخدم أدوات 1 مضخة حقنة

المراجع

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287(2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006(2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109(2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طبقة ثنائية مدعومةانتقال صبغة الدهونأحداث اندماج الحويصلاتاستعادة الفلورةاستثارة مستقطبةتحرر الحمولة الذائبةديناميكيات مسام الاندماج
فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.